[학습주제 1] 천연물제품 원료의 분리정제, 규격화
1) 분획 (fraction) : 전체 추출물 중 유효성분을 포함하는 한 부분을 의미하며, 여러 개의 물질이 섞여있는 상태
2) 분획법 : 용매분획법(Solvent partition), 크로마토그래피를 이용한 분획법
- 용매분획법(Solvent partition)은 서로 섞이지 않는 용매 사이의 분배를 이용한 방 법으로 가장 대표적인 예는 물과 hexane, 물과 ethyl acetate, 물과 butanol로 이 루어지는 분획법이다. 두 가지 용매의 선택은 용매의 성질을 활용하여 서로 섞이지 않는 용매를 선택하여 실시한다.
- 크로마토그래피를 이용한 분획법은 추출물을 크로마토그래피의 원리를 이용하여 분획을 얻는 방법이다.
분획 (fraction)을 제조하는 이유
-천연물을 추출하면 많은 성분이 존재
à 모든 성분이 약효를 나타내는 유효성분은 아님 à 약효를 나타내는 부분만 제조할 필요가 있음
à 약효를 나타내지 않는 부분은 제거할 필요가 있음
[학습주제 1] 천연물제품 원료의 분리정제, 규격화
1) 분획 (fraction) : 전체 추출물 중 유효성분을 포함하는 한 부분을 의미하며, 여러 개의 물질이 섞여있는 상태
2) 분획법 : 용매분획법(Solvent partition), 크로마토그래피를 이용한 분획법
PHARMACOGNOSY, Year : 2011 | Volume : 3 | Issue : 3 | Page : 226-231
1) 구입한 **를 1kg에 메탄올 10리터를 가하 고 12시간 reflux 하여 추출하였다.
2) 부흐너 깔대기(Buchner funnel)에 가제 (gauze) 5겹을 깔고 여과하여 얻은 여액을 감 압 농축하여 메탄올이 제거된 농축 엑스 112g 을 얻었다.
3) 상기 1), 2) 과정을 3회 반복하여 얻어진 메 탄올 용액을 감압 농축하여 메탄올이 제거된 농축 엑스 220g을 얻었다.
3) 농축 엑스 112g에 n-hexane을 800ml을 가하고 진탕하여 n-hexane층을 분리한 다음, 여액을 감압 농축하여 n-hexane이 제거된 농 축 엑스 11g을 얻었다.
⓵ 크로마토그래피 종류 (P9~10)
-Thin layer chromatography (TLC) -Column chromatography
-Gas chromatography
-High performance liquid chromatography (HPLC)
-Thin layer chromatography (TLC)
TLC에서는 유리판이나 플라스틱판과 같은 받침판에 흡착제를 사용하 는데 주로 실리카겔(SiO2․xH2O)이나 알루미나(Al2O3․xH2O), 셀룰로 오스 분말과 같은 고체흡착제의 얇은 층 (약 250㎛)을 입혀서 쓰며, 층의 두께는 목적에 따라 여러 가지로 만들어 쓴다.
TLC법은 종이 크로마토그래피에 비해 시간이 훨씬 절약될 뿐 아니라, 전개가 효과적으로 이루어지며, 지지체는 거름종이와는 달리 열이나 센 무기산에 잘 견딜 만큼 매우 안정하다.
분리 또는 정제하고자 하는 물질의 용액을 모세관에 묻혀서 TLC판의 한 쪽 끝 가까이에 반점(spot)을 만든다. 이 판을 전개용매가 들어 있 는 용기(=전개통)에 담그는데, 용매의 액면이 반점 바로 아래쪽에 오 도록 한다. 용매는 모세관 작용에 의해서 판을 따라 위로 이동한다
-Thin layer chromatography (TLC)
TLC employs a small glass or plastic plate covered by a thin layer of a solid — usually silica (SiO2) or alumina (Al2O3) as a stationary phase. The mobile phase is an organic solvent or solvent mixture. The solvent moves from a reservoir up the plate by capillary action, carrying the sample mixture along with it. Each compound in the mixture moves at a different rate, depending on its solubility in the mobile phase and the strength of its absorption to the stationary phase.
When the solvent gets near the top of the plate, the plate is removed from the reservoir and the solvent is allowed to evaporate, leaving behind the components of the mixture at various distances from the point of origin.
The ratio between the distance that a compound moves to the distance that the solvent front moves is the Rf value (retention factor).This value is characteristic of the compound, the solvent, and the stationary phase.
-Thin layer chromatography (TLC)
Rf value (retention factor) 란 무엇인가?
-Rf값은 물질의 고유한 값이므로 Rf값이 같으면 같은 물질이다.
(고정상, 이동상 등 동일 조건)
-Column chromatography
관 크로마토그래피(Column Chromatography)는 고정상의 용기가 관모양인 크로마토크 래피 기법이다. 관을 가득 채우고 있는 고정상으로는 코팅되어 있는 고체 입자나 액체가 사용된다. 고정상으로 가득 채워져 있는 관의 윗 부분에 혼합물을 넣고, 아래 부분을 뚫어 놓아 물질이 용출되게 한다(열린 관 크로마토그래피의 경우). 물질이 단위 시간당 관을 이 동하는 정도를 계산하여 각 물질을 분리하게 된다.
일반적인 chromatography 고정상으로 사용되는 대표적인 Silicagel 구조
고정상으로 silicagel을 사용하고 A, 1 2가지 화합물 중 이동이 빠른 화합물은 무엇이고, 이유를 설명하시오.
단, 이동상은 같다
Hydrogen bonding(수소결합)
HPLC 고정상으로 사용되는 C8, C18 구조
고정상으로 C18을 사용하고 A, 1의 2가지 화합물 중 이동이 빠른 화합물은 무엇이고, 이유를 설명하시오.
단, 이동상은 같다
C18
그림 . 건강기능식품 개발자를 위한 기능성 원료 표준화 지침서 (식품의약품안전처)
분획법 요약
용매분획법의 방법
1) 유사 극성 (polarity)을 가지는 화합물 군으로 분획 2) 비극성으로부터 극성 순서
3) 지용성이 높은 화합물, 수용성이 높은 화합물 4) 서로 섞이지 않는 두 용매 (immiscible)를 사용
5) 어떤 물질을 한 상 (phase)에서 다른 상으로 옮기는 것이며 가장 보편적인 경 우는 수용액에서 유기용매로의 추출이다.
6) 용액 속에 고체가 현탁되어 있는 경우 여과하여 분리한다 7) 용액에 대하여 녹는 물질과 녹지 않는 물질로 나눈다
8) 물에 녹는 물질은 용매의 극성에 따라 분배한다
Separating funnel을 이용한 분획제조 사례
2. 천연물의 분리, 정제 방법
활성물질의 분리, 정제 방법은 분리를 원하는 활성물질의 물리화학적 성질에 따라 달라져야 하며 여러 가지 서로 다른 원리에 근거한 분리, 정제방법 중에서 적절한 방법을 효과적으로 조합하여야 한다. 일반적으로 동일한 원리에 근거한 방법으로는 성공적으로 활성물질을 분리 , 정제하기 어렵다. 왜냐하면 동일한 원리에 근거한 분리, 정제 방법은 여러 번 반복하여 사용 하더라도 물질의 분리도는 어느 정도 높일 수 있으나 완전한 분리는 어렵기 때문이다.
또한 천연물로부터 생리활성물질 탐색 연구분야의 물질 분리, 정제 방법은 유기화학분야에서 행하는 방법과는 상당한 차이가 있다. 즉 유기화학 등의 분야에서는 이미 예상하고 있는 구조 를 가진 화합물을 몇 가지 다른 화합물과 섞여 있는 혼합물 중에서 분리하는 것이고, 천연물 연구분야에 있어서는 어떤 골격구조를 지닌 화합물, 즉 특정 그룹의 화합물을 추적해 나가는 것이 일반적이다.
생리활성물질의 탐색 연구분야에서는 목적으로 하는 생리활성 물질 이외에 화학적으로는 전혀 모르는 수 백종의 화합물을 포함하는 미생물 대사산물 가운데서 생리활성을 지표로 하 여 찾아 나가야 한다. 따라서 목표로 하는 화합물의 물리화학적 특성과 생물활성을 나타내 는 분획(fraction)과의 빠르고 간단한 연결방법이 중요하다.
따라서 구조해석, 전임상실험 등에 사용할 시료 확보를 위한 본격적인 물질 분리, 정제를 행 하기 이전인 활성물질 탐색의 초기 단계에서 목적으로 하는 활성물질의 신규성 또는 유용성 을 미리 확인할 필요가 있다. 이를 위해서는 먼저 천연물 추출물로부터 각종 생리활성을 검 정한 후에 일반적으로 몇가지 유기용매에 대한 이행성, 활성탄 및 이온 교환수지에 대한 흡 탈착성, pH와 열에 대한 안정성 등의 예비실험을 행한다. 또한 대부분의 경우 이 단계에서 활성물질의 물리화학적 특성이 완전히 밝혀지기는 어렵지만 예비 추출시험에 근거하여 어 느 정도 물리화학적 성질을 추정하고 이를 고려하여 소량의 활성물질을 분리한 후 신규물질 또는 기지물질 여부를 판단하게 된다.
이들을 효과적으로 screening 하기 위하여 종래부터 paper chromatography, UV spectrum 또는 각종 정색반응 등 여러 가지 방법이 널리 이용되어 왔으나 특히 TLC(Thin Layer Chromatography) 방법이 screening의 초기 단계에는 유력한 수단이 된다. 이 방 법에 의하면 신속성, 고도의 분리능 등으로 인하여 활성물질의 분리, 정제 및 동정에 필요 한 양을 간단히 얻을 수 있기 때문이다.
활성물질을 분리 정제할 때는 정해진 방법이 확립될 수 없기에 풍부한 경험과 이론이 요 구된다. 신속하고 효과적인 분리정제를 위해서 여러 종류의 활성물질, 용매들의 성질과 이들과의 상호관계를 알기 위해서 유기화학적 지식, 크로마토그래피 이론과 정제된 물질 의 구조규명을 위해 NMR(nuclear magnetic resonance, 핵자기공명분광기), MS(Mass spectrometry, 질량분석기), IR(Infrared Spectrophotometer, 적외부스펙트럼측정법), UV(Uv Spectrophotometer, 자외분광광도계) 등을 이용한 기기분석 관련 지식을 기본적 으로 습득해야 한다.
