Anti-oxidant and Anti-microbial Activities of Herb-combined Remedies used in Traditional Korean Medicine for Treating Breast Cancer
Eun-Ok Choi1,2, Da Hee Son3, Min Young Kim1,4, Hyun Hwang-Bo1,5, Hong Jae Kim1,6, Jin-Woo Jeong1, Su Hyun Hong3, Cheol Park7 and Yung Hyun Choi1,3*
1Anti-Aging Research Center, Dongeui University, Busan 614-714, Korea
2Department of Food and Nutrition, College of Human Ecology, Pusan National University, Busan 609-735, Korea
3Department of Biochemistry, Dongeui University College of Korean Medicine, Busan 614-052, Korea
4Department of Biological Sciences, College of Natural Sciences, Pusan National University, Busan 609-735, Korea
5Department of Molecular Biology, College of Natural Sciences, Pusan National University, Busan 609-735, Korea
6Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Pusan National University, Busan 609-735, Korea
7Department of Molecular Biology, College of Natural Sciences and Human Ecology, Dongeui University, Busan 614-714, Korea Received April 18, 2016 /Revised June 20, 2016 /Accepted June 22, 2016
Sipyukmiryuki-eum (SYMYKE), Danjacheongpi-tang (DJCPT), Jipae-san Ⅰ (JPS Ⅰ), Jipae-san Ⅱ (JPS
Ⅱ), and Chungganhaeul-tang (CGHUT) are representative herb-combined remedies used in traditional Korean medicine for treating breast cancer patients, as mentioned in "Dongeuibogam." In this study, we investigated the total phenolic contents (TPCs) and the anti-oxidant and anti-microbial activities of hot water and 70% ethanol extracts of these herbal prescriptions. Among the five herb-combined remedies, the extraction yields of the hot water extracts and 70% ethanol extracts were the highest in JPS Ⅱ (34.30%) and DJCPT (30.50%), respectively. The TPCs of the hot water extracts from the herb medicines were rich in the order of JPS Ⅰ < CGHUT < JPS Ⅱ < SYMYKE < DJCPT. In addition, the 70% ethanol extracts from the herb medicines were rich in the order of JPS Ⅱ < JPS Ⅰ < CGHUT
< SYMYKE < DJCPT. Among them, DJCPT and SYMYKE displayed a strong anti-oxidant capability, which was determined using ferric-reducing anti-oxidant power and scavenging of 2,2'-diphenyl-1-pic- rylhydrazyl and 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) cationic radical activity assays. In ad- dition, anti-microbial activities against Staphylococcus aureus and Escherichia coli were stronger in the 70% ethanol extracts than in the hot water extracts. Together, these findings reveal a positive relation- ship between TPCs and their anti-oxidant activities.
Key words : Antimicrobial activity, antioxidant activity, total phenolic contents, traditional herb-combined remedies
*Corresponding author
*Tel : +82-51-850-7413, Fax : +82-51-853-4036
*E-mail : [email protected]
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Journal of Life Science 2016 Vol. 26. No. 6. 680~688 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/JLS.2016.26.6.680
서 론
활성산소종(reactive oxygen species: ROS)은 생체 내에서 에너지를 생산하는 산화과정 에 생성되는 물질로, 생체 내 존 재하는 항산화방어계로 인해 대부분 소멸된다[26, 35]. 하지만 과도하게 발생된 ROS는 산화적 스트레스를 유발하여 유전자 돌연변이 유발과, 체내 세포와 조직에 비가역적인 손상 및 각 종 암의 발생뿐 만 아니라 치매와 같은 퇴행성 신경 질환의 주요한 원인이 되고[3, 16, 22], 면역 질환[19, 38], 당뇨병[31]
및 노화[17] 등과 같은 다양한 병리적인 상황을 초래하게 된다.
최근 전세계적으로 널리 사용되어 왔던 전통 약재를 기반으 로 새로운 항산화 후보물질을 탐색하여 생체방어, 노화억제, 암을 비롯한 여러 질병 예방 및 치료에 이용하려는 생리활성 에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 우리나라에서 전통적 으로 사용되어 왔던 한약재는 합성 약품에 대한 부작용 우려, 한약재 가공 기술의 발달 등으로 수요가 꾸준히 증가되고 있 으며, 통증완화[8], 해독[32], 해열[1], 방부[6], 항염증[40] 등과 같은 효능이 있어 질병치료와 예방의 목적으로 빈번하게 활용 되고 있다. 아울러 그 동안 동의보감(東醫寶鑑, Dong-eui-bo- gam)에 기록된 다양한 처방들의 항산화능에 대한 연구가 이 루어져 왔으나, 그들의 활용도 측면에 근거한 항산화 효능의 비교는 여전히 미약한 실정이다.
특히 전통적으로 유암(乳癌) 치료에 사용되어 온 대표적인 처방들 중 지패산과 청간해울탕의 항염증과 항암효과에 대한 보고는 있었지만[15, 24, 37], 각각의 처방을 비교한 결과는 없 었고, 지패산의 항산화·항균활성[2, 29]과 십육미류기음의 항 산화·항균 활성[23] 외에는 항산화와 항균활성에 대한 연구가
Table 1. The composition of five traditional herb-combined remedies used in this study
Samples Composition (relative amounts)
Sipyukmiryuki-eum
Panax ginseng C. A. Meyer (4), Angelica gigas Nakai (4), Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge (4), Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC (1.2), Ledebouriella seseloides (Hoffm.) Wolff (2), Inula helenium L.
(2), Poncirus trifoliata Rafin (2), Cnidium officinale Makino (2), Cinnamomum cassia Presl (2), Paeonia japonica (Makino) Miyabe & Takeda (2), Areca catechu Linné (Palmae) (2), Angelicae dahuricae Radix (2), Machilus thunbergii Siebold & Zucc. (2), Perilla frutescens (L.) Britton (6), Lindera strichnifolia Fernandez-Villar (2), Glycyrrhiza uralensis Fisch (2), Citrus unshiu Markovich (4)
Danjacheongpi-tang C. unshiu Markovich
Jipae-san Ⅰ A. dahuricae Radix (1), Fritillaria ussuriensis Max (1)
Jipae-san Ⅱ A. dahuricae Radix (1), F. ussuriensis Max (1), C. officinale Makino (1), A. gigas Nakai (1), Cimicifuga heracleifolia Kom (1), Bupleurum falcatum L. (1)
Chungganhaeul-tang
A. gigas Nakai (1), P. japonica (Makino) Miyabe & Takeda (2.8), P. ginseng C. A. Meyer (2), B. falcatum L. (2), C. unshiu Markovich (2), C. officinale Makino (2), G. uralensis Fisch (2), Atractylodes japonica Koidzumi (4), Fritillaria ussuriensis Maxim. (2.8), Poria cocos (2.8), Rehmannia gluthnosa (2.8), Gardenia jasminoides Ellis(2.8), Paeomia suffruticosa Sims (2)
전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 동의보감에 기록된 유암 치료를 위하여 사용되어 온 5가지 처방[십육미류기음(十 六味流氣飮, Sipyukmiyuki-eum, SYMYKE), 단자청피탕(單煮 靑皮湯, Danjacheongpi-tang, DJCPT), 지패산 Ⅰ(芷貝散Ⅰ, Jipae-san Ⅰ, JPS Ⅰ), 지패산 Ⅱ(芷貝散Ⅱ, Jipae-san Ⅱ, JPS
Ⅱ), 청간해울탕(淸肝解鬱湯, Chungganhaeul-tang, CGHUT)]
을 선정하여[14] 열수 및 에탄올로 추출하여 이들의 항산화 효과 및 항균 효과에 대한 생리활성 정도를 비교 조사하였다.
이러한 연구를 수행하고자 하는 목적은 오랫동안 전통의학에 서 사용되어온 한약복합처방전의 항산화 및 항균 생리활성을 재평가하고 다양한 질환으로의 적응 가능성을 탐색함이다. 이 를 위하여 이들 5가지의 처방에 대한 총 페놀 함량(total phe- nolic contents, TPC), ferric reducing antioxidant power (FRAP) 활성능, 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2'-azino- bis(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonate) cationic (ABTS․+) radical 소거능 및 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 산화 손상에 의한 genomic DNA (gDNA)의 손상 억제능 등과 같은 다양한 항산화 효능 실험을 통하여 이들의 항산화능을 평가하 였으며, Staphylococcus aureus (포도상구균)와 Escherichia coli (대장균)에 대한 항균효과를 비교하였다.
재료 및 방법
시료 및 추출수율
5가지의 처방에 사용된 한약재는 ㈜서경한방약업사(Busan, Korea)에서 각 처방구성의 파쇄된 형태로 구입하였으며 이들 의 구성 한약재는 Table 1에 나타내었다. 열수 추출물을 얻기 위하여 약재 무게의 10배에 해당하는 증류수로 100℃에서 3시 간 동안 추출하였다. 이후 열수 추출액을 여과지(Whatman No. 3 filter paper, Whatman International Ltd., Maidstone,
England)로 거른 후 동결건조기를 사용하여 분말로 만들어 멸 균 증류수에 100 mg/ml의 농도로 녹이고, Minisart® Syringe filter (0.2 μm, Sartorius AG, Weender Landstr. Germany)로 거른 후 사용 전까지는 -20℃에서 보관하였다. 70% 에탄올 추 출물은 각각의 한약재 60 g에 2 l의 70% 에탄올을 가하여 초음 파추출(ultrasonification extraction)로 추출물을 제조하였다.
이를 위해 추출 용기에 한약재와 70% 에탄올을 혼합한 후 초 음파 수조(Power Sonic 405, SJ BioLab., Anyang, Korea) 바닥 에 닿지 않도록 하여 40 KHz 초음파를 가하여 2시간 동안 추출 하였다. 각각의 추출물은 여과지로 여과한 후 용매를 Rotary evaporator (Eyela, A-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하고, 각 농축물은 동결 건조하여 분말 화시켰다. 이를 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma- Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 100 mg/ml로 stock solution을 만들어 실험에 따라 적절하게 희석하여 사용 하였다. 각 추출물들의 수율(Table 2)은 추출액을 동결건조 시 켜서 건물 중량을 구한 다음 추출액 조제에 사용한 원료 건물 량에 대한 백분율로 나타내었다.
총 페놀 함량
각 처방 추출물들에 함유된 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법[39]에 준하여 측정하였으며, gallic acid (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 표준물질로 사용하였다. 이를 위하여 적정 실험 농도로 희석한 시료 50 μl에 2%의 Na2CO3 1 ml를 첨가하 고 2분간 실온에 방치한 후 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich Chemical Co.) 50 μl를 가하고 실온에서 30분 간 반응시킨 다음 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 이 용하여 검량선을 작성하였으며, 총 페놀 함량은 mg gallic acid
Table 2. Extraction yields of hot water and 70% ethanol extracts of SYMRKE, DJCPT, JPS Ⅰ, JPS Ⅱ and CGHUT
Samples Water extract 70% ethanol extract Yield (%)
SYMRKE1) DJCPT2) JPS Ⅰ3) JPS Ⅱ4) CGHUT5)
27.67 25.36 27.15 34.30 25.12
29.90 30.50 27.53 16.90 25.43
1)Sipyukmiyuki-eum; 2)Danjacheongpi-tang; 3)Jipae-san Ⅰ; 4)Jipae- san Ⅱ; 5)Chungganhaeul-tang.
equivalents (GAE)/g of sample dry weight (DW)으로 나타내 었다.
FRAP 활성 측정
이 방법은 산성 pH 영역에서 ferric tripyridyltrizaine (Fe3+- TPTZ) 복합체가 환원성 물질에 의해 청색의 ferrous tripyr- idytriazine (Fe2+-TPTZ)으로 환원되어 593 nm에서 흡광도가 증가 하는 원리[4]를 이용한 것으로 대부분의 항산화제가 환원 력을 가지고 있다는 점에 착안하여 고안된 실험방법이다.
FRAP에 의한 한약재 추출물들의 항산화력을 측정하기 위하 여 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 및 20 mM FeCl3·6H2O를 각각 10:1:1 (v/v/v) 의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다. 이어서 한약재 추출물 적정 농도로 희석된 시료액 10 μl와 240 μl의 FRAP 시약을 혼합하고 37℃에서 5분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 양성 대조군(positive control)은 trolox (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 검량선을 작성하 였으며, 결과는 mg trolox/g of sample dry weight (DW)로 나타내었다.
DPPH radical 소거능
DPPH radical에 전자를 공여함으로써 radical을 소거하는 효과를 측정하는 방법인 DPPH radical 소거능은 Guo 등[13]
의 방법에 준하여 조사하였다. 이를 위하여 0.4 mM의 DPPH (Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액 150 μl에 처방 추출물이 적정 농도로 희석된 시료 100 μl을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader로 518 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 그리고 반응물에 대한 흡광도 값을 대조군에 대한 처방 추출물 시료의 DPPH radical 소거 활성으로 항산화 활성도를 나타내었으며, trolox를 양성대조군으로 비교하였으며, 음성 대조군으로는 0.4 mM DPPH 용액 대신 메탄올을 이용한 아래 식에 준하여 산출하였다.
DPPH radical scavenging activity (%) = 100－
[(OD of sample/ OD of control) ×100]
ABTS radical cation 소거능
Potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS 유리 radical이 제거되어 radical 특유의 색인 청록색으로 탈색되는 것을 이용한 ABTS radical cation 소거능을 이용한 처방 추출 물들의 항산화능 측정은 Re 등[30]의 방법에 준하여 조사하였 다. 즉 7 mM의 ABTS (Sigma-Aldrich Chemical Co.)와 2.45 mM potassium persulfate를 1:1로 혼합하여 실온, 암하에서 24시간 동안 방치하여 radical을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 734 nm에서 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 phos- phate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 희석하였다. ABTS radi- cal cation solution 190 μl에 실험 농도로 희석한 시료 10 μl를 가하여 실온에서 6분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정 하였으며 trolox를 양성 대조군으로 하여 다음 식에 준하여 항산화 효능을 비교하였다.
ABTS radical scavenging activity (%) = 100－
[(OD of sample/ OD of control) ×100]
gDNA 분리
gDNA 분리는 AquaPure Genomic DNA isolation Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 C6 신경교종 세포로부터 추출하였다. 이를 위하여 C6 세포를 100 mm dish에 1×105 cells/ml로 세포를 분주하여 37℃, 5% CO2
incubator에서 24시간 배양 후 세포를 모으고, gDNA lysis 용 매를 이용하여 세포를 용해한 후 protein precipitation 용매 100 μl를 첨가하였다. 그 후 반응액을 20초 동안 빠르게 vortex 한 후 15,000× g에서 3분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 새로운 튜브에 모으고 100% isopropanol 300 μl을 첨가하였다. 혼합물은 1분 동안 15,000× g에서 원심분리하고 상층액을 제거한 후 건조시켰다. 완전히 건조 후 70% ethanol 300 μl를 첨가하여 DNA pellet을 세척하고, 다시 15,000× g 에서 1분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 15분 동안 튜브 를 완전히 건조시켰다. DNA pellet은 DNA hydration 용액에 용해시키고 5분~1시간 동안 65℃에서 반응시킨 후, DNA 순 도를 spectrophotometer (DU730, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용한 260/280 nm에서 측정하였다. 그 후 분리 된 DNA는 1.5% agarose gel 전기영동으로 분리하였다.
Radical에 의한 DNA 손상 측정
H2O2에 의한 DNA 산화는 Milne 등[28]의 방법에 준하였으 며, DNA 산화적 손상의 유발 및 후보 추출물의 보호 효과를 조사하기 위하여 적정 농도 후보 추출물의 존재 또는 없는 조건에서 FeSO4와 H2O2의 최종 농도가 각각 200 μM과 2 mM 이 되게 하여 같은 양을 첨가하였다. 그 후 gDNA 반응액은 물과 10 mM의 ethylenediaminetetra acetic acid (EDAT, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 4 μl를 혼합하여 최종부피가 40 μl가 되게 각 반응액의 부피를 설정하였다. 각 반응액의 부피
Table 3. The microorganisms and culture condition
Microorganisms # KCTC Gram strain Medium Condition of incubation Cultivation date
S. aureas E. coli
1916 1039
+ -
LB agar LB agar
Aerobic Aerobic
2 day 1 day 설정 후 gDNA, 추출물 시료, FeSO4, H2O2와 물을 혼합하여
실온에서 30분간 반응시켰다. 그 후 산화 반응을 정지시키기 위하여 10 mM EDAT 4 μl를 첨가하고, 1.5% agarose gel에 100 V로 전기영동하였다. 30분 후 gel을 ethidium bromide (EtBr, Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 염색하고 AlphaEase®
gel image analysis software (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)을 이용하여 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상의 회복 정도를 관찰하였다.
항균활성
항균활성을 평가하기 위해 사용된 S. aureus와 E. coli는 한국 생명공학연구원(Korea Research Institute Bioscience and Biotechnology, Daejeon, Korea) 생물자원센터 유전자은행에 서 구입하였으며, Table 3에 제시한 조건에서 배양하였다. 한 약재 추출물들의 항균활성은 paper disc agar diffusion법을 이용하였으며[10], 사용한 공시균의 활성화 배지 및 검색용 평 판배지는 luria-bertani (LB) agar를 사용하였다. 시험용 균액 은 공시균들을 각 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 이상 배 양하고 2회 이상 계대 배양하여 활성화시킨 후 각 공시균들을 평판배지에 100 μl씩 도말 접종한 다음, 직경 8 mm의 멸균된 paper disk (Advantec, 6 mm, Tokyo, Japan)를 평판 배지의 표면에 놓고 밀착시켰다. 시료 희석액을 100 μl씩 점적하고 37℃에서 24-48시간 배양하여 disk 주위의 clear zone 형성 유 무를 관찰하여 항균 활성을 비교하였다.
통계처리
각각의 평가 분석은 3반복 이상으로 하였으며 시료로부터 얻어진 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range tests를 실시하였다. 이때 사용한 모든 통계분석은 SPSS 17.0 (IBM SPSS Inc, New York, USA) 통계 프로그램을 이용하여 처리하 였다.
결과 및 고찰
추출수율 및 페놀 함량 비교
본 연구에서 선정한 5가지의 처방 추출물의 생리활성을 비 교하기 위하여 얻은 각 처방 추출물의 수율은 Table 2에 나타 낸 바와 같다. 이는 각 추출물들의 추출액을 동결건조 시켜서 건물 중량을 구한 다음 추출액 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타낸 값이다. 추출수율은 물을 용매로 사용
하였을 때 지패산 Ⅱ가 34.30%로 다른 시료에 비하여 월등히 높았으며, 에탄올을 용매로 사용하였을 때는 단자청피탕이 30.50%로 높게 나타났으며, 지패산 Ⅱ 에탄올 추출물이 16.9%
로 가장 낮았다. 본 연구의 결과와 직접 비교할 수 있는 선행 자료는 미비하지만, Bae 등[2]의 결과에서 청피 메탄올 추출물 의 수율이 11.4%인 것과 비교했을 때 에탄올 추출물의 수율이 높게 나온 것을 확인할 수 있었다. 단자청피탕의 에탄올과 열 수 추출물의 수율에 차이가 나는 것과, 지패산 Ⅱ의 열수와 에탄올 추출물의 수율에 차이가 나는 것은 같은 시료라 하더 라도 추출용매와 시료와의 비, 추출용매의 종류, 추출온도 및 시간 등 여러 조건에 따라 달라질 수 있기 때문으로 생각된다.
다음은 준비된 추출물을 대상으로 총 페놀 함량(TPC)을 비 교하였는데, 페놀 복합물(phenolic compounds)은 phenolic hydroxyl기를 가지는 방향족 화합물의 총칭으로 식물의 주요 2차 대사산물에 해당되며[12, 41], 한약재에 존재하는 vitamin A, C, E, flavonoid 및 carotenoid 등과 함께 대표적인 항산화 물질이다[11, 34]. 5종의 처방 추출물로부터 페놀 복합물을 용 출하기 위하여 추출용매를 달리하여 gallic acid를 표준용액으 로 선정하여 작성한 검정곡선으로부터 각 추출물의 페놀 물질 함량을 비교하여 Table 4에 나타내었다. Table 4에 나타낸 바 와 같이, 5가지의 처방 추출물의 총 페놀 함량은 30.16±0.29~
306.95±0.60 mg GAE/g DW의 범위로 나타났으며, 추출용매 에 따라 페놀 함량에 차이를 나타냈다. 아울러 열수 추출물의 페놀 함량은 단자청피탕 > 십육미류기음 > 지패산 Ⅱ > 청간 해울탕 > 지패산 Ⅰ과 같은 순서에 따라 함량이 높게 나타났으 며, 에탄올 추출물의 경우도 단자청피탕과 십육미류기음에서 높게 나타났으며, 지패산 Ⅰ 및 지패산 Ⅱ에서 상대적으로 낮 게 용출되었다. 일반적으로 식물성분의 페놀 복합물은 극성용 매에서 용해도가 높아 유기용매에서 총 페놀량의 추출 수율이 높은 것으로 알려져 있는 것처럼[5, 9, 33], 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 페놀 함량이 높게 측정되었다.
항산화 활성 비교
다음은 5가지 처방 추출물의 항산화능을 비교하기 위하여 먼저 FRAP법을 적용 하였다. FRAP법은 대상 시료의 환원력 을 전자공여를 통한 radical의 소거능과 관련이 높은 것으로 알려져 있으므로, 산화반응의 촉매제로 작용하는 금속이온을 환원시키는 효력을 측정하는 방법이다[4]. Table 5의 결과에서 알 수 있듯이, 추출물 중 가장 높은 환원력을 보인 처방은 단자 청피탕 에탄올 추출물(140.84±3.11 mg Trolox/g)이었으며, 지 패산 Ⅱ 에탄올 추출물에서 가장 낮은 값(20.82±0.20 mg
Table 4. Total phenolics contents of hot water and 70% ethanol extracts of SYMRKE, DJCPT, JPS Ⅰ, JPS Ⅱ and CGHUT (GAE, gallic acid equivalent)
Total phenolic content
Samples mgGAE/g Samples mgGAE/g
WESYMRKE1) WEDJCPT2) WEJPS Ⅰ3) WEJPS Ⅱ4) WECGHUT5)
71.35±1.45 127.01±3.49 30.16±0.29 55.27±2.60 40.25±0.08
EESYMRKE6) EEDJCPT7) EEJPS Ⅰ8) EEJPS Ⅱ9) EECGHUT10)
161.96±1.32 306.95±0.60 97.56±2.77 38.96±0.90 102.88±0.60 Values are presented as the mean ± SD.
1)Hot water extracts of Sipyukmiyuki-eum; 2)Hot water extracts of Danjacheongpi-tang; 3)Hot water extracts of Jipae-san Ⅰ; 4)Hot water extracts of Jipae-san Ⅱ; 5)Hot water extracts of Chungganhaeul-tang; 6)70% ethanol extracts of Sipyukmiyuki-eum; 7)70%
ethanol extracts of Danjacheongpi-tang; 8)70% ethanol extracts of Jipae-san Ⅰ; 9)70% ethanol extracts of Jipae-san Ⅱ; 10)70% ethanol extracts of Chungganhaeul-tang
Table 5. Ferric reducing antioxidant power of 70% hot water and ethanol extracts of SYMRKE, DJCPT, JPS Ⅰ, JPS
Ⅱ and CGHUT (Trolox, Trolox equivalent) FRAP
Samples mgTrolox/g Samples mgTrolox/g
WESYMRKE WEDJCPT WEJPS Ⅰ WEJPS Ⅱ WECGHUT
50.59±1.61 76.76±1.11 22.00±0.35 54.60±2.14 40.95±0.47
EESYMRKE EEDJCPT EEJPS Ⅰ EEJPS Ⅱ EECGHUT
78.25±2.00 140.84±3.11
46.32±1.04 20.82±0.20 67.86±2.05 Values are presented as the mean ± SD.
A
B
Fig. 1. Effects of hot water (A) and 70% etha- nol extracts (B) of SYMRKE, DJCPT, JPS Ⅰ, JPS Ⅱ and CGHUT on DPPH radical scavenging activity. The absorb- ance of only DPPH solution at 517 nm was 0.98±0.032 (experimental control).
Trolox was used as the positive control.
Each point represents the mean ± SD of three independent experiments.
Trolox/g)을 나타내었다. 아울러 FRAP법에 의한 항산화 효능 을 전체적으로 비교해보았을 때, 총 페놀 함량이 높을수록 뛰 어난 효력을 보였음을 알 수 있었다.
이상의 결과를 바탕으로 5가지의 처방 추출물의 항산화능 을 DPPH 및 ABTS radical 소거능을 이용하여 다시 조사하였 다. 먼저, DPPH radical에 대한 소거 활성은 free radical을 환원시키는 능력이 클수록 높은 항산화 활성 및 ROS 소거 활성을 기대할 수 있는 방법이다[21]. Fig. 1에 나타낸 바와 같이, 5가지 처방 추출물 중 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 가장 높은 농도에서 단자청피탕이 44.8%, 십육미 류기음이 33.45%로 나타났으며, 열수 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 가장 높은 농도에서 단자청피탕이 22.65%로 가장 활성이 높았고, 그 다음으로 십육미류기음이 21.72%로 나타 나, 단자청피탕이 처방에 비하여 뛰어난 DPPH radical 소거능 이 있음을 알 수 있었다.
한편 ABTS radical cation decolorization은 친수성 및 친유 성 물질의 항산화 활성을 측정하기 위해 사용되는 방법이기
A
B
Fig. 2. Effects of hot water (A) and 70% etha- nol extracts (B) of SYMRKE, DJCPT, JPS Ⅰ, JPS Ⅱ and CGHUT on ABTS radical scavenging activity. The absorb- ance of only ABTS solution at 734 nm was 0.71±0.032(experimental control).
Trolox was used as the positive control.
Each point represents the mean ± SD of three independent experiments.
때문에 더 민감하게 항산화 능력을 알아 볼 수 있고, 양이온 radical을 소거하기 때문에 자유 radical을 소거하는 DPPH as- say와 차이를 가지며 DPPH radical 소거능과 함께 항산화 활 성을 검출하는데 많이 이용되고 있다[25]. 즉 ABTS free radi- cal이 추출물 속의 항산화 물질에 의해 제거되는 것을 측정하 여 항산화 효과를 확인할 수 있는 방법이며, 5가지 처방 추출 물의 ABTS free radical에 대한 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 2에 제시하였다. 처방 추출물 중 에탄올 추출물의 ABTS radical 소거 활성은 가장 높은 농도에서 단자청피탕이 70.8%, 십육미류기음이 61.7%로 나타났고, 열수 추출물의 ABTS radi- cal 소거 활성은 가장 높은 농도에서 십육미류기음이 14.4%로 가장 활성이 높았고, 그 다음으로 단자청피탕이 14.0%로 나타 나, DPPH radical 소거 활성능의 결과와 유사하였음을 알 수 있었다. 아울러 각 추출물의 항산화력은 이들 시료에 함유되 어 있는 총 페놀 함량이 증가할수록 우수하게 나타나, 페놀 함량과 높은 연관성이 있음을 알 수 있었다.
잘 알려진 바와 같이 산화적 스트레스는 직접적인 DNA 손상을 유발하므로[20, 36], DNA의 산화적 손상에 대한 5가지 처방의 방어 능력을 확인하기 위하여 C6 세포에서 분리된 gDNA를 대상으로 조사하였다. Fig. 3에 나타낸 바와 같이, 5가지 처방의 열수 및 에탄올 추출물 모두 저농도에서부터 산화적 스트레스에 의해 손상된 DNA를 보호하는 효과를 나 타내었다. 이는 추출용매와 추출방법에 따라 항산화능에 차이 를 보였던 것과는 달리 열수와 에탄올 추출물 모두에서 gDNA 를 산화적 손상으로부터 효과적으로 보호하였음을 확인할 수 있었다. 이러한 효과는 시료에 포함되어있는 항산화제의 역할 을 하는 화합물들이 ROS에 의한 세포 손상을 보호하는 세포
간의 방어 기전에 의한 영향이라는 앞선 다른 연구들과 유사 한 결과임을 보였다[18, 27].
항균활성 비교
5가지 처방 추출물의 항균활성을 조사하기 위해 포도상구 균(S. aureus)과 대장균(E. coli)을 이용하였다. 이들 균주들을 agar 배지에 배양하고 paper disc에 추출물을 첨가한 후, 미생 물의 생육저해로 나타나는 clear zone의 크기를 측정하는 disc diffusion assay [10]를 이용하여 항균 활성을 비교한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 결과에서 알 수 있듯이 각 균주마다 추출 물의 종류에 따라 감수성에 다소 차이가 있었으며 처방 간에 차이뿐만 아니라 추출용매와 추출방법에 따라서도 다소 감수 성에 차이가 나타났음을 알 수 있었다.
먼저 그람양성균에 속하는 S. aureus에서는 열수 추출물 중 에서 십육미류기음이 우수한 항균력을 보여주었고, 에탄올 추 출물 중에서는 단자청피탕을 제외하고 S. aureus에 대하여 모 두 항균활성을 가지는 것으로 나타났다. 본 연구 결과와 유일 하게 비교할 수 있는 Bae 등[2]의 연구에서 청피의 ethyl ace- tate 분획물이 S. aureus에 대해 큰 항균력을 나타낸 반면, 열수 추출물과 메탄올 추출물에서는 효과가 나오지 않았다는 점에 서 본 연구의 결과와 유사하였음을 확인할 수 있었다. 또한 청피의 chloroform extract는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 에서 높은 항균 활성이 있었다고 보고되었는데[2], 본 연구에 사용한 단자청피탕의 열수와 에탄올 추출물에서는 항균 효과 를 관찰할 수 없었다(data not shown). 한편 그람 음성균인 E. coli에서는 단자청피탕, 지패산 Ⅰ과 십육미류기음 에탄올 추출물에서 상대적으로 높은 항균효과가 나타났다(Fig. 4). 이
A B
Fig. 3. Protective effects of hot water (A) and 70% ethanol extracts (B) of five traditional herb-combined remedies on genomic DNA oxidation in C6 glial cells. Genomic DNA purified from C6 glial cells was pre-treated with the indicated extracts for 1 hr and exposed to OH· using fenton reaction. Untreated genomic DNA served as a control.
A
B
Fig. 4. Antimicrobial activities of hot water (A) and 70% ethanol extracts (B) of five traditional herb-combined remedies on microorganisms. The indicated extracts of herb-combined remedies were loaded on the agar plates spreaded with S. aureus and E. coli, and then the bacteria were incubated for 24 hr under aerobic condition (1, control (DW); 2, positive control (chloramphenicol, 0.1 mg/ml); 3, 50 mg/ml of each extract; 4, 100 mg/ml of each extract).
러한 시료들 간의 항균활성의 차이는 추출물에 함유된 물질간 의 상호작용과 균에 대한 특이적 항균 활성에 의한 것으로 생각되며, 또한 항균성 물질의 추출온도, 용매농도 및 용매의 종류에 따라 감수성에 차이가 나타나는 것으로 생각된다. 결 과적으로 항산화 활성이 높은 편이었던 십육미류기음이 그람
양성 및 음성균주에서 고르게 항균 활성을 보여, 총 페놀 함량 과 항산화 및 항균 활성과 연관성이 있다는 선행 연구의 결과 [7]와 잘 일치함을 알 수 있었다.
본 연구에서는 한의학에서 전통적으로 유암의 치료에 사용 되어 온 5가지 처방 추출물의 항산화 및 항균 활성을 조사하였
으며, 처방 추출물 중 단자청피탕에서 가장 많은 페놀 복합물 이 용출되었고 가장 우수한 항산화능을 보여주었다. 두 번째 로 많은 페놀함유량을 나타낸 십육미류기음도 마찬가지로 비 교적 높은 항산화 활성과 항균활성을 나타내었다. 따라서 이 러한 생리활성이 각 추출물에 함유되어 있는 페놀성 화합물과 의 높은 상관관계가 있음을 확인하였으며, 이러한 결과들은 향후 수행할 항암, 항염증, 항산화 활성 및 관련 분자생물학적 기전 연구를 위한 기초 자료로서 활용할 것이다. 아울러 각 추출물에 함유되어 있는 지표물질의 발굴과 함께 각 처방들의 표준화를 위한 기초자료로 활용할 수 있는 근거자료로 이용될 수 있을 것이다.
감사의 글
이 논문은 2015년도 정부(미래창조과학부)의 재원으로 한 국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(No. 2015R 1A2A2A01004633).
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초록：유암 처방에 사용되어온 한약재 복합 처방전의 항산화 및 항균활성에 관한 연구
최은옥1,2․손다희3․김민영1,4․황보현1,5․김홍재1,6․정진우1․홍수현3․박 철7․최영현1,3*
(1동의대학교 항노화연구소 및 블루바이오소재개발센터, 2부산대학교 생활환경대학 식품영양학과, 3동의대학교
한의과대학 생화학교실, 4부산대학교 자연과학대학 생명과학과, 5부산대학교 자연과학대학 분자생물학과, 6부산대학
교 약학대학 약학과, 7동의대학교 자연·생활과학대학 분자생물학과)
본 연구에서 동의보감에 기록된 유암 치료에 사용되어온 5가지 한약재 처방전인 십육미류기음, 단자청피탕, 지 패산 Ⅰ, 지패산 Ⅱ와 청간해울탕의 열수와 에탄올 추출물에 대한 총 페놀 함량의 비교 분석과 항산화능 및 항균 활성능을 비교 조사하였다. 열수와 70% 에탄올 추출물의 수율은 각각 지패산 Ⅱ와 단자청피탕이 가장 높았으며, 총 페놀 함량은 다른 한약재에 비해 단자청피탕이 가장 높았다. 열수 추출물의 총 페놀 함량은 지패산 Ⅰ < 청간 해울탕 < 지패산 Ⅱ < 십육미류기음 < 단자청피탕 순으로 높게 나타났다. 70% 에탄올 추출물의 총 페놀 함량은 지패산 Ⅱ < 지패산 Ⅰ < 청간해울탕 < 십육미류기음 < 단자청피탕 순으로 풍부하였다. 그 중 단자청피탕과 십육 미류기음의 환원력과 DPPH radical과 ABTS radical 소거능이 가장 뛰어났으며, 이들 시료의 총 페놀 함량과 그들 의 항산화능과의 밀접한 상관도가 관찰되었다. 또한 Staphylococcus aureus 및 Escherichia coli에 대한 항균활성은 열수보다 70% 에탄올 추출물에서 효과가 높게 관찰되었다. 결론적으로 유암의 치료에 사용되었던 조사 대상 한약 재 처방전은 항산화와 항균 활성은 그들의 총 페놀 함유량과 연관성이 높았으며, 본 연구의 결과는 각 처방전에 대한 구체적인 생리활성 비교를 위한 자료로서 활용될 것이다.
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