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J. Mushrooms 2016 December, 14(4): 225-231 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2016.14.4. 225 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853
© The Korean Society of Mushroom Science
*Corresponding author E-mail : [email protected]
Tel : +82-31-290-7806, Fax : +82-31-290-7816 Received November 19, 2016
Revised November 28, 2016 Accepted December 21, 2016
국내 시판 식용버섯 열수 추출물의 피부미백 기능 연구
김현재
1· 장병현
1· 박건희
1· 장갑열
2· 박기문
1,*
1
성균관대학교 식품생명공학과
2
국립원예특작과학원
Skin-whitening effects of hot water extract from domestic edible mushrooms
Hyunjae Kim
1, Byunghyun Jang
1, Kunhee Park
1, Gabyeol Jang
2, and Kimoon Park
1,*
1
Department of Food Science & Biotechnology, Sungkyunkwan University, Suwon, Korea
2
National Institute of Horticultural and Herbal Science, Wanju, Korea²
ABSTRACT: Hot water extracts from 16 domestic edible mushrooms including Pleurotus ferulae (Lanzi) X.L. Mao, Lentinula edodes (Berk.) Pegler, and Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow, which are commercially available, were used for determining the cosmetic potential of these mushrooms. In this study, we carried out in vitro functional experiments to determine the inhibitory effects of these extracts on L-DOPA oxidation of tyrosinase and melanin synthesis. Based on the results of these experiments, H. marmoreus (Peck) H.E. Bigelow No. 10 and No. 15 were selected for further analysis. We analyzed the melanin synthesis inhibitory activity, TRP1 and MITF expression via real-time PCR, and Fontana Masson staining in artificial skin Neoderm®-ME. Taken together, we observed that the hot water extract from H. marmoreus (Peck) H.E. Bigelow (No. 15) had better whitening effect than the extracts of other mushrooms. Thus, it can be a potential source of skin-whitening agent.
KEYWORDS: Mushroom, Skin-whitening, Artificial skin, Hypsizygus marmoreus
서 론
현대인들은 건강에 대한 관심, 그 중 젊음과 아름다워 지고자 하는 욕구가 점점 커져가고 있는데, 특히 노화방 지나 미백효과 등에 이용될 수 있는 천연물 소재를 찾는 연구들이 증가 되고 있다(Hwang, 2013). 그의 근거로 2015년도 식품의약품 통계연보를 참고하면, 화장품 사업 의 시장 규모는 8.18 조 원에 달하며 최근 5년 연평균성
장률이 6.70%에 달하는데, 이중 2013년도 기능성화장품 생산액은 2 조 5,638 억 원 정도로 전년도보다 19.3% 증 가한 추세였다(대한화장품협회, 화장품 생산실적 2014).
또한 자연 지향적, 환경 친화적인 소비 경향에 따라 화장 품에 첨가되는 유효 성분 또한 화합물을 대신하는 식물 또는 동물 유래의 천연물을 이용한 소재에 대한 연구가 점차 증가되고 있다(Park, 2009).
이 중 버섯은 미생물 중에서 균류에 속하며, 분류학적으 로는 대부분의 담자균류와 일부의 자낭균류가 속해있다 (Yoo, 2005). 정의로는 눈으로 볼 수 있고 손으로 만질 수 있는 정도로 큰 자실체를 가지며, 유성생식을 하므로 생 식기관인 자실체는 반드시 유성포자를 형성하고, 땅속, 땅 위, 나무 등에서 생육하는 균류를 모두 포함한다(Chang, 1993). 그리고 버섯은 특유한 맛과 향기를 지닌 기호성이 높은 식품이며(Ota, S., 1984) 일반적으로 지질이 적고 당 과 단백질 및 핵산이 풍부하며 특히 Vitamin D의 전구체 인 ergosterol을 함유하고 있어 식용 외에도 일부가 민간 요법이나 한방의약에 쓰이고 있고 어린이와 임산부, 노화 가 시작되는 중년 이후의 사람들에게 유용하다고 알려져 있다(성, 2000). 버섯이 가지는 약리작용으로는 Pleurotus
ferulae의 콜레스테롤저해 및 유해산소 제거 (Hong, 2004), Lentinula edodes (Berk.) Pegler의 항암효과, 혈압 강화 효과, Pleurotus ostreatus의 당뇨 예방 및 뇌혈관 질 환 예방효과(Kim, 2013) 그리고 Hypsizigus marmoreus 의 항종양작용(Tessuro, 1992)등이 있다.
버섯의 향장기능성으로는 Lentinula edodes과 Agaricus blazei Murill의 메탄올 추출물의 항산화능(Qi, 2013), Agaricus blazei Murill 메탄올 추출물의 미백기능성 (Huang, 2014) 등이 있다고 알려져 있으며, 시중에는 Lentinula edodes을 첨가한 anti-ageing, anti-fade 및 lifting 기능성화장품과 Pleurotus ostreatus을 첨가하여 피 부를 생기있게 하거나 주름을 개선해 주는 제품 등이 출 시되었다(Wu, 2016). 그러나 이러한 버섯류의 대한 향장 연구는 약용버섯을 이용한 것이 대부분이었으며, 식용 버 섯의 경우는 메탄올 및 에탄올에 대한 추출물이 주류를 이루고 있다. 따라서 본 연구에서는 Pleurotus ferulae (Lanzi) X.L. Mao 및 Pleurotus ostreatus (Jacq.) P.
Kumm., Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow 등 을 포함한 국내 식용버섯 16 종의 국내 식용버섯들의 열 수 추출물을 이용하여 미백 기능성을 가진 향장 원료로서 의 사용 가능성을 확인 하고자 각 피부세포에서의 MTT assay를 통해 세포 안정성을 평가하고, L-DOPA 산화를 통한 tyrosinase 활성 억제 및 melanin contents formation 실험을 통한 미백 in vitro 실험을 진행한 후 in vivo 실험 을 대체하고자 표피와 멜라닌세포가 재현된 인공피부 (Neoderm®-ME)를 사용하여 real-time PCR 및 melanin contents formation, Fontana-Masson staining을 실시하였다.
재료 및 방법
버섯 열수 추출물 제조
본 실험에서 사용된 버섯은 아위느타리 및 황금송이, 표 고, 양송이, 팽이, 참타리, 새송이, 느타리, 백만송이(흰색), 백만송이(갈색), 신령버섯, 목이, 고기느타리, 맛타리, 흰 색만가닥버섯 그리고 갈색느티만가닥버섯로 수원 소재 이 마트 및 농협하나로 마트에서 구입하였다. 추출물을 제조 하기 위해 16 종의 버섯을 각각 수세 및 세절 후에 g당 20 배의 증류수를 가해 100oC 이상에서 30분간 자비하였 다. 추출물은 Whatman filter paper (No.3)으로 여과한 다음 rotary evaporator (Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Japan)을 통해 감압농축을 한 후 동결건조기(Ilshin, Korea) 를 이용하여 분말화하였고, –20oC에서 보관하며 실험마 다 필요한 농도에 맞춰 사용하였다 (Table 1).
세포주 배양
인체 유래의 keratinocyte cell line인 HaCaT 세포주는 American Type culture Collection (ATCC, USA)에서 그 리고 mouse 유래의 melanoma cell line인 B16F10 세포 주는 한국세포주은행 (KCLB, korea)에서 구입하여 실험 을 진행하였다. 각 세포는 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS)와 1% penicillin-streptomycin(Hyclone, USA)이 첨가된 DMEM medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Hyclone, USA)을 이용하여 37oC, 5%
CO2조건에서 배양하였다.
Table 1. Profile of mushroom extracts
No. Korean Name Species Place of origin Weight (g) Powder (g) Yeild (%)
1 아위느타리 Pleurotus ferulae (Lanzi) X.L. Mao Cheonan, Korea 100.71 3.48 3.46
2 황금송이 Flammulina velutipes (Curt ex. Fr.) Sing Korea 100 3.45 3.45
3 표고 Lentinula edodes (Berk.) Pegler Goesan, Korea 100.51 3.95 3.93
4 양송이 Agaricus bisporus (J. Lange.) Imbach Korea 100.63 4.43 4.40
5 팽이 Flammulina velutipes (Curt ex. Fr.) Sing Hampyeong. Korea 100.19 5.13 5.12
6 참타리 Pleurotus spodoleucus (Fr.) Quél Gwangju, Korea 100.37 1.88 1.87
7 큰느타리 Pleurotus eryngii (DC.) Quél Korea 100.32 2.83 2.82
8 느타리 Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. Pyeongtaek, Korea 100.2 4.37 4.36
9 백만송이(흰색) Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E.bigelow Korea 100.43 2.55 2.54 10 백만송이(갈색) Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E.bigelow Korea 100.22 2.74 2.73 11 신령버섯(건조) Agricus blazei Murill (Dried) Gyeongbuk, Korea 20.04 6.77 33.78
12 목이 Auricularia auricula-judae Hwaseong, Korea 100.48 0.4 0.40
13 고기느타리 Pleurotus (Fr.) Quel. Yeoju, Korea 100.12 3.53 3.53
14 맛타리 Pleurotus sapidus Sacc. Gwangju, Korea 100 3.86 3.86
15 만가닥버섯 Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E.bigelow Yeoju, Korea 100.05 2.73 2.73
16 갈색느티만가닥버섯 Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E.bigelow Hwasun, Korea 100.52 3.06 3.04
Cell viability
측정Cell viability는 Carmicheal 등 (1987)의 방법에 따라 살아있는 세포 내의 mitochondria dehydrogenase와 MTT 와의 반응을 이용하여 실행하였다. 각 세포는 5×104/ml의 농도로 96 well plate (Thermo fisher scientific, USA)에 분주 후, 37oC, 5% CO2 조건에서 24 시간 배양하였다.
배양시에 사용했던 배지를 제거한 후 새로운 배지에 각 버섯 열수추출물을 일정한 농도로 희석하여 분주하고 24 시간동안 배양하였다. 배양이 완료되면 시험 물질이 포함 된 배지를 제거한 후, 5 mg/ml 의 3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) (Sigma, USA) solution을 100 μl 씩 분주하여 37oC, 5%
CO2 상태의 암실에서 incubation 하였다. MTT formazan 이 생성되면 solution을 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, USA)를 100 μl 씩 주입하여 상온에서 5 분간 용해시킨 후 ELISA microplate reader (Biotek, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Cell viability는 다음과 같이 백분율로 계산하였다.
Cell viability (%) = 100 − ( 각 시료의 MT formazan 흡광도 / 무 처리의 MTT formazan 흡광도 ) × 100
L-DOPA oxidation inhibitory activity
각 버섯 열수추출물의 tyrosinase 저해 활성은 Kong 등 (2000)과 권 등 (2015)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 96 well ELISA plate에 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.5)과 각 1000 μg/ml의 버섯 열수추출물 그리 고 0.06 mM의 L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) (Sigma, USA)를 혼합한 뒤 2000 unit/ml tyrosinase를 첨가하여 37oC에서 10분간 반응시켰다. 이후 ELISA microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정 하고, 아래와 같은 식으로 tyrosinase inhibitory rate를 계 산하였다. 공시료액으로는 시료액 대신 0.1 M potassium phospahte buffer (pH 6.5)를 사용하였으며 양성 대조군으 로는 arbutin (Sigma, USA)을 사용하였다.
Inhibitory activity (%) = 100 − ( 각 시료의 반응흡광 도 / 공시료액의 반응 흡광도 ) × 100
Melanin synthesis inhibitory activity
각 버섯 열수추출물의 melanin contents 합성은 Hosoi 등 (1985)의 방법과 유 등 (2009)의 방법을 변형하여 측 정하였다. 즉, melanoma cell line인 B16F10 세포를 6 well plate에 5×105/well 농도로 분주하여 37oC, 5% CO2 incubator에 over night 하였다. 이후 배지를 제거하고 100 nM α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH : Sigma, USA)와 각 농도별 버섯 열수추출물이 첨가된 free-phenol red DMEM (Hyclone, USA)을 분주하여 72
시간 배양하였다. 이 후 trypsinization을 통하여 수거한 pellet을 10% DMSO가 포함된 1 N NaOH으로 60oC로 1 시간 동안 반응시키고, ELISA microplate reader를 이용 하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며 양성 대조군으 로는 arbutin을 사용하였다.
In vitro test on Artificial skin
표피와 멜라닌세포가 재현된 인공 피부 kit (Tegoscience, Korea)인 Neoderm®- ME는 10% FBS와 1% penicillin- streptomycin이 포함된 인공피부 전용배지에 100nM α- MSH와 선행 in vitro 실험에서 선별된 버섯 열수추출물 을 첨가하여 37oC, 5% CO2 상태에서 배양하였다. 시료 는 총 6일 동안 처리하였고 배지는 3일에 한 번씩 교환 하였다.
Melanin synthesis inhibitory activity
Neoderm®-ME의 조직을 10% DMSO가 포함된 1N NaOH용액으로 60oC에서 1시간 반응시키고 ELISA microplate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정 하였으며 양성 대조군으로는 arbuin을 사용하였다.
Real-time PCR
심 등 (2013)의 방법을 응용하여 채집된 조직을 1.5 ml tube에 넣고 Nucleozol® (MARCHE REY-NAGEL GmbH & Co. KG, Germany)을 첨가한 후 pestle을 이용 하여 균질화시켰다. RNA을 용출하기 위해 1 ml의 Nucleozol®당 400 μl의 RNase free water를 넣고, 15초 간 강하게 흔든 후 10분간 실온에 방치하였다. 방치 후 15분간 12,000×g로 원심분리하여 분리된 상층액을 새로 운 1.5 ml tube에 옮겼다. RNA 침전을 위해 isopropyl alcohol (Sigma, USA)을 상층액의 1:1 비율로 첨가하고, 15초간 격렬히 흔든 후 10분간 실온에서 방치하였다. 다 시 12,000×g, 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 남 아있는 RNA pellet에 75% 에탄올 1 mL을 넣고 4oC, 7,500×g, 5분간 원심분리 후 상층액을 제거하는 과정을 총 2회 반복하였다. 에탄올을 완전히 제거한 후 ultra pure water를 첨가하여 micro spectrophotometer (Titertek berthold, Germany)로 농도를 조절하고 reverse transcript 를 통하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 Takara사 의 qPCR master mix시약을 이용하였고 Gene cycler (BioRad, USA)를 통해 37oC에서 15분, 50oC에서 5분, 그 리고 98oC에서 5분으로 각각 enzyme reaction time 및 enzyme inactivation time을 세팅하였다. 합성된 cDNA는 -20oC에 보관하며 필요시 사용했으며, real-time PCR은 SYBR (Takara, Japan) 및 각 각의 관련 gene의 primer (Table 2)를 첨가하여 Thermal cycler dice (Takara, Japan)를 통해 진행하였다.
Paraffin block 제작
정 등(2013)의 방법을 이용하여 10% formalin에 고정 시킨 조직을 24시간 수세한 후 70% 에탄올에 보관하였 다. Nerderm®-ME 조직을 3×4 mm 정도의 크기로 절단 하고 작은 유리병에 담아 80% 에탄올에 1시간 침지시켰 다. 80% 에탄올 용액을 제거한 후 90% 에탄올에 1시간 침지 시키고 다시 100% 에탄올에 넣어 1시간 탈수시켰 다. 1시간 후 ethanol : xylene (3:1) 혼합용액을 넣어 10 분간 침지시키고 ethanol : xylene (1:1) 혼합용액 넣어 10분 동안 침지시킨 다음 ethanol : xylene (1:3) 혼합용액 넣어 10분 동안 침지시켰다. 반응 후 paraffin : xylene (1:3) 혼합용액을 넣어 65oC dry oven에 40분간 침지시키 고 40분 후 paraffin : xylene (1:1) 혼합용액을 넣어 65oC dry oven에 40분간 침지시킨 다음 paraffin : xylene (3:1) 혼합용액을 넣어 65oC dry oven에 40분간 침지시켰다.
Paraffin pure (100%)에 담아 65oC dry oven에 30분간 침 지하는 과정을 2회 반복하였다. 준비된 mold에 glycerin 을 바른 후 약간의 paraffin을 mold에 넣고 핀셋을 이용 하여 조직을 세운 다음 조직위에 카세트를 얹어 그 위에 paraffin 용액을 부어 냉동실에서 20분간 응고시켰다.
Mold와 paraffin을 분리하여 paraffin block을 제조하고 block을 자르기 전까지 냉동실에 보관하였다. Block을 절 단하기 위해서 micro tome(Leica)를 사용하였다. 먼저 세 운 조직이 잘라낸 부분이 나올 때까지 10 μm두께로 trimming하였다. 그런 다음 4 μm 두께로 잘라내고 절단 면은 핀셋을 이용하여 20% 에탄올에 담근 후, 45oC water bath에서 펼쳐진 조직을 slide glass에 부착시킨 후 물기를 건조시켰다.
Fontana-Masson staining
Fontana-Masson 염색은 melanin이 포함된 인공피부인 Neoderm®-ME를 조직 관찰하기 위한 방법으로 Hematoxylin and eosin 염색과정과 같이 deparaffinize 및 수세 후 ammoniacal silver solution 처리 후 20W microwave를 2분간 처리하였다. 이를 다시 증류수 세척 후 0.1% gold chloride를 10분간 처리하였다. 다시 증류 수 세척 후 5% Hypo에 5분간 처리하였다. 다시 증류수 tapping하며 세척하고 Nuclear-fast red를 5분간 처리 한
후 최종적으로 증류수로 가볍게 tapping하고 건조시킨 후 깨끗한 상태에서 cover slip을 덮고 1,500×(Olympus, Japn)에서 촬영하였다(최, 2011).
Statistical analysis
모든 결과는 mean±SD로 나타내었고, 통계처리는 GraphPad Prism (Ver. 5.01)을 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 이용하였으며 평균 차에 대 한 통계적 유의성 검증은 Dunnett’s test를 통해 p < 0.05 수준에서 검증하였다.
결과 및 고찰
Cell viability
각 버섯 열수추출물의 in vitro 세포독성은 세포 내 미토 콘드리아의 NAD(P)H-dependent cellular oxidoreductase enzymes와 MTT 용액의 반응을 이용하여 측정하였으며, 세포 생존율은 human keratinocyte인 HaCaT cell과 mouse melanocyte인 B16F10을 이용하여 버섯 열수추출 물 무 처리군인 control 군을 기준으로 하여 백분율로 나 타냈다. 즉, Fig 1.A.와 같이 keratinocyte의 경우 모든 버 섯 열수 추출물의 cell viability가 모두 90% 이상이었으 며, 특히 양송이 (No. 4)과 목이 (No. 12), 고기느타리버 섯 (No. 13)의 열수 추출물에서는 cell viability가 유의성 있게 증가되었다. Qi 등 (2013)의 표고버섯 메탄올 추출 물과 Banlangsawan 등 (2016)의 느타리 버섯 에탄올 추 출물에서도 처리 용매는 다르지만 버섯 추출물을 처리였 을 때 keratinocyte viability가 크게 감소하지 않는다는 것 을 확인할 수 있었다. 또한 Fig 1.B. 의 melanoma의 경우 모든 열수 추출물의 cell viability가 85% 이상이었으며 유의차는 없었다. 특히, 갈색백만송이버섯 (No. 10) 과 만 가닥버섯 (No. 15)에서는 유의차는 나지 않지만 다른 버 섯 열수 추출물보다 낮은 cell viability를 확인 할 수 있었 다. 이로써 각 버섯 열수추출물의 농도를 1000 μg/ml로 설정하여 실험을 진행하였고 keratinocyte와 melanoma에 대한 세포독성이 없다는 것을 확인할 수 있었다.
L-DOPA oxidation inhibitory activity
Tyrosinase는 세포내의 tyrosine을 L-DOPA (L-3,4- dihydroxyphenylalanine) 및 DOPA-quinone으로 산화시켜 melanin을 생성시키는 주된 효소이다 (Pawelek 등, 1982). L-DOPA 에 1000 μg/ml의 각 버섯 열수 추출물을 처리하고 tyrosinase를 이용하여 공시료를 처리한 control 군을 기준으로 tyrosinase를 통한 L-DOPA oxidation inhibitory rate를 백분율로 계산하였다. Fig. 2와 같이 양 성 대조군인 arbutin 100 μg/ml보다 모두 유의차 있게 높 은 inhibitory activity를 확인 할 수 있었다. 버섯 열수 추 출물의 같은 농도인 1000 μg/ml에서는 arbutin군은 70%
Table 2. Oligonucleotide sequences of primer for real-time PCR
Gene Primer Sequence
Human β- actin
Foward 5'-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3' Reverse 5'-CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3' Human
MITF
Foward 5'-CCGTCTCTCACTGGATTGGTG-3' Reverse 5'-CGTGAATGTGTGTTCATGCCTGG-3' Human
TRP1
Foward 5'-GCTTTTCTCACATGGCACAG-3'
Reverse 5'-GGCTCTTGCAACATTTCCTG-3'
의 저해 효과를 나타내어 버섯 열수 추출물 보다 상대적 으로 우수한 L-DOPA oxidation 저해능이 있었으며, 이는 고순도 기능성 물질과 조추출물간의 차이에 기인한 것으 로 사료된다. Bolormaa 등 (2011)은 흰색느티만가닥 저온 물 추출물을 이용하여 L-DOPA oxidation inhibitory activity를 측정한 결과 저해 효과가 없다고 측정되었는데, 이는 흰색 느티만가닥의 열수 추출물이 저온 추출물 보다 미백에 도움 줄 수 있는 성분이 더 많다는 것으로 추측된 다. 또 Huang 등 (2014)은 1,000 μg/ml 신령 버섯 메탄 올 추출물에서 약 20%에 달하는 L-DOPA oxidation inhibitory activity가 확인되었는데 이 또한 신령 버섯의 열수추출물이 메탄올 추출물보다 더 높은 저해효과를 가 진 것으로 밝혀졌다.
Melanin synthesis inhibitory activity
Melanin 합성 저해활성은 melanoma cell인 B16F10에 서 배양 중에 생기는 melanin 생성량을 흡광도로 측정 할 수 있다. 멜라닌 생성 자극 호르몬인 α-MSH와 공시료만 을 처리한 control군을 기준으로 하여 각 버섯 추출물의 멜라닌 생성 자극 호르몬에 의한 멜라닌 생성의 저해율을 백분율로 계산하였다. 즉, Fig. 3과 같이 아위느타리 (No.
1)과 느타리(참타리) (No. 6), 큰느타리 (No. 7), 흰색백만 송이버섯 (No. 9), 갈색백만송이버섯 (No. 10), 산느타리 (No. 13), 흰색만가닥버섯 (No. 15), 갈색느티만가닥 버섯 열수 추출물 (No. 16)이 1000 μg/ml의 arbutin과 유사한 정도의 높은 melanin synthesis inhibitory rate를 확인할 수 있었다. 특히, 갈색백만송이버섯 (No. 10)과 흰색만가 닥버섯 (No. 15)은 각각 30%, 32%의 melanin inhibitory rate를 보여 높은 미백 효과를 나타낼 것으로 기대할 수 있다. 그 밖에 권(2015)이 사용한 양성대조군인 200 μM arbutin와 비슷한 농도의 50 ppm 큰느타리 매탄올 추출물 의 melanin synthesis inhibitory rate를 비교해 보았을 때, 큰느타리의 메탄올 추출물이 본 연구에서 사용한 열수추 출물보다 조금 더 우수한 효과가 있는 것으로 보고하고 있으며 huang 등(2014)의 연구결과에서도 신령버섯 메탄
Fig. 1. Cell viability of mushroom extracts in MTT assay (A)
HaCaT, (B) B16F10
Concentration of each mushroom extract treated is 1000 μg/ml 1. Pleurotusferulae (Lanzi) X.L. Mao, 2. Flammulina velutipes (Curt ex. Fr.) Sing, 3. Lentinula edodes (Berk.) Pegler, 4.
Agaricus bisporus (J. Lange.) Imbach, 5. Flammulina velutipes
(Curt ex. Fr.) Sing, 6. Pleurotus spodoleucus (Fr.) Quel, 7.Pleurotus eryngii (DC.) Quel, 8. Pleurotus ostreatus (Jacq.) P.
Kumm., 9. Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 10.
Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 11. Agaricus blazei Murill, 12. Auricularia auricula-judae, 13. Pleurotus ostreaus (Jacq.ex Fr.) Quel. 14. Pleurotus sapidus Sacc., 15.
Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 16. Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow,
C. Control (Not treated)
*P < 0.05 (control : each mushroom extract)
Fig. 2. L-dopa anti-oxidant inhibitory activity of mushroom
hot water extractConcentration of each mushroom extract treated is 1000 μg/ml 1. Pleurotusferulae (Lanzi) X.L. Mao, 2. Flammulina velutipes (Curt ex. Fr.) Sing, 3. Lentinula edodes (Berk.) Pegler, 4.
Agaricus bisporus (J. Lange.) Imbach, 5. Flammulina velutipes
(Curt ex. Fr.) Sing, 6. Pleurotus spodoleucus (Fr.) Quel, 7.Pleurotus eryngii (DC.) Quel, 8. Pleurotus ostreatus (Jacq.) P.
Kumm., 9. Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 10.
Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 11. Agaricus blazei Murill, 12. Auricularia auricula-judae, 13. Pleurotus ostreaus (Jacq.ex Fr.) Quel. 14. Pleurotus sapidus Sacc., 15.
Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 16. Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow,
C. Control (Not treated)
AH. Arbutin (1000 μg/ml), AL. Arbutin (100 μg/ml)
*P < 0.05 (AL : each mushroom extract)
**P < 0.01 (AL : AH)
올 추출물이 열수추출물 보다 melanin 생성을 억제할 수 있는 것으로 판단되었으며 향 후 추출용매에 따른 버섯 추출물의 melanin 생성억제 효과는 좀 더 연구가 진행되 어야 할 것으로 사료되었다.
In vitro test on Artificial skin
선행한 실험 결과를 참고로 갈색백만송이버섯 (No. 10) 과 흰색만가닥버섯 (No. 15) 열수 추출물을 선별하여 in vivo 실험을 대신할 수 있는 인공피부 in vitro 실험을 진 행하였다. 버섯 열수 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 사람 유래의 표피와 melanocyte가 구현된 Neoderm®-
ME를 이용하여 melanin synthesis inhibitory activity, Fontana-masson염색과 real-time PCR을 수행하였다.
Melanin synthesis inhibitory activity는 피부의 색소 침착 의 최종 산물인 melanin을 직접 수거하여 일정시약에 녹 여 흡광도를 측정하는 것으로써 Fig 4.A와 같이 α-MSH 에 무 처리군인 control을 기준하여 계산하였을 때, 1000 μg/ml의 갈색백만송이버섯과 1000 μg/ml의 흰색만가닥버 섯 (No. 15) 열수 추출물은 양성대조군인 1000 μg/ml arbutin과 유사한 melanin 합성 저해 활성을 확인할 수 있었다. 또한 조직 내에서 합성된 melanin은 Fontana- Masson 염색을 통하여 육안으로 확인한 결과 크기가 크 고 다량의 melanin이 존재하는 control과 달리 갈색백만 송이버섯 (No. 10)과 흰색만가닥버섯 (No. 15) 열수 추출 물은 양성 대조군인 arbutin과 같이 melanin의 입자가 작 아지고 수가 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 4.B). Fig. 4.
C.는 real-time PCR을 측정하여 housekeeping gene인 β- actin의 Cp값을 기준으로 ratio를 계산한 결과로 melanin synthesis pathway 중 5,6-Dihydroxyindole–2-carboxylic acid를 Indole-5,6-quinone carboxylic acid로 변환시키는 중요인자 중 하나인 tyrosinase related protein 1 (TRP1) 의 발현이 흰색만가닥 (No. 15) 열수 추출물을 처리한 군 에서 가장 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또 synthesis pathway 중 tyrosinase와 TRP1, TRP2 생성에 관여하는 MITF의 발현 역시 흰색만가닥버섯 (No. 15)열수 추출물
Fig. 3. Melanin synthesis inhibitory activity of mushroom
hot water extract on B16F10
(A) Macroscopic view of melanocyte pellet treating the hot water extract of Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow (NO. 15), (B) Melanin synthesis inhibitory rates, All B16F10 except for C0 were cultured with α-MSH and concentration of each mushroom extract treated is 1000 μg/ml
1. Pleurotusferulae (Lanzi) X.L. Mao, 2. Flammulina velutipes (Curt ex. Fr.) Sing, 3. Lentinula edodes (Berk.) Pegler, 4.
Agaricus bisporus (J. Lange.) Imbach, 5. Flammulina velutipes
(Curt ex. Fr.) Sing, 6. Pleurotus spodoleucus (Fr.) Quel, 7.Pleurotus eryngii (DC.) Quel, 8. Pleurotus ostreatus (Jacq.) P.
Kumm., 9. Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 10.
Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 11. Agaricus blazei Murill, 12. Auricularia auricula-judae, 13. Pleurotus ostreaus (Jacq.ex Fr.) Quel. 14. Pleurotus sapidus Sacc., 15.
Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 16. Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow,
C. Control (Not treated),
C0. (Not added α-MSH and not treated)
AH. Arbutin (1000 μg/ml), AL. Arbutin (100 μg/ml)
*P < 0.05 (AH : each mushroom extract; no significant change)
Fig. 4. Whitening effect of mushroom hot water extract on
artificial skin.(A) Melanin synthesis inhibitory rates on Neoderm®-ME, (B) Fontana-Masson staining (1,500 ×), (C) Real-time PCR, All Neoderm®-ME were cultured with α-MSH and concentration of each mushroom extract treated is 1000μg/ml
C. Control (Not treated), AH. Arbutin (1000 μg/ml) 10. Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow, 15. Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow
**P < 0.01 (control : each mushroom extract)
***P < 0.001 (control : each mushroom extract)
을 처리한 군에서 가장 억제 되는 것을 알 수 있었다.
Wu 등 (2016)과 Hyde 등 (2010)의 결과에서 보듯이 미 백 기능성화장품에 사용되고 있는 버섯으로는 식용버섯인 Lentinula edodes 이 외에 약용버섯인 Cordyceps sinensis 와 Schizophyllum commune, Inonotus obliquus 등이 사 용되고 있다. 본 연구 결과, 식용으로 시판되고 있는 흰 색만가닥버섯과 갈색백만송이버섯 열수추출물에서도 Lentinula edodes와 Agaricus blazei Murill을 포함한 14 종의 버섯 보다 높은 피부미백활성을 확인하였고, 인공 피부를 이용한 실험에서도 그 효능을 확인할 수 있었다.
앞으로 흰색만가닥버섯과 갈색백만송이버섯의 용매별 추 출물 및 성분의 분석 등 추가적인 실험을 통해 추출물 내의 어떠한 물질이 melanin synthesis pathway에 직접 적인 활성에 관여하는지 증명함으로써 미백 기능성에 대 한 각 버섯 추출물의 활용성이 더욱 증대 될 것으로 판 단된다.
적 요
국내시판 식용버섯의 16종의 열수 추출물을 이용하여 L-DOPA oxidation activity, melanin 합성 억제활성을 통해 미백에 가장 효능이 우수한 버섯으로 갈색백만송 이버섯 (No. 10)과 흰색만가닥버섯 (No. 15)를 선별하 였다. 또 멜라닌 세포와 표피가 재현된 인공피부를 이용 하여 이 두 가지 버섯 열수 추출물의 미백 효과를 확인 한 결과 흰색만가닥버섯 (No. 15)이 가장 우수함을 확 인하였다.
감사의 말
본 연구는 농촌진흥청 연구 사업(PJ010223)의 지원에 의해 수행한 연구 결과로 지원에 감사드립니다.
