291 서 론
Polychlorinated biphenyls (PCBs)은 전 세계적으로 광범위 하게 퍼져있는 환경오염물질로서 1970년대에 그들 제품 에 대한 금지령이 내리기 전까지 수십 년 동안 다양한 산업의 용도로써 널리 사용되고 있었다.2) PCBs는 209종
의 이성질체가 존재하며,3) 할로겐 탄화수소로 반감기가 30년 이상 되는 물질로 절연성과 불연성이 뛰어나 열안 정성, 낮은 반응성, 낮은 전기전도성의 특성을 갖고 있어 난연제, 가소제나 냉각제, 전기절연체, 윤활유로 사용된
다.4,5) 또한 이들은 구조적으로도 안정하여 난분해성일
뿐만 아니라 독성이 강하고 생물에서 mutagen 및 car- cinogen으로 작용할 수 있다. 이러한 환경 속에 포함된
PCBs (Aroclor1254)에 의한 293T 세포 내의 단백질 발현 연구
1숙명여자대학교 이과대학 생명과학부, 2한국식품개발연구원
안정민1․이나리2․최순영1
The Study of the Proteins Expressed in 293T Cells by PCBs (Aroclor1254) Treatment
Jung Min An1, Na Ri Lee2 and Soon Young Choi1
1Division of Biological Science, School of Natural Sciences, Sookmyung Women's University, Seoul 140-742, 2Korea Food Research Institute, Seongnam 463-746, Korea
The polychlorinated biphenyls (PCBs, Aroclor1254) is widely dispersed environmental pollutants and shows its toxic effects including neurotoxicity, hepatotoxicity, carcinogenicity, immunotoxicity and cardiotoxicity. These toxicities depend on the chemical structure of congeners, each of which is chlorinated to various degrees. The PCBs causes abnormalities in the developing central nervous system.
Due to the structural similarities of PCBs and TH (thyroid hormone), the PCBs might affect systems involving this hormones. Previous studies in our laboratory, we found that the PCBs treatment decreased cell proliferation in diverse organ cells like kidney, liver, and heart etc. And we investigated DNA fragmentation which is a hall mark of apoptosis by exposure of the PCBs in 293T cell in previous research. In this study, we identified cellular factors which possibly induce apoptosis by PCBs treatment.
As a result, we found the changes of protein expression in the 293T cells with PCBs treatment by two dimensional electrophoresis and matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spec- trometry (MALDI-TOF-MS) analysis. The proteins were DNA-binding protein, polycystin-2 homolog (PKD2L), cytosolic inorganic pyrophosphatase, glutathione transferase / fatty-acyl-ethel-ester synthase.
(Cancer Prev Res 11, 291-296, 2006)
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책임저자：최순영, ꂕ 140-742, 서울시 용산구 효창원길 52번지 숙명여자대학교 이과대학 생명과학부
Tel: 02-710-9510, Fax: 02-2077-7322 E-mail: sychoi@sm.ac.kr
접수일：2006년 10월 30일, 게재승인일：2006년 12월 5일
Correspondence to：Soon Young Choi
Division of Biological Science, School of Natural Sciences, Sookmyung Women's University, 52, Hyochangwon-gil, Yongsan-gu, Seoul 140-742, Korea
Tel: +82-2-710-9510, Fax: +82-2-2077-7322 E-mail: sychoi@sm.ac.kr
화합물 함유량 레벨은 선진국의 여러 지역에서 약간씩 감소되어 왔고 북극 지방과 같은 다른 지역에서는 증가 되어왔다.6) 이 화합물의 생분해에 대한 저항성과 높은 지질친화성 때문에, PCBs를 광범위하게 사용함으로써 인간을 포함한 다양한 유기체에 이 화합물의 생물축적 이 일어나게 된다.2,7) 그들은 간독성, 면역억제, 흉선위 축, 생식독성, 소모성증후군, 내분비선장애, 발생독성, 발암물질과 같은 다양한 부작용을 초래한다.8) 이러한 독 성은 각종 PCBs의 다양한 단계의 염소가 포함된 화학구 조에 의해 좌우된다. 또한, PCBs에 오염된 물고기를 소 비함으로써 월경주기의 단축, 수태능력의 감소, 신생아 크기의 감소, 신경계 질환을 포함한 몇 가지의 불리한 임신결과가 나타난다.9∼13) 그리고 PCBs는 중추신경계 발 생에 비정상을 야기시킨다. 이는 PCBs가 갑상선 호르몬 의 구조와 유사하기 때문에 이런 호르몬 기능에 영향을 미치는 것으로 추정되고 있다.
PCBs와 그 외 할로겐성 방향족 탄화수소류들은 전사 인자인 AhR이나 NF-κB를 통하여 독성이 나타나는 것으 로 알려졌다.14,15) 또한 염증 및 알레르기 반응에 관여하 는 주된 세포인 비만세포에 영향을 미치는 것으로 밝혀
졌다.3,16∼18) 생태계의 도처에 오염물질로 존재하는 PCBs
는 인간에게 신경독성을 가지고 있으며, PCB52 등은 human neuronal SK-N-MC 세포에 apoptosis를 유발하고19) 이는 특히 표적 단백질인 Poly (ADP-ribose) polymerases (PARP)와 carotenine에 영향을 미친다. PCB77, PCB153도 신경 독성을 나타내며 apoptosis를 유도하고 신경성 질병 이 유발됨이 보고되었다.20,21) 그리고 Aroclor1254 역시 인 간 세포에서 신경독성이 있음이 보고되었다.22)
본 연구에서는 PCBs가 인간을 비롯한 동물에게 미치 는 다양한 독성효과를 규명하고자 PCBs mixture인 Aro- clor1254의 포유류 세포인 293T에 대한 영향을 연구하였 다. 선행 연구 결과, DNA fragmentation을 확인함으로써 Aroclor1254가 여러 포유류 세포에서 apoptosis를 유발하 는 것이 확인되었고 cell viability test를 통해 toxicity가 있 음도 확인하였다.1) Aroclor1254는 그중 293T cell에 가장 민감하게 apoptosis를 유도하였다. 그래서 본 연구를 통해 viability에 가장 큰 영향을 주는 것으로 알려진 293T 세포 의 Aroclor1254의 노출시간, 노출량별 viability를 측정하였 으며, apoptosis에 영향을 미치는 요인들을 찾기 위해, Aroclor1254를 24시간 처리한 세포를 two dimensional elec- trophoresis와 MALDI-TOF & MALDI-TOF/TOF를 통해 물 질 처리 전과 달리 변화가 있는 단백질 탐색 연구를 실 시하였다.
재료 및 방법 1. 세포 배양
293T (Human embryonic kidney T) 세포주는 4.5 g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES가 포함된 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)에 10% Fetal Bovine Serum (FBS)과 1% penicillin/streptomysine을 첨가하여 37oC, 5%
CO2에서 배양하였다.
PCBs mixture인 Aroclor1254는 Accustandard (New Haven, CT) 제품을 사용하였다.
2. 시험물질의 처리
PCBs로 Aroclor1254를 DMSO에 50 mg/ml 농도로 녹인 뒤 room temperature에서 보관하였다. Aroclor1254의 stock solution (50 mg/ml)은 사용하기 직전에 FBS가 포함된 DMEM 배양액으로 희석하여 반응액(20μg/ml, 30μg/ml) 을 만들었다. 세포가 100 mM plate에 70% 정도 자랐을 때, Aroclor1254를 각각 20μg/ml, 30μg/ml 농도로 넣어준 뒤 12시간 동안 37oC, 5% CO2에서 배양하였다.
3. Cell viability
Aroclor1254 처리 시 농도와 시간에 따른 293T cell에서 의 viability 측정을 위해서 trypan blue exclusion assay를 이 용하였다.1,23) 세포배양용 plate에 1×106 cells/ml의 개수로 분주하고 시간(0시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간)과 농도(20μg/ml, 30μg/ml)에 따라 Aroclor1254를 처리한 뒤 37oC, 5% CO2에서 배양시켰다. Phosphate buffered saline (PBS)을 1 ml씩 첨가하여 세포를 부유시킨 후 세포를 모 으고, 같은 볼륨의 trypan blue (Jeil Biotechservices Inc.)를 넣어서 섞은 뒤 hematocytometer (Sigma Co.)와 현미경(CK- 40, Olympus)을 사용해 살아있는 세포 수를 측정하였다.
4. Two-dimensional gel electrophoresis
Two-dimensional gel electrophoresis 분석을 실시하기 위 해 PCBs를 12시간 동안 처리한 293T cell과 control로 쓰일 normal 293T cell을 lysis buffer (8 M urea, 4% CHAPS, 0.2%
ampholytes, 0.002% BPB, 50 mM Tris, 50 mM DTT)에 protease inhibitors (5μg/ml leupeptin, 10μg/ml aprotinin, 48 μg/ml PMSF, 1 mg/ml DNase, 0.25 mg/ml)를 첨가한 것을 처리하여 단백질을 추출한다. 그 뒤, pH 3∼10 gradient strip (Bio-Rad Laboratories. Inc.)을 가지고 isoelectric focusing 을 수행하기 위해 우선, rehydration solution (8M urea, 4%
CHAPS, 0.002% BPB, 10% glycerol)에 2% pH 3∼10 gra-
dient buffer (Bio-Rad Laboratories. Inc.)와 0.04% DTT를 넣 은 섞은 후 strip을 12시간 동안 적시고 나서, 1단계는 250 V에서 15분, 2단계는 4,000 V에서 2시간, 3단계에서는 4,000 V에서 시작하여 최종적으로 20,000 V-hr가 되도록 한 뒤, 4단계에서 500 V에서 유지되도록 PROTEAN IEF CELL (Bio-Rad Laboratories. Inc.)에서 Isoelectric focusing을 수행한다. 그 후 strip을 equilibration buffer (6 M urea, 50 mM Tris, 2% SDS, 20% glycerol, 0.002% BPB)에 넣어 평형 시킨다. 1차 평형에서는 equilibration buffer에 2% DTT를 더 첨가하여 15분 동안 shaking을 시키고, 2차 평형에서 는 equilibration buffer에 2.5% IAA를 더 넣어주고 15분 동 안 shaking을 한다. 그러고 나서, 단백질이 크기에 따라 분리되도록 12% polyacrylamide gel에서 second dimension electrophoresis를 수행하였다. 마지막으로 Silver staining으
로 gel을 발색시킨다. 젤상에 나타난 spot을 관찰하여, 발 현에 변화가 있는 단백질을 MALDI-TOF & MALDI-TOF/
TOF를 통해서 확인하였다.
결 과
1. Aroclor1254에 의한 293T 세포성장 영향
Aroclor1254에 의해서 293T 세포의 proliferation이 감소 됨이 관찰되었다. Aroclor1254에 의한 cell viability 변화를 trypan blue exclusion assay를 이용하여 확인해 보았다. Cell viability는 살아있는 세포의 수를 나타내는 것으로, Aro- clor1254를 처리했을 때 살아있는 세포의 비율을 DMSO 를 처리한 control 세포와 비교하여 나타내었다. Aroclor- 1254 처리 후 시간과 농도에 따라 다른 효과를 나타내었 다(Fig. 1). 즉, Aroclor1254를 20μg/ml과 30μg/ ml의 농도 로 각각 처리하였을 때 incubation time 12시간 이후에는 공통적으로 control에 비해 viability가 현저히 감소됨을 확 인할 수 있었다(Fig. 1). Aroclor1254를 20μg/ml 처리 하였 을 경우에 비해 30μg/ml로 처리한 후 48시간 후에는 살 아있는 세포가 거의 존재하지 않음을 관찰할 수 있었다.
2. Aroclor1254에 의한 293T 세포 내 단백질 발현의 변화
물질을 처리하지 않은 293T cell과 Aroclor1254을 12시 간 동안 처리한 293T cell의 protein을 추출하여 two-di- mensional gel electrophoresis 통해 단백질 발현에 변화가 있 는 spot들을 6개 찾아내었다(Fig. 2). 발현이 변화된 단백 질들 중 4개는 down-regulation 되었고 2개는 up-regulation 이 되었다. MALDI-TOF & MALDI-TOF/TOF 방법으로 분 석 결과 down-regulation이 된 4가지는 DNA-binding pro- Fig. 1. Effects of Aroclor1254 on the growth of mammalian 293T
cells. Dose- and time-dependent decrease in cell viability upon Aroclor1254 treatment were determined trypan blue exclusion assay.
Fig. 2. 2-Dimensional gel elec- trophoresis result after 293T cells treated with Aroclor1254 for 12 h.
Control Aroclor1254
1 2
4 3
5 6
1 2
4 5
6
3
tein, PKD2L, cytosolic inorganic pyrophosphatase과 gluta- thione transferase/fatty-acyl-ethel-ester synthase로 확인되었다 (Table 1).
고 찰
Polychlorinated biphenyls (PCBs)는 방향족 탄화수소로 높은 안정성과 지질친화성 때문에 전 세계적으로 심각 한 환경오염을 일으키는 물질로 여겨지고 있다.16) 보고 된 바에 따르면, coplanar와 non-coplanar PCB congener들은 세포 기능장애와 신경독성 발생과 연관되어있다는 것을 알 수 있다.24∼26) 그리고 non-planer PCBs congeners인 2,2'4,6,6'-pentachlorobiphenyl (PCBs 104)은 human mono- cytic cell과 microvascular endothelial cell에서 apoptotic cell death를 일으키며 이는 PCBs가 면역억제와 혈관내피의 기능장애를 야기한다는 것을 나타내고 있다.27) 본 연구 에서는, non-planer PCB 중 하나인 Aroclor1254의 독성효 과를 연구하기 위해 다양한 기관 세포의 성장을 관찰하 였다. Aroclor1254에 노출된 다양한 기관들의 세포에서 두드러지게 cell viability가 줄어들었다. 이러한 viability의 감소는 각 세포 타입마다 다른 독성 효과를 나타내었 다.1) 특히 human embryonic kidney T cell인 293T cell이 가 장 Aroclor1254에 민감한 반응을 나타냈다. 이 사실을 토 대로 293T cell에 12시간 동안 Aroclor1254를 처리했을 경 우 변화하는 단백질을 Two-dimensional Gel Electrophoresis 방법을 사용하여 후보 단백질을 찾아내었으며, 이들 단 백질은 MALDI-TOF & MALDI-TOF/TOF 방법으로 확인 하였다. Aroclor1254에 의해 발현에 변화를 나타낸 단백 질로는 DNA-binding protein, PKD2L, cytosolic inorganic pyrophosphatase, glutathione transferase/fatty-acyl- ethel-ester synthase로 모두 down-regulation 된 것으로 나타났다.
Glutathion S Transferase (GSTs)는 외부로부터 유입된 유해
독성물질로부터 세포를 보호하는 해독 작용의 기능을 가 진 유전자로 알려져 있다.28) GSTs의 활성도가 떨어지거 나 이 효소의 유전자가 결손되어 있을 때 반응성이 강한 대사산물이 glutathione과 결합하지 않은 상태로 소변을 통해 배설되면서 방광암에 대한 감수성이 증가한다고 보 고되었다.29,30) 구체적으로 GSTM1의 경우 GSTM1 A (μ) 표현형을 코딩하는 GSTM1-A와 GSTM1 B (Ψ)를 코딩하 는 GSTM1-B의 두 가지 대립인자로 구분할 수 있는데, 2개의 대립인자가 없는 GSTM1-0 (null type)은 발암물질 을 비활성화시키지 못하여 방광암 감수성이 높아지는 것으로 보고되었다.28,31) Aroclor1254도 293T cell에 유해성 물질로 작용하여 GST의 down-regulation을 유도함으로써 해독작용이 약화될 것으로 생각한다. PKD2L은 PKD2 gene family의 일원으로, PKD2에 돌연변이가 일어나면 상염색체 우성유전질환인 다발성 신낭종(Polycystic kid- ney disease, ADPKD)이 나타난다.32) 또한 kidney cell의 cy- tosol에 존재하는 PKD2는 endoplasmic reticulum으로부터 세포 내로 calcium을 방출하며, plasma membrane에 존재 하는 PKD는 nonselective cation channel의 기능을 가지고 있는 것으로 보고된 바 있다.33) 이러한 결과로 미루어 보 아 Aroclor1254에 의해 down-regulation된 PKD2L이, muta- tion된 PKD2에 의해 나타난 바와 같은 세포 내 기능의 변화가 유발될 가능성을 추측해 볼 수 있을 것으로 생각 한다. PCBs에 의해 293T 세포에 영향을 주는 물질들은 향후 Aroclor1254에 의한 독성여부 확인 시 분자 생물학 적 지표(biomarker)로 사용 가능할 것으로 생각하며, 또한 확보된 단백질을 근거로 PCBs의 노출로 인해 인간에게 나타나는 독성 효과에 대한 작용 메커니즘을 규명하기 위한 기초 자료가 될 것으로 생각한다.
이와 같은 연구를 수행함으로써 얻어진 결과로 자연 환경과 인간생활에 널리 사용되고 있으면서 인체에 직․간접적으로 피해를 입히고 있는 biphenyl의 toxicity를 이해하는 기초자료로 이용되며 또한 biphenyl toxicity에 대한 피해를 줄일 수 있는 방법을 찾는 데도 이용 가능 할 것으로 생각한다.
결 론
PCBs에 노출된 포유동물세포의 단백질 발현 변화를 연구하기 위하여 Aroclor1254를 처리한 293T 세포의 세 포내 단백질을 Two-dimensional Gel Electrophoresis로 분석 하였다. 그 결과 293T cell에서 Aroclor1254로 인해 up-re- gulation되는 단백질과 down-regulation되는 단백질을 알아 낼 수 있었다. 그 중 6개의 spot을 MALDI-TOF & MALDI- Table 1. The proteins were identified by MALDI-TOF &
MALDI-TOF/TOF
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Sample Detected genes by Expression
No. MALDI-TOF/TOF level
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2 DNA-binding protein Decrease
3 PKD2L (Homo sapiens) Decrease
Cytosolic inorganic pyrophosphatase
4 (Homo sapiens) Decrease
Glutathione transferase /
6 fatty-acyl-ethyl-ester synthase Decrease ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
TOF/TOF를 통해 분석하였다. 그 결과 DNA-binding pro- tein, PKD2L, cytosolic inorganic pyrophosphatase, glutathione transferase / fatty-acyl-ethel-ester synthase를 확인할 수 있었으 며 모두 down-regulation 된 것으로 나타났다. Glutathione transferase는 비극성 독성 물질과 결합하여 그 독성을 중 화시키고 산화적 스트레스에 의해 발생한 부산물들을 대사하는 역할을 한다. 그러나 Aroclor1254를 처리함으로 써 세포 내 이 효소의 발현이 감소하였으므로 Aroclor- 1254에 의해 생긴 세포 독성이 회복될 수 없었던 것으로 생각한다. 이는 Aroclor1254가 glutathione s transferase의 발 현 저하를 유도하는 기작을 통하여 세포 내 독성작용을 극복하지 못하고 결과적으로 apoptosis 현상이 일어나게 된 것으로 생각되며, 뇌, 심장, 간, 신장 등 인체의 모든 곳에 존재하는 것으로 알려진 PKD2L의 발현이 저하됨 으로 인해 Aroclor1254가 polycystic kidney disease (PKD)의 후천적 유발원이 될 수 있음을 추측할 수 있다.
감사의 글
본 연구는 과학기술부/한국과학재단 우수연구센터육 성사업(여성질환 연구센터)의 지원과 과학기술부의 바 이오식품소재 기반기술개발사업 지원에 의해 수행되었 습니다.
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