J. of Korean Orthopaedic Research Society Volume 5, Number 2, October, 2002
광고정된 Epidermal Growth Factor가 슬관절 전방십자인대 세포의 증식에 미치는 영향
가톨릭대학교 성모병원 정형외과, 광주보건대학교 의료정보공학과*
권순용・우영균・이화성・정진화・이원희・박용순*
= Abstract =
The Effect of the Photo-immobilized Epidermal Growth Factor on the Proliferation of the Anterior Cruciate Ligament Cell of the Knee
Soon Yong Kwon, M.D., Young Kyun Woo, M.D., Hwa Sung Lee, M.D., Jin Wha Chung, M.D., Won Hee Lee, M.D., Yong Soon Park, Ph.D.*
Department of Orthopedics, St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea, Department of Medical Information Engineering, Kwangju Health College*
Purpose: The purpose of this study is to find out the possibilities of the early treatment via artificial jux- tacrine stimulation by photo-immobilization of growth factor in the anterior cruciate ligament (ACL) injury.
Materials and Methods: Photo-reactive Epidermal Growth Factor (EGF-Az) was synthesized by conjugat- ing EGF with N-(4-azidobenzoyloxy)succinimide and was immobilized onto the polystyrene culture plates by UV irradiation. Human ACL cells (1×105cells/ml, 100 µl/well) were cultured with serum free media in each group (group 1 : no EGF, group 2 : native EGF 2 µg/ml, group 3 : 50 µl EGF-Az immobilization, group 4 : 100 µl EGF-Az immobilization). We observed the changes of cells with long-term culture and compared the difference of cellular response of EGF-treated and non-treated groups. To examine the cellular migration, in vitro wound closure assay was performed.
Results: Cells were proliferated for 3 days. It was not changed significantly after that time. Cellular growth was more remarkable in the photo-immobilized EGF group. In cell migration test, the defect site in the photo- immobilized group was indistinguishable from the non-scratched area after culture for 72 hours, while cell-free area was still clearly visible in the no EGF group.
Conclusion: Photo-immobilized EGF induce rapid proliferation of fibroblasts via artificial juxtacrine stimu- lation. If EGF is immobilized onto bioabsorbable materials such as polyglycolic acid or polylactic acid for clin- ical application, it will contribute to the treatment of ACL.
Key Words: Knee, Anterior cruciate ligament rupture, Photo-immobilization of EGF, Culture of anterior cruci- ate ligament cell
※ 통신저자: 이 화 성
서울시 영등포구 여의도동 6 2 가톨릭대학교 성모병원 정형외과
Tel: 02)3779-1192, Fax: 02)783-0252, E-mail: [email protected]
본 논문은 한국학술진흥재단 2 0 0 1년도 협동연구지원(과제번호 2 0 0 1 - 0 4 2 - F 0 0 0 7 9 )에 의하여 연구되었음.
서 론
슬관절의 전방십자인대는 내측측부인대와 달리 관절 내에 위치하여 창상 치유 기전에 중요한 섬 유소원 혈종 형성이 관절 활액에 의해 희석되며, 생화학적 성분 및 생역학적 차이, 활액막의 영향, 혈액 순환 등 여러 원인으로 손상된 조직의 자연 치유 반응이 저조하다1 , 2 , 3 , 4 , 2 6 )
. 이러한 이유로 전방 십자인대 파열 시 조기에 시행하는 석고 고정이나 단순 일차 봉합술 등으로는 불량한 예후를 보여
1 0 ), 슬개건 등을 이용한 재건술이 일반적인 치료
법으로 시행되어 왔는데, 수술 기법이나 술 후 재 활 과정 등에 따라 결과의 차이를 보이며, 다시 불안정성이 초래되어 재수술을 요하게 되는 경우
가 있다5 , 1 8 , 2 5 ).
최근에 세포성장인자에 대한 연구가 활발히 진 행되면서 세포 증식을 통해 수상 초기에 손상된 인대의 치유를 도모하고자 슬관절 인대와 세포성 장인자의 관련성에 관한 연구들이 진행되었는데
8 , 1 2 , 1 9 , 2 8 , 3 0 )
, 저자들은 E G F를 고정화시켜 인위적으 로 결합형 분비에 의한 지속적인 정보 전달을 일 으키게 함으로써 전방십자인대의 섬유모세포 증식 에 미치는 영향을 파악하여, 수상 초기에 세포 증 식을 유발시켜 전방십자인대 파열을 치료할 수 있 는 새로운 방법을 찾고자 하였다.
연구재료 및 방법
1. 광반응성 N - ( 4 - a z i d o b e n z o y l o x y ) s u c c i n- i m i d e의 합성
광반응성 물질인 4-azidobenzoic acid(9.57 g, 5 8 . 7m m o l )와 N-hydroxy-succinimide(7.43 g, 6 4 . 6m m o l )를 4℃에서 tetrahydrofuran(THF) 150 ml 에용해시킨후, d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e ( D C C , 13.3 g, 64.6 mmol)을 용해시킨 THF 30 m l와 교 반하면서 3시간동안 반응시키고, 25℃에서 1 2시간동 안 반응시켰다. 생성된 흰색 침전물을 여과하여 제거 하고, 얻어진 갈색 액체를 건조시켜 용매인 T H F를 제거하였다. THF : isopropyl alcohol : diisopropyl e t h e r를 1 : 1 : 0.3의 비율로 혼합한 액체를 첨가
하여 녹인 다음 재결정을 시행하였으며, 얻어진 연갈 색 분말은 진공 건조시키고, 남은 용액은 i s o p r o p y l a l c o h o l과 diisopropyl ether만을 이용하여 다시 재결 정을 하였다. 합성된 광반응성 N - ( 4 - a z i d o b e n z o y- l o x y ) s u c c i n i m i d e는 Proton 핵자기공명분광법( 1 H - N M R )과 자외선분광법(UV/VIS spectrometer)을 이용하여 확인하였다.
2. 광반응성 E G F의 합성 및 광고정( p h o t o - i m m o b i l i z a t i o n )
EGF(Human, M.W. 6kD) 0.2 mg을 phosphate-buffered saline(PBS) 0.4 m l에 용해시키고, N-(4-azidobenzoyloxy)succin- i m i d e는 N , N - d i m e t h y l f o r m a m i d e ( D M F ) 1.6 m l에 용해시켰다. 이 두 용액을 얼음물에서 혼합하여 4℃에서 7 2시간동안 반응시키고, 25℃
에서 건조하여 용매를 제거한 다음, 남은 백색 분 말에 PBS 3.6 m l와 증류수 0.4 m l를 첨가하여 광반응성 E G F ( E G F - A z )를 추출하였다. 합성한 E G F - A z를 광고정시키기 위해 E G F - A z / P B S 용액(50 µg /m l)을 polystyrene 배양기판에 다양 한 농도로 각각 도포하고, 차광상태에서 1 2시간 동안 방치하여 완전히 건조시킨 후, 400 nm의 자외선을 5 cm 거리에서 3 0초간 조사하였다.
P B S를 이용하여 수차례 세척하고, 자외선 흡광 기로 세척물에서 E G F - A z가 검출되지 않는 것을 확인한 후, polystyrene 배양기판을 실온에서 건 조시켜 고정이 되도록 하였다.
3. 광고정 EGF(photo-immobilized EGF)의 확인
EGF 항체를 이용한 면역염색법을 행하였는데, 먼 저 E G F를 고정한 polystyrene 배양기판에 0 . 0 2 % NaN3, 3% bovine serum albumin(BSA)을 포함 하는 1 m l P B S를 넣고, 4 ℃에서 2 4시간 반응시켰 다. 배양기판을 P B S로 수차례 세척하고 2 µg /m l 의 anti-EGF antibody를 포 함 하 는 PBS(0.02% NaN3, 3% BSA) 용액을 다시 넣 어 4 ℃에서 1 2시간 반응시켰다. PBS(0.02%
N a N 3 )로 다시 세척하고, 2 µg /m l의 F I T C - conjugated anti-human IgG antibody를 포
함하는 PBS(0.02% NaN3) 용액을 첨가하여 4℃
에서 1 2시간 반응시켰다. PBS와 탈이온수로 수차 례 세척한 후 Inverted fluorescence micro- s c o p e으로 F I T C의 발광 상태를 관찰하였다.
4. 전방십자인대 세포 배양 및 결과 분석
전방십자인대 채취가 가능하였던 환자에게서 인대 를 얻어 잘게 자르고, 10% FBS, nonessential aminoacids(0.1 mM), L-glutamine(4 mM), penicillin(100 U/m l), streptomycin(100 g/m l) , fungizone(0.25 g/m l) 등이 포함된 D u l b e c c o’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)에 담군 후 교 원섬유 분해효소(Collagenase IA 500 mg)를 첨가하 여 세포를 분리시켰다. 4oC에서 1 0분간 1500 rpm으 로 원심분리 후, 다시 배양액으로 처치하여 3 7oC , 5% CO2 조건 하에서 세포배양을 하였다. 세포배 양 후 0.05% trypsin과 0.02% EDTA가 함유 된 P B S로 처치하여 배양된 세포들을 분리하여 1
×1 05 c e l l s /m l의 농도로 세포 현탁액을 제조하였 다. 실험군을 제1군은 배양기판에 E G F가 첨가되 지 않은 군, 제2군은 native EGF 2 µg /m l 첨가 된 군, 제3군은 50 µl EGF-Az를 광고정한 군, 제4군은 100 µl EGF-Az를 광고정한 군으로 분 류하였고, 각 군의 배양기판에 500 µl의 배양액으
로 전처치한 후 세포 현탁액 100 µl씩을 첨가하여 무혈청 상태로 3 7oC, 5% CO2 조건하에 배양을 하였다. EGF 고정군 세포들의 무혈청 세포배양 시 변화를 관찰하기 위해 제4군 세포들의 시간 경 과에 따른 변화를 관찰하였고, 각 군 사이의 세포 증식 정도를 비교하기 위해 배양 1시간, 24시간, 7 2시간 후에 phase contrast microscope으로 관찰한 다음, 각 군의 세포 수를 측정하여 비교하 였다.
5. 세포 이주 검사(cell migration test)
상흔 결손 부위로의 세포 이동에 관한 광고정된 E G F의 효과를 알아보기 위해 제1군과 제4군에 대하여 각각 배양된 세포 군락 중앙부에 노란색 피펫 끝으로 선을 그어 약 0.6 mm 넓이의 결손 부를 만들었다. 배양액으로 세척하여 부유 물질을 제거하고, 37oC, 5% CO2 조건으로 무혈청 세포 배양을 실시한 다음, 배양 2 4시간, 48시간, 72시 간 후 각 군을 관찰하여 결손부의 복원 상태를 비 교하였다.
6. 통계 분석
E G F를 첨가한 각 군에서 7 2시간 배양 후 관찰 되는 세포 수의 증가에 대한 통계학적 분석을 위
Fig. 1. Specta of N-(4-azidobenzoyloxy)succinimide show peak at 3.3 ppm, 7.4 ppm and 8.1 ppm in 1H-NMR(1-A) and at 280 nm in UV spectrometer(1-B).
A B
Fig. 2. Micrographs of the immuno-fluorescence stain of the photo-immobilized EGF with anti-EGF antibody show the decrease of green-colored luminescence according to the decrease of the concentration of the photo-immo- bilized EGF (×100).
(A) 0.5 µgimmoblized EGF (B) 0.25 µgimmoblized EGF (C) 0.2 µgimmoblized EGF (D) 0.1 µgimmoblized EGF (E) 0.05 µgimmoblized EGF (F) 0.025 µgimmoblized EGF
Fig. 3. Photographs of cells with long-term culture in the photo-immobilized EGF group show the proliferation of cells until the post-culture 3 days. But, after that time, there is no significant evidence of the proliferation of cells (×100).
(A) post-culture 1 hour (B) post-culture 1 day (C) post-culture 3 days (D) post-culture 4 days (E) post-culture 5 days
해 paired t-test를 시행하여 통계학적 유의성을 검사하였고, 72시간 배양 후 증가된 각 군 사이 나타나는 결과에 대한 통계학적 유의성을 알아보 기 위해 ANOVA Scheffe’s test를 시행하여 검 정하였다. 각 방법의 유의 수준은 5 %로 하였다.
결 과
1. 광반응성 N - ( 4 - a z i d o b e n z o y l o x y ) s u c c i n- i m i d e의 합성 확인
핵자기공명분광법에 의한 결과 약 7.4 ppm과 8.1 ppm에서 4-azidobenzoic acid의 b e n z e n e 환에서 유래한 상승점과 약 3.3 ppm에서 s u c- c i n i m i d e내의 methylene 기 반응을 의미하는 상승점이 나타났으며, 자외선분광법에 의한 관찰
에서는 약 280 nm 부근에서 azidophenyl 기의 benzene 유래의 피크를 확인할 수 있어(Fig. 1), 4-azidobenzoic acid의 carboxyl 기가 N - h y d r o x y s u c c i n i m i d e와 결합하여 N - ( 4 - a z i- d o b e n z o y l o x y ) s u c c i n i m i d e가 합성되었음을 알 수 있었다.
2 .광반응성 E G F의 광고정 및 면역염색법에 의 한 확인
고정된 E G F는 F I T C와 결합되어 면역염색에서 초록색 반점으로 발광하는데, 관찰 결과 p o l y- styrene 배양기판 표면에 E G F가 고정화되어 발 광하는 것을 확인할 수 있었고, EGF의 도포 농 도가 낮아짐에 따라 발광되는 정도가 적게 관찰되 어 고정되는 E G F의 양이 적어진다는 것을 알 수 있었다(Fig. 2).
Table 1. Number of cultured cells in each group
Group Number of Cells
1 hour 24 hours 72 hours
No EGF 70.6 ± 1.7 71.3 ± 1.2 72.1 ± 1.5
Native EGF 72.5 ± 1.0 73.7 ± 1.6 89.5 ± 2.1
50 µlimmobilized 70.1 ± 1.5 72.8 ± 1.1 107.2 ± 2.5
100 µlimmobilized 72.3 ± 1.3 75.2 ± 1.1 120.2 ± 2.6
p<0.05 Fig. 4. There are different changes in the relative growth rates of cells in each group. The group with the absence of EGF(■) has no significant change. However, the rates in the native EGF group (▲), the 50 µlphoto-immobi- lized EGF group(▼) and the 100 µlphoto-immobilized EGF group(●) are increased. It is showed that the groups with the photo-immobilized EGF have more significant changes than the other group.
Fig. 5. Photographs of cell cultures after scratching in the no EGF group show the incomplete proliferation of cells into the defect site by 72 hours (× 40).
(A) control cultures (B) immediately after scratching (C) 24 hours after scratching (D) 48 hours after scratching (F) 72 hours after scratching
Fig. 6. Photographs of cell cultures after scratching in the photo-immobilized EGF group show that the defect site is nearly covered by the proliferated cells at the post-culture 48 hours and is indistinguishable from the control group at the post-culture 72 hours (× 40).
(A) control cultures (B) immediately after scratching (C) 24 hours after scratching (D) 48 hours after scratching (F) 72 hours after scratching
3. 광고정된 EGF 군의 세포배양 및 각 실험군 의 비교 분석
EGF 광고정군에서 무혈청 세포배양을 한 결 과, 배양 3일까지는 세포들이 증식하는 것을 관찰 할 수 있었으나, 배양 4일 및 5일 후 관찰에서는 뚜렷한 세포들의 증식 소견을 관찰할 수 없었고 (Fig. 3), 배양 초기에 세포의 모양은 전형적인 섬유아세포의 모습을 보이며 배양기 표면에 잘 부 착되어 증식을 하였으나, 시간이 지날수록 세포들 의 모양이 점점 원형으로 변해가고, 직경이 커지 는 것을 관찰할 수 있었다.
각 군의 비교 관찰에서는 제1군은 7 2시간 배양 후에도 세포의 증식이 큰 변화를 보이지 않았으 나, 제2군에서는 세포들의 증식 소견을 관찰할 수 있었고, 1시간 배양 결과에 비해 약 2 1 %의 증식 률을 보였다. 제3군 및 제4군에서는 7 2시간 배양 후 타 군에 비해 세포들이 현저히 증식한 것을 관 찰할 수 있었는데, 각각 53% 및 6 6 %의 증식 소 견을 보여 고정된 E G F의 양에 따라 차이가 나타 나는 것을 알 수 있었다(Table 1, Fig. 4).
paired t-test와 ANOVA Scheffe’s test를 이용한 각 군의 시간별 세포 증식 및 각 군 사이 의 비교에 관한 통계학적 검정에서는 유의성이 있 는 것으로 나타났다( p < 0 . 0 5 ) .
4. 세포 이주 검사
E G F가 첨가되지 않은 군에서는 배양 후 2 4시 간이 지나도 아직 결손부로 세포의 증식이 뚜렷하 지 않았으며, 48시간 후에 세포들이 결손부로 자 라 들어오기 시작하였고, 배양 7 2시간 후에 부분 적으로 세포들의 증식이 일어났으나, 아직 결손부 가 명확히 보이는 것을 관찰할 수 있었다( F i g . 5). EGF 광고정 군에서는 배양 2 4시간 관찰에서 뚜렷하게 결손부로 세포의 증식이 이루어졌으며, 4 8시간 후에는 결손부를 거의 덮을 정도로 증식 이 일어났고, 72시간 관찰에서는 대조군과 구분 할 수 없을 정도로 세포의 증식이 일어난 것을 관 찰할 수 있었다(Fig. 6).
고 찰
인대 및 건의 손상 시 조직의 재생 및 치유의 속도를 높이고, 해부학적 복원을 도모하며 또한 임상적 치료기간을 단축시킬 수 있는 방법으로, 이미 다양한 세포성장인자를 이용한 실험이 시도 되고 있다7 , 9 , 2 1 , 2 4 ). 슬관절에 대해서도 많은 연구가 이루어졌는데, 전방십자인대의 자연 치유 능력 저 하에 대한 설명으로 collagen type I messen- ger RNA의 발현과 DNA 합성률이 낮게 나타나 고, 세포들이 분산되는 양상으로 보이며, 스트레 스 섬유(stress fiber)와 관련이 있는 actin 양이 더 많이 검출되고, 치유 과정 중 발현되는 세포성 장인자에 있어서도 내측측부인대의 경우는 손상 부위와 그 주변으로 광범위하게 basic Fibrob- last Growth Factor (b-FGF), Transform- ing Growth Factor-ß( T G F -ß), Platelet- derived Growth Factor(PDGF) 등이 발현되 나, 전방십자인대의 경우에는 이러한 인자들이 손 상 부위 근처에서만 발현된다는 것이 밝혀졌다
2 0 , 2 3 , 2 9 ). 또한 PDGF, TGF-ß1, b-FGF, EGF
등의 여러 세포성장인자를 이용하여 전방십자인대 및 내측측부인대에서 추출한 섬유모세포 증식을 유도한 결과, 뚜렷한 세포의 증식과 교원질의 생 성을 증가시켰으며8 , 2 8 ), b-FGF를 이용한 동물실 험에서도 수상 초기에 결손부로 신생 혈관이 증식 되어 치유가 촉진되었다1 9 ).
일 반 적 으 로 세 포 성 장 인 자 들 은 내 분 비 (endocrine), 방계분비(paracrine), 자가분비 (autocrine) 기전을 통해 표적세포의 세포막에 있는 수용체와 결합하여 세포내로 내재화( i n t e r- n a l i z a t i o n )가 일어난 후, 세포 내 신호 전달경로 에 의해 정보가 전달되어 유전자 발현을 제어하 고, 세포의 증식이나 분화, 분비 등 다양한 세포 기능을 조절하며 분해되어 소멸한다1 1 ). 따라서 인 체 내 손상된 조직의 치유를 위한 적용 시 외부로 부터 인위적으로 계속 주입이 되지 않는 한 작용 발현에 한계가 있으며, 이러한 문제점들을 해결하 기 위한 연구가 진행되었다. 세포성장인자들 중 E G F는 기존의 알려진 작용기전과 달리 표적세포 의 세포막에서 수용체와 결합된 상태로 세포의 기 능을 조절하는 결합형 분비(juxtacrine stimu-
lation) 기전을 보인다는 사실이 보고되었고1 3 , 2 2 )
, 세포성장인자를 고분자 표면에 고정시켜 세포 증 식을 한 결과, 고정된 인자는 세포 내로 내재화되 지 않고 정보 전달 단백질을 통해 자극을 세포 내 로 전달하며, 내재화에 따른 하류조절( d o w n - r e g u l a t i o n )이 초래되지 않아, 고정된 세포성장 인자의 소모없이 용해상태에서 작용하는 경우보다 장기간에 걸쳐 작용이 지속되는 것으로 밝혀졌다
6 , 1 5 , 1 6 , 1 7 , 2 7 )
.
저자들은 이러한 원리를 처음으로 전방십자인대 에 적용하였는데, EGF를 자외선을 이용하여 광 고정하고, 혈청에 포함되어 있는 다양한 종류의 세포성장인자의 영향을 없애기 위해 무혈청 상태 에서 전방십자인대 세포배양을 시행하였다. 무혈 청 세포배양은 Inoue 등1 4 )에 의하면 2 5 ~ 4 0 %는 무혈청 상태에서 1 0일까지도 배양이 되었으나, 배양 2일에서 4일 사이에 급격히 세포의 증식이 떨어진다고 하였는데, 본 연구에서도 배양 3일까 지는 세포들의 증식을 관찰할 수 있었지만, 그 이 후에는 뚜렷한 변화를 관찰할 수 없었고, 배양 초 기의 전형적인 섬유아세포의 세포 모양이 시간이 지나면서 점점 원형으로 변해가며, 직경이 커지는 것을 볼 수 있었는데, 이는 슬관절 인대 세포의 계대배양 시 내측측부인대는 비교적 방추상 모양 의 원형을 유지하나, 전방십자인대는 원형으로 변 하면서 크기가 커진다고 보고한 Nagineni 등2 3 )의 소견에 부합되었다. 각 군들 사이의 비교에서는 EGF 고정군에서 타 군에 비해 뚜렷한 세포 증식 소견을 보여 전방십자인대에 대한 E G F의 순수한 효과를 증명할 수 있었고, 고정된 E G F의 양에 따라 세포의 증식 정도도 차이가 있는 것으로 관 찰되었다. 이 결과는 고정되는 E G F의 농도에 대 해서 약 130 ng/cm2(0.33 µg/well, diameter 18 nm)이면 단층의 판을 형성하며, 이 농도까지 는 지속적인 세포증식 효과를 보이나, 그 이상에 서는 증식률에 있어서 더 이상 뚜렷한 증가 소견 을 보이지 않았다고 한 Chen 등6 )의 보고와는 다 른데, 정확한 농도와 이에 따른 증식률에 관하여 는 더 상세한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또 한 저자들은 p o l y s t y r e n e을 이용하여 광고정을 시행하였는데, 이것은 생흡수성 고분자 화합물이 아니므로 인체에 적용할 수 없는 문제가 있다. 따
라서 임상적으로 적용하기 위해서는 이에 대한 후 속 연구가 필요할 것으로 사료된다.
결 론
전방십자인대 세포에 대한 광고정 E G F의 세포 증 식 효과를 확인할 수 있었으며, 이와 같은 결합형 분 비 기전을 이용한 세포 증식 효과를 p o l y g l y c o l i c acid 나 polylactic acid 등의 생흡수성 고분자 화합 물을 이용하여 임상에 적용할 경우, 이 기질이 인체 내에서 완전히 흡수될 때까지 세포성장인자의 효과가 지속될 것이므로, 손상된 전방십자인대 치료뿐만 아 니라 생체공학을 이용한 질환 치료에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
R E F E R E N C E S
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