http://dx.doi.org/10.4014/kjmb.1206.06001 pISSN 1598-642X eISSN 2234-7305
비수리 추출물 함유 크림의 보습 효능 및 안정성 평가
이혜진·구현아·박수남*
서울과학기술대학교 정밀화학과, 나노바이오화장품연구실, 화장품종합기술연구소 Received : June 7, 2012 / Revised : June 25, 2012 / Accepted : June 26, 2012
A Determination of the Moisturizing Effect and Stability of a Cream Containing Lespedeza cuneata G.
Don Extracts. Lee, Hye Jin, Hyun A Gu and Soo Nam Park*. Department of Fine Chemistry, Nanobiocos- metic Laboratory, Cosmetic R&D Center, Seoul National University of Science and Technology, Seoul 139-743, Korea − In this study, the skin moisturing effect and stability of cream containing L. cuneata G. Don extract (ethyl acetate fraction) were evaluated. The skin hydrating effect of the cream containing extract was 1020%
higher than the placebo cream, and the TWEL of the cream containing extracts was decreased to 7.7 g/m2h compared to the control (10.2 g/m2) and placebo cream (8.9 g/m2h). The pH, viscosity, and absorbance were measured under the 4, 25, 37, 45oC and the sun light during the 12 weeks. The pH change between cream con- taining extract and placebo cream did not show the significant difference under the 4, 25, 37, 45oC except for the sun light. Both creams showed high decrease (about 59%) of viscosity at 45oC. However, there was no sig- nificant change under other conditions. The absorbance of the cream containing the extract and the placebo cream was decreased similarly at all conditions. This decrease in absorbance was relatively small compared to the decrease of absorbance of the extract in ethanol solution under the sun light (Fig. 7). In addition, any change in color or smell of the cream was not observed during the 12 weeks. Also physical changes as cream- ing and cohesion were not shown. These results indicate that the cream containing L. cuneata extract has the skin moisturizing effect and is relatively stable. Therefore, it is suggested that the ethyl acetate fraction of L.
cuneata extract could be applicable to cosmetics as a new cosmetic material with its antioxidative and antibac- terial activities reported previously.
Keywords: Lespedeza cuneata G. Don, cream, stability test, moisture, cosmetics
서 론
비수리(Lespedeza cuneata G.Don)는 콩과(Leguminosae) 의 여러해살이 초본성 아관목으로 우리나라 전국의 산야에 분포하며 일본, 중국, 대만 및 인도 등지에도 분포한다. 비 수리의 지상부는 한약명으로 야관문이라 하며 민간에서는 간과 콩팥의 기능을 보호함으로써 유정, 유뇨 등을 치료하 고, 폐를 강화시킴으로써 해수, 천식, 유방염 및 종기 치료, 시력강화 및 혈액 순환을 돕고, 다양한 남성 질환 및 양기 부족 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다[1, 10]. 생리 활성 물질로는 pinitol, flavoloid, phenol, tannin 및 β- sitosterol, 천연 항산화제 성분으로는 quercetin, kaempferol, vitexin 및 orientin 등의 플라보노이드가 보고되고 있다[2-3, 7-9].
본 연구에 앞서 저자들은 비수리 추출물의 항균 활성과 항
산화 활성을 측정하여 보고한 바 있다[11]. 그 결과, 비수리 추출물의 에틸아세테이트 분획은 사람 비듬균(Pityrosporum ovale)에 대해서 대조군인 methyl paraben보다 큰 항균활성 (MIC, 0.125%)을 나타내었다. 또한 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성에 있어서는 대조 군과 유사한 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 한편, 비수리 추출물의 에틸아세테이트 분획의 free radical (1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성(FSC50, µg/mL)은 20.80 µg/mL, luminol 의존적인 Fe3+-EDTA/H2O2계를 이용한 활 성산소 소거활성 실험에서 총 항산화능(OSC50, µg/mL)은 0.14 µg/mL, 1O2로 유도된 사람 적혈구 파괴에 대한 세포 보호 효과는 농도 의존성(1~50 µg/mL)을 보였으며, 10 µg/
mL의 낮은 농도에서도 뚜렷한 세포 보호 효과를 나타내었 다(τ50 = 51.7 min). 상기의 세 가지 항산화 실험을 통해서 비수리 추출물의 에틸아세테이트 분획이 다양한 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)을 소거하고 ROS에 대항하 여 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 비수리 추 출물은 자외선에 노출된 피부에서도 항산화제로서 작용할
*Corresponding author
Tel: +82-2-970-6451, Fax: +82-2-972-9585 E-mail: [email protected]
수 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 비수리 추출물의 에틸아세테이트 분획을 화장품에 첨가했을 때도 항균 및 항 산화 활성이 있을 것으로 기대된다. 비수리 추출물을 화장 품 원료로서 응용한 예는 현재까지 보고된 바가 없다. 본 연 구에서는 비수리 추출물의 에틸아세테이트 분획을 함유한 크림을 제조하고, 이 크림의 안정성을 평가함으로써 화장품 원료로서 응용 가능성이 있는지를 조사하였다. 우선 인체실 험을 통하여 비수리 추출물 함유 크림의 보습효과(사람 피 부의 수분 보유량과 경표피 수분 손실량)를 측정하였고, 이 어서 다양한 온도 및 태양광선 하에서 추출물 함유 크림의 시간에 따른 pH, 점도 및 흡광도 변화를 측정함으로써 크림 의 유화 안정성을 평가하였다[4-6].
재료 및 방법 기기 및 시약
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, pH meter는 Istek (Korea), 점도 측정은 Brookfield (DV-E viscometer, USA)사의 기계를 사용하였다. 시료를 보 관한 항온조는 Jisico (Korea)사의 JHP01B를 사용하였으며, 비수리 추출 및 크림 제조에 사용한 증류수는 Barnstead, US/NANO PURE (USA)에 통과시킨 것을 사용하였다. pH 표준 용액은 Dae Jung Chemical & Metals사 제품을 사용 하였고, 에탄올 (EtOH), 에틸아세테이트 (EtOAc) 등 각종 용매는 특급 시약을 사용하였다. 피부 보습 효능 평가를 위 해 CK electronic (Germany)사의 Corneometer CM820, Tewameter TM210를 사용하였으며, 실험에 사용한 건조된 비수리는 2009년 4월 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
비수리 추출물 제조
건조된 비수리(L. cuneata) 100 g을 잘게 자른 후 50% 에 탄올 2 L를 이용하여 하루 동안 침적시킨 후 여과하여 사용 하였다. 이 여액의 일부는 감압농축하여 50% 에탄올 추출 물로 사용하였고, 일부는 헥세인으로 비극성 성분을 제거한 후 에틸아세테이트로 추출하여 얻은 추출액을 감압농축하여 파우더를 얻어 실험에 사용하였다.
비수리 추출물 함유 크림의 제조
안정성 평가 및 보습 효능 평가에 사용된 비수리 추출물 은 높은 항산화 활성 및 우수한 항균 활성을 나타내는 에틸 아세테이트 분획을 사용하였다. 실험에 사용한 크림 처방은 Table 1과 같다. 비수리 추출물은 stock solution (ethanol:
1,3-butylene glycol (1:4)) 용액에 20%가 되도록 만들고 처 방에는 이 용액이 1.0%가 되도록 가하여 최종 비수리 추출 물 0.2% 함유(고형분 기준)한 크림을 제조하여 시험군으로 사용하였다. Placebo 크림은 비수리 추출물 없이 동일양의 stock solution만을 1.0% 첨가하여 크림을 제조하였다.
비수리 추출물 함유 크림의 피부 보습 효과 측정
실험대상: 연구대상은 과거에 알레르기성 질환이나 아토피
피부염 등 질환의 병력이 없는 20대의 건강한 피부를 가진 피험자 14명을 대상으로 실시하였으며 시험 부위는 팔 안쪽 부위로 한정하였다. 평가를 실시하기 전에 피험자들에게 주 의 사항을 숙지시켰으며, 시험 동의서를 받았다.
크림 제조 및 처리: 각 피험자는 동일한 비누를 이용하여
팔의 안쪽 부위를 씻은 후 항온항습조건(온도 25 ± 2oC, 상 대습도 43 ± 2%)에서 30분 동안 시험부위를 안정화시킨 다 음 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 크림은 에틸아세테이 트 분획이 0.2% 함유된 크림으로서 Table 1의 처방대로 제 조하여 사용하였다.
피부 수분 함유량 및 경표피 수분 손실량 측정: 먼저 팔의 안
쪽 부위에 일정한 위치와 크기의 시험 부위를 지정하였고, 초 기 값으로 도포 전 수분 함유량 및 경표피 수분 손실량을 측 정하였다. 일정량의 크림 도포후 피부 수분 함유량은 30 min 간격, 경표피 수분 손실량은 1시간 간격으로 측정하였다. 측정 된 capacitance value는 0~120 사이의 arbitrary capacitance units (A.U.)로 전환하였으며, 측정된 경표피 수분 손실량은 g/h · m2로 표기하였다.
비수리 추출물 함유 크림의 안정성 평가 실험
온도에 따른 안정성을 평가하기 위해 태양광선과 다양한 온도 하에서 비수리 추출물을 함유한 크림과 함유하지 않은 크림을 2월~4월에 거쳐 12주 동안 보관하여 초기부터 8주 Table 1. Formulation of the cream containing the ethyl acetate fraction of L. cuneata extracts.
Component
Content (%) Placebo
cream
Experimental cream
DI water Up to 100 Up to 100
Glycerine 7.0 7.0
1,3-Butylene glycol 5.0 5.0
Xanthan gum (Keltrol-F) 0.1 0.1
Triethylamine (T.E.A) 0.2 0.2
Methyl paraben 0.1 0.1
Ceto-stearyl alcohol (Lanette-o) 2.0 2.0
Stearic acid 1.0 1.0
Glyceryl-stearate/PEG-100 1.5 1.5
stearate (Alracel #165)
Bees wax 1.0 1.0
Glyceryl monostearate (GMS-205) 1.0 1.0 Squalane (Pripure R 3795) 8.0 8.0 Caprylic capric triglyceride 5.0 5.0
Paraffin wax 2.5 2.5
Dimethicone (Si-200/100 CS) 0.3 0.3 Stock solution (EtOH : 1,3-BG (1 : 4)) 1.0 - 20 % L. cuneata extracts (EtOAc
fraction) in stock solution
- 1.0
까지는 2주 간격, 8주에서 12주까지는 4주의 간격으로 크림 속 비수리 추출물의 pH, 점도를 측정하였고 흡광도는 4주 간격으로 측정하였다. 12주간 비수리 추출물 크림의 물리·
화학적 특성을 파악하였고 변취 및 변색을 관찰함으로써 안 정성을 종합적으로 평가하였다.
pH 측정법: pH 측정은 온도별 저장 및 태양광선 노출 하
에 있는 비수리 추출물 함유 크림을 매회 1 g을 취하여 D.I water로 15 mL 채운 후 sonicator로 1시간 동안 sonication 시킨 후 pH를 측정하였다. pH 표준 용액으로 측정 전 pH 보정에 정확성을 기하였고 측정 시 온도를 25 ± 1oC로 유지 하였다.
점도 측정법: 실험에 사용된 크림은 유동성 점성 액체이므
로 T-barspindle을 이용하여 Brookfield 점도계로 점도를 측 정하였다. 즉 크림을 일정한 가속도로 회전하는 spindle에 움 직이는 크림의 점성 저항 torque값을 검출하여 점도를 측정 하는 기기를 사용하여 측정하였다. 본 실험에서는 spindle의 종류와 회전수를 spindle D, 94 rpm으로 15초 간격으로 5번 측정하여 평균과 편차 값을 구하였고, 온도별로 저장되어 있 는 크림은 항온조에서 꺼낸 후 3시간이 지난 후에 측정하였다.
흡광도 측정법: 에탄올에 용해시킨 비수리 추출물은 270
nm에서 최대 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 흡광도 측정 실험 은 크림으로부터 매회 1 g을 취한 후 에탄올 5 mL로 추출하 여 크림 속 비수리 추출물을 추출한 후 여과하여 그 여액의 흡광도를 270 nm에서 측정하였다. 또한 0.2% 비수리 추출 물이 함유된 에탄올 용액을 만들어 4주 동안 태양광선 하에 보관하면서 크림 속에서와 에탄올 용액 속에서의 비수리 추 출물의 변화를 흡광도를 통해 측정하여 비교하였다.
변색 및 변취 관찰: 여러 조건하에 있는 비수리 추출물을
함유한 크림 및 함유하지 않은 크림의 변색 및 변취 여부를 육안으로 관찰하였다.
통계 처리
모든 실험은 3회 반복하였고, 통계 분석은 5% 유의수준
에서 student's t-test를 행하였다.
결과 및 고찰
비수리 추출물 함유 크림의 피부 도포에 의한 보습 효능
수분보유량: 비수리 추출물 중 에틸아세테이트 분획을 함
유한 크림의 피부 수분 보호효과를 평가하기 위해서 0.2%
비수리 추출물을 함유한 크림을 제조하여 팔 안쪽에 도포한 후, 수분 보유량을 30분 간격으로 180분 동안 측정하였다 (Fig. 1). 크림을 도포하지 않은 대조군과 placebo 크림에 비 해서 비수리 추출물 함유 크림의 수분보유량이 도포 후 30 분부터 확연히 증가한 것을 볼 수 있다. 또한 placebo 크림 의 수분 보유량은 30%인 것에 비해서 비수리 추출물 함유 크림의 경우 수분 보유량이 40%로 10% 더 증가하였다(Fig.
2).
경표피 수분 손실량: 경표피 수분 손실량을 확인하기 위해
비수리 추출물을 함유한 크림을 도포한 후, 1시간 간격으로 3시간 동안 측정하였다. Fig. 3을 보면 대조군과 placebo 크 림에 비해서 비수리 함유하는 크림의 수분 손실량이 대체적 으로 적은 것을 확인 할 수 있다. 무 도포 상태인 대조군의 경우는 시간이 지남에 따라 수분 손실량이 점차 증가하였고 placebo 크림을 도포한 경우 대조군 보다는 수분 손실량이 감소하였지만 비수리 추출물을 함유한 크림과 비교해 보면 세가지 경우 중에 비수리 추출물을 함유한 크림의 수분 손 실량이 가장 적음을 확인할 수 있다. 3시간이 지난 후 대조 군의 수분 손실량은 10.2 g/m2h, placebo 크림은 8.9 g/m2h, 비수리 추출물을 함유한 크림은 7.7 g/m2h로 비수리 추출물 을 함유한 크림이 경표피 수분 손실량을 더 크게 감소시킴 을 알 수 있다. 또한 Fig. 4에서는 피부에서 수분 손실 감소 율을 나타낸다. 시간에 지남에 따라 placebo 크림에 비해서 비수리 추출물 함유 크림이 경표피 수분 손실량 감소율이 30% 정도 더 높은 결과가 나왔고, 이 결과를 보면 비수리 추출물 함유 크림이 피부 속 수분 손실을 확연히 감소시켰
Fig. 1. Skin hydration capacity by corneometer (CM820) mea- surement at intervals of 30 min after the application of the cream containing the ethyl acetate fraction of L. cuneata extracts (n = 14).
Fig. 2. Rate of increase in skin moisture capacity. -□-: placebo cream, -◆-: cream containing the ethyl acetate fraction of L.
cuneata extracts (n = 14).
음을 알 수 있었다.
비수리 추출물 함유 크림의 안정성 평가
pH 변화: 12주 동안 서로 다른 온도(4oC, 20oC, 37oC, 45oC)와 태양광선 아래에서 0.2% 비수리 추출물을 함유한 크림과 추출물을 함유하지 않은 크림인 placebo 크림의 pH 변화를 비교하였다(Fig. 5). Placebo 크림은 초기 pH는 7.06 이였고 4oC, 20oC, 37oC, 45oC 및 태양광선 하에서 12주 후 에 각각 6.21, 6.69, 6.16, 5.97, 6.97로 변화되었다. 비수리 추출물 함유 크림은 초기 pH 6.4이였고 위와 동일한 조건하 에서 12주 후에 pH는 각각 6.56, 6.26, 6.01, 5.6, 5.6으로 되었다. 비수리 추출물 함유 크림과 placebo 크림에서는 모 두 고온 상태인 45oC에서 큰 pH 변화를 나타내었다. 다양 한 온도 하에서는 비수리 추출물 함유 크림과 placebo 크림 의 pH 변화가 비슷한 경향성을 나타내었지만 태양광선 아 래에서는 비수리 추출물 함유 크림의 pH 변화가 placebo 크 림보다 상당히 큰 것을 확인하였다. 이러한 점으로 보아 비 수리 추출물이 함유되어 있는 크림은 태양광선에 민감한 반 응을 보이는 것으로 판단되고 이 제형을 보관할 경우 태양 광선을 막을 수 있는 용기를 이용하는 것이 제형의 안정성
을 더 오래 유지 할 수 있는 방법 중 하나라고 생각된다.
점도 변화: 0.2% 비수리 추출물을 함유한 크림과 함유하지
않은 크림의 점도를 측정하였다(Fig. 6). 0주에 placebo 크림 과 비수리 추출물 함유 크림은 각각 5660 cP와 5040 cP로 비 수리 추출물 함유 크림에서 더 낮은 점도를 나타내었다. 이 는 아마도 비수리 추출물에 존재하는 quercetin, keampferol 등의 폴리페놀성 성분들의 작용에 기인된 것으로 보여진다.
하지만 큰 차이를 보이지는 않았다. 12주 동안의 비수리 추 출물 함유 크림과 placebo 크림의 점도 변화를 보았을 때 비 슷한 변화 양상을 볼 수 있었다. 온도에 따른 점도 변화를 각각 살펴 보았을 경우 45oC에서 점도가 크게 감소한 것을 확인 할 수 있었다. 태양광선 아래에서와 45oC를 제외한 다 른 온도에서는 점도가 큰 변화를 나타내지 않는 것으로 보 아 점도는 높은 온도와 태양광선에 의해서 변화가 심하게 일 어나는 것을 알 수 있었다. 그러나 placebo 크림과 비수리 추출물 함유 크림 둘 다 모든 조건에서 비슷한 경향으로 변 화가 일어남을 알 수 있었고, 비수리 추출물함유 크림이 제 형 점도에는 큰 변화를 일으키지 않는 것으로 판단된다.
흡광도 변화: 비수리 추출물 자체의 흡광도 변화를 보기 위
해서 크림에 함유되는 양과 같은 0.2% 비수리 추출물을 에 탄올에 녹여 최대 흡수파장을 확인하였다(Fig. 7). 0.2% 비 수리 추출물의 최대 흡수파장인 270 nm에서 측정한 결과 0 주에서는 0.90으로 높은 흡광도를 나타냈다. 그러나 태양광 선 아래에 4주간 방치한 후 흡광도는 0.28로 0주에 비해 69%가 감소하였고 이 결과로 보아 4주 후의 흡광도가 상당 히 감소함을 확인할 수 있었다. 에탄올에 있는 비수리 추출 물은 태양광선을 직접적으로 흡수하기 때문에 비수리 추출 물 성분이 파괴되어 흡광도가 크게 감소한 것으로 보인다.
다음으로 크림 속 비수리 추출물의 흡광도 변화를 확인하였 다. 비수리 추출물 0.2%를 함유하는 크림과 함유하지 않은 크림을 제조하여 에탄올로 추출하여 비수리 추출물의 흡광 도 변화를 측정 하였다(Fig. 8). 0주에서 비수리 추출물을 함 유하는 크림과 0.2% 비수리 추출물 에탄올 용액의 흡광도 Fig. 4. Rate of decrease in skin water loss content. -□-: pla-
cebo cream, -◆-: cream containing the ethyl acetate fraction of L.
cuneata extracts.
Fig. 3. Transepidermal water loss by Tewameter (TM300) mea- surement at intervals of 30 min after the application of cream containing the ethyl acetate fraction of L. cuneata extracts (n
= 14).
Fig. 5. pH variations of cream stored at various temperatures and under the sun for 12 weeks.
를 비교했을 경우 각각 0.86, 0.90으로 크림 속 비수리 추출 물의 흡광도가 약간 감소하였으나 두 경우 모두 차이를 보 이지는 않았다. 4주 간격으로 12주 동안 실험을 진행한 결 과 태양광선이나 온도의 변화에 따른 비수리 추출물 흡광도
의 차이는 거의 없는 것으로 나타났다. 제조한지 12주 후 비 수리 추출물 함유 크림 속 추출물의 흡광도는 비수리 추출 물 에탄올 용액이 4주 동안 태양광선 아래에 방치됐을 때와 비슷한 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 비수리 추출물을 크 림에 함유하였을 경우 비수리 추출물의 흡광도가 떨어지는 속도를 늦출 수 있다는 것을 확인하였다.
변색 및 변취: 0.2% 비수리 추출물 함유한 크림과 placebo Fig. 6. Variation of viscosity under various conditions (A, 4oC; B, 25oC; C, 37oC; D, 45oC; E, under sun).
Fig. 7. Variation in absorbance of the ethyl acetate fraction of L. cuneata extracts in ethanol for 4 weeks.
Fig. 8. Variation in absorbance of extracts from experimental cream (upper) and control cream (under) at 270 nm. Each value represents the mean ± S.D (n = 6).
크림을 비교하였을 경우, 37oC, 45oC의 고온에서 비수리 추 출물 함유 크림의 색이 약간 진해지는 현상이 관찰되었고 냄 새에 어떠한 큰 변화는 없었고, 크리밍, 응집 및 층 분리와 같은 이상 현상은 관찰되지 않았다.
요 약
본 연구에서는 비수리 추출물 함유 크림의 피부 보습 효 능과 안정성을 평가하였다. 비수리 추출물의 0.2% 에틸아세 테이트 분획을 함유한 크림을 제조하고 임상실험으로 피부 보습 효과를 측정하였다. 크림을 도포한 후에 피부 수분량 과 경표피 수분 손실량을 조사하였다. 추출물의 0.2% 에틸 아세테이트 분획을 함유한 크림의 피부 보습효과는 placebo 크림보다도 10~20% 정도 크게 나타났다. 에틸아세테이트 분 획을 함유한 크림의 경표피 수분 손실량(TEWL, 7.7 g/m2h) 은 대조군(10.2 g/m2h) 및 placebo 크림(8.9 g/m2h)에 비교하 여 TEWL의 감소를 나타내었다. 비수리 추출물의 0.2% 에 틸아세테이트 분획을 함유한 크림의 안정성을 평가하였다.
4개의 서로 다른 온도(4oC, 20oC, 37oC, 45oC)와 태양 광선 하에 12주 동안 추출물 함유 크림을 처리한 후 pH, 점도 및 흡광도를 측정하였다. 추출물 함유 크림과 placebo 크림 사 이의 pH 변화는 위에 언급된 여러 가지 온도 하에서 유의 적인 차이를 나타내지는 않았다. 하지만 추출물 함유 크림 의 pH 변화(∆ph = 1.60) placebo 크림(∆ph = 1.65)보다 태 양 광선 하에서 크게 나타났다. 추출물 함유 크림과 placebo 크림의 점도를 12주 동안 여러 온도에 처리한 후 측정하였 다. 추출물 함유 크림과 placebo 크림 모두 45oC에서 큰 점 도 감소(약 59%)를 나타내었다. 하지만, 4, 20, 및 37oC와 태양광선 하에서는 큰 변화가 없었다. 추출물 함유 크림과 placebo 크림의 흡광도는 모든 조건에서 비슷하게 감소하였 다. 이러한 흡광도의 감소는 태양광선 하에서 에탄올 용액 에 있는 추출물의 흡광도 감소와 비교하여 상대적으로 작게 나타났다(Fig. 7). 첨부해서, 실험 기간 12주 동안 크림의 변 색이나 변취에 있어서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 또 한, 크리밍이나 응집과 같은 물리적인 변화도 관찰할 수 없 었다. 이러한 결과들은 비수리 추출물의 에틸아세테이트 분 획 함유 크림이 피부 보습 효과를 가지며 상대적으로 안정
함을 가리킨다. 따라서 이는 비수리 추출물의 에틸아세테이 트 분획은 이미 보고된 항산화 및 항균 활성과 함께 새로운 화장품 소재로서 응용 가능성이 있음을 시사한다.
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