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접수▸2010년 3월 2일 수정▸2010년 3월 16일 채택▸2010년 3월 22일▒
교신저자 마진열, 대전광역시 유성구 엑스포로 483, 한국한의학연구원 신한방제제연구센터 Tel +82-42-868-9466 Fax +82-42-868-9573 E-mail [email protected]Lactobacillus fermentum
으로 발효한 쌍화탕의파골 세포 분화와 난소 적출한 랫트의 골다공증에 미치는 영향
심기석, 이지혜, 이재훈, 마진열
한국한의학연구원 신한방제제연구센터Effect of Ssangwha-tang Fermented by Lactobacillus fermentum on Osteoclast Differentiation and Osteoporosis of Ovariectomized Rats
Kishuk Shim, Jihye Lee, Jaehoon Lee, Jinyeul Ma
Center for Herbal Medicine Improvement Research, Korea Institute of Oriental Medicine
Objective : Ssangwha-tang is a traditional medicine formula widely prescribed for a decrease of fatigue after an illness in Korea. The aim of this study is to investigate the effect of Ssangwha-tang fermented by Lactobacillus fermentum (SF) on osteoclast differentiation in vitro and on bone metabolism of an ovariectomized rat in vivo.
Methods : Tartrate-resistant acid phosphatase activity and staining were applied to evaluate the formation of osteoclasts. Ovariectomized rats were orally administrated with SF (30 ㎖/㎏/day) for 12 weeks. Serum aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, alkaline phosphatase, total cholesterol, high-density lipoprotein-cholesterol, low-density lipoprotein-cholesterol, triglyceride, phosphate, calcium levels were determined.
Effect of SF on bone loss were studied by histological analysis and the measurement of bone mineral density.
Results : SF significantly inhibited tartrate-resistant acid phosphatase activity and formation of osteoclasts in RAW264.7 cells stimulated by receptor activator for nuclear factor κB (NF-κB) ligand (RANKL). In addition, SF significantly decreased the level of triglyceride and increased the level of low-density lipoprotein. Moreover, the decrease of trabeculae of the femur was partially prevented in ovariectomized rats administrated with SF.
Conclusions : SF treatment could prevent ovariectomy induced bone loss and its effects could be medicated by the inhibition of osteoclastogenesis.
keywords : Ssangwha-tang, Lactobacillus fermentum, Osteoclast differentiation, Ovariectomy, Bone mineral density
I. 서 론
조골 세포에 의한 골형성과 파골세포에 의한 골흡수는 골의 구조와 밀도를 유지하는 골개조 작용을 구성하며 연속
적인 두 과정의 상대적인 균형은 골구조를 결정한다. 에스 트로겐 부족과 노화는 성인에서 상대적인 골흡수 증가를 유 발하는 주요 요인으로 골개조 작용에 불균형을 일으켜 골의 미세 구조 약화, 골밀도 감소와 골절의 위험을 증가시키는 골다공증을 유발한다
1,2)
.골다공증은 특히 폐경 후 에스트로겐 결핍으로 인하여 여성에서 발생빈도가 높다. 폐경 후 에스트로겐 결핍은 에 스트로겐에 의해 조절되는 파골 세포 수를 증가시켜 골흡수
와 골교체율 증가로 인한 폐경성 골다공증을 일으킨다
3)
. 현 재 폐경성 골다공증 예방과 치료 방법으로 에스트로겐 보충 요법(estrogen replacement treatment), 칼슘 보충제, 비 타민 D 대사산물, bisphosphonate 및 불소 요법 등이 사용 되고 있으나 부작용과 위험성이 제기되고 있다. 따라서, 최 근에는 이런 부작용이 적은 치료제 개발로 천연물이나 약용 식물에 기초하여 장기간 복용할 수 있고 상대적으로 부작용 이 적은 전통 의약에 대한 연구가 관심을 받고 있다4-6)
.쌍화탕은 동의보감에 기록되어 있는 처방으로 피로 회복, 병후 허약할 때 효과가 있다고 알려져 있으며 현대에선 해 열, 항염증, 진통 효과 등이 밝혀졌다
7,8)
. 최근, 녹용을 가미 한 쌍화탕이 조골세포의 성장과 콜라겐 생성을 증가시키며 난소 적출 랫트의 대퇴골 골밀도를 증가시킨다고 보고되어 쌍화탕의 골다공증 치료 효과가 제안된 바 있다9)
.한방에선 약재 내 활성 성분의 추출이나 효능을 향상시 키려는 목적으로 법제란 가공법을 사용하며 이중에서 고체 나 액체 발효원 안의 독특한 미생물이나 효소를 이용하여 한약재를 발효하는 발효법이 있다. 한약재 안에 주요 성분 인 이소플라본은 배당체의 형태로 있으나 섭취 후 소장에서 흡수될 수 없어 장내 미생물에 의해 무배당체로 전환되는 과정을 거친다. 이런 전환은 무배당체의 혈액 내로 흡수율 과 생체 이용률을 증가시킨다고 알려져 장내 미생물을 이용 한 활성 성분의 전환에 대한 연구가 주목을 받고 있다
10-11)
. 하지만 아직까지 미생물 발효를 한 발효 쌍화탕의 골흡수를 일으키는 파골 세포의 분화와 형성 또는in vivo 골다공증 모델에서 효능을 확인한 연구는 보고된 바가 없다. 따라서, 본 연구에서는 receptor activator of nuclear factor κ B(NF-κB) ligand(RANKL)에 의해 파골 세포로 분화하 는 RAW264.7 세포를 이용하여 발효 쌍화탕의 파골 세포 형성에 대한 효과를 연구하였다. 또한, 갱년기 질환의 대표 적인 동물 모델인 난소 적출 랫트 모델을 사용하여 발효 쌍 화탕의 골다공증에 대한in vivo 효능을 연구하였다.Ⅱ. 재료 및 방법
1. 실험 동물 및 시험군의 구성
랫트 암컷(㈜오리엔트, 서울시 금천구 가산동 459-24) 8 주령을 사용하였다. 동물 입수 시 외관을 육안으로 검사한 후, 7일간 동물실에서 순화시키고 난소 적출술을 시행하였 다. 난소 적출 7일 후, 군분리하여 건강한 동물 중 27마리를
선별하여 실험에 사용하였다. 동물의 군분리는 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 순화 기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정 후, 5 g간격으로 구분하여 각각의 평균 체중에 가까운 동물을 선택하였다. 이렇게 선택한 동물을 9마리씩 균등한 체중으로 분배되도록 순위화한 체중에 바탕하여 무 작위적으로 분배하였다. 동물의 개체 식별로 피모의 색소염 색법과 개체식별카드 표시법을 실시하였다.
2. 시험 물질 조제 및 투여
쌍화탕은 1첩을 기준으로 50첩을 제조하였고 한약재 구 성은 작약(Paeoniae Radix) 468.5 g, 숙지황(Rehmann- iae Radix et Rhizoma Preparata) 187.5 g, 황기 (Astragali Radix) 187.5 g, 당귀(Angelicae Gigantis Radix) 187.5 g, 천궁(Cnidii Rhizoma) 187.5 g, 계피 (Cinnamomi Cortex) 140.5 g, 생강(Zingiberis Rhizoma Siccus) 74.5 g, 대조(Zizyphus jujuba var. inermis Rehder) 100 g이다. 모든 한약재는 신흥제약부설연구소에 서 검사하여 류수한방제약사에서 판매하는 것 중 대한약전 에 기술된 각각 약재 항목에 적합한 것을 엄선하여 사용하 였고 전탕 추출법(경서추출기 cosmos-600, 한국)에 의해 시험물질을 조제하였다. 총 한약재 함량은 1674 g으로 16740 ㎖의 증류수에 넣어 150분간 열탕 추출한 후, standard testing sieve(Aperture 500 ㎛와 150 ㎛)를 이 용하여 시험물질을 여과하였다. 여과한 시험 물질에 150 ㎖ of Lactobacillus fermentum(105 CFU/㎖)을 첨가하여 37°C에서 48시간 동안 발효시킨 뒤 standard testing sieve로 여과하였다. 이런 시험 물질을 동결 건조시킨 후 사용하기 전까지 4°C에 보관하였다.
각각의 시험물질은 일일 임상용량을 기준으로 12주간 투 여하였으며(30 ㎖/㎏, 1회/일), 배부피부 고정법으로 실험 동물을 고정하고 경구투여용 일회용 존데(Fujigami, Japan)와 주사관을 이용하여 위 내에 강제 경구 투여하였 다. 대조군(C) 및 음성대조군(NC)은 동일 용량의 증류수를 투여하였다<Table 1>.
Group Number
of animals Treatment Dose
(㎖/㎏/day)
C 9 operated rats 30
NC 9 ovariectomized rats 30
SF 9 ovariectomized rats treated with Ssangwha-tang fermented by
Lactobacillus fermentum 30
<Table 1> Experimental Design of Animals
3. 혈구 및 혈액 생화학적 검사
혈구 검사는 혈구 분석기 coulter counter (Coulter Co., Miami, FL, USA)를 사용하여 white blood cell (WBC), red blood cell (RBC), hemoglobin (HGB), hematocrit (HCT), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), mean corpuscular hemoglobin(MCH), mean corpuscular volume (MCV), platelet (PLT), lymphocyte (LY), monocyte (MO), granulocyte (GR) 를 측정하였다.
생화학적 검사는 생화학분석기(Hitachi7080, Japan)를 사용하여 혈액 내 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosph- atase (ALP), total cholesterol, high-density lipopro- tein (HDL)-cholesterol, low-density lipoprotein (LDL)-cholesterol, triglyceride, phosphorus, calcium 농도를 측정하였다.
4. 골밀도 측정 및 소주골 면적 분석
동물 부검 시, 우측 대퇴골을 적출하여 근육을 제거하고 10% 포르말린에 7일간 고정하였다. 골밀도 측정은 포르말 린을 제거한 후 Dual energy X-ray Absorption(LUNAR Corp. PIXI mus, Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였다. 적출한 대퇴골을 10% 포르 말린에 고정한 후, formic acid에서 탈회시킨 뒤 70% 알코 올에서 100% 알코올과 아세톤에 이르는 단계별 탈수과정 을 거쳐 자일렌으로 청명하고 파라핀 포매를 시행하였다.
파라핀 포매된 골조직을 3 ㎛로 절단하고 hematoxyline
& eosin(H&E)염색을 실시하였다. 광학현미경(Nikon eclipse 80i, Nikon, Japan)으로 조직 관찰 후 조직의 슬라 이드 사진을 이용하여 소주골(trabeculae bone mass)의 소실 정도를 분석하였다.
5. 세포 배양 및 파골 세포 분화 유도
RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, MA, USA)에서 분양 받아 사용하였 고 세포 배양에 사용된 시약은 모두 Invitrogen(NY, USA)에서 구입하였다. 세포의 성장 배지로 10% Fetal bovine serum(FBS)가 든 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)을 사용하였고 분화 배지로 100 ng/㎖
receptor activator of nuclear factor κB (NF-κB) ligand(RANKL)(R&D Systems Inc., MN, USA)가 들 어간 α-MEM(10% FBS, 100 units/㎖ penicillin, 100 ㎎ /㎖ streptomycin)을 사용하였다. 모든 배지는 매 2-3일마 다 교체하였다.
6. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색 및 활성 측정
파골세포를 10% 포르말린으로 10분 그리고 에탄올/아 세톤(1:1)으로 1분 동안 각각 고정시키고 Leukocyte Acid Phosphatase Kit 387-A (Sigma, MO, USA)을 사용하 여 TRAP 염색을 하였다. TRAP 활성 측정을 위해서 세포 를 고정시킨 후, 50 mM citrate buffer(pH4.6, 10 mM sodium tartrate, 5 mMp-nitrophenylphosphat e)와 1 시간 동안 37°C에서 배양하였다. 새 plate에 효소 믹스처를 옮긴 후 동일한 양의 0.1 N NaOH와 섞고 410 ㎚ 흡광도를 측정하였다. TRAP 양성인 다핵성 파골 세포의 사진은 DP Controller(Olympus Optical, Japan)을 사용하여 얻었다.
7. 통계 처리
본 연구의 통계 분석은 SPSS 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하였다. 대조군과 시험 물질 투 여군 사이의 통계학적 유의성은 Duncan’s test로 검정하 였고,p<0.05를 실험군 간의 유의성 있는 차이로 판정하였 다.
Ⅲ. 결 과
1. TRAP 염색과 활성
RAW264.7 세포는 RANKL 처리시 파골 세포 분화의 마커인 TRAP 활성 증가를 보이며 분화되어 다핵성 파골 세포를 형성한다. 발효 쌍화탕의 파골 세포 분화에 대한 효 과를 알기 위해 RANKL로 분화를 유도한 후 발효 쌍화탕 을 처리하고, 파골 세포의 분화 마커인 TRAP 활성과 TRAP 양성인 다핵성 파골세포의 형성을 확인하는 TRAP 염색을 실시하였다. TRAP 활성은 발효 쌍화탕의 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였고 200 μg/㎖에서 유 의성 있게 감소되는 것이 확인되었다<Figure 1A>. 또한,
다핵성 파골 세포의 형성이 농도 의존적으로 감소하는 것이 TRAP 염색으로 확인되었다<Figure 1B>.
<Figure 1>
(A) Effect of
Ssangwha-tang
fermented byLactobacillus fermentum
(SF) on RANKL-induced TRAP activity and(B) Formation of TRAP-positive multinucleated osteoclasts were evaluated in RAW264.7 cells.
RAW264.7 cells were plated in a 96-well plate at a density of 1 × 103cells/well. The cells were incubated with SF for 3 days and multinucleated osteoclasts were observed under a microscope. *p<0.05.
2. 체중 및 장기 무게 측정
파골 세포 형성을 억제하는 발효 쌍화탕의 효능을 검증 하기 위해 난소 적출 모델에 12 주간 발효 쌍화탕을 투여하 였다. 시험 기간 중 시험 물질 투여에 의한 이상 증상이나 사망동물은 관찰되지 않았다. 각 주령에서 체중의 변화를 대조군과 비교한 결과, 난소 적출 1주 후부터 난소 적출한 시험 동물의 체중이 대조군에 비해 유의성 있게 증가되었으 나 발효 쌍화탕 투여로 이러한 체중 증가에서 변화를 보이 진 않았다<Figure 2>. 시험 물질 투여 종료 후 각 동물에 서 적출한 9가지 장기(자궁, 뇌, 갑상선, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 부신)에서 육안적 이상 변화는 관찰되지 않았다. 또한, 적출한 장기의 무게를 측정하여 음성대조군과 비교 시 대조 군의 자궁 무게는 약 84% 유의성 있는 차이를 보였다. 하지 만, 다른 장기들의 무게는 대조군과 비교시 각 군간에서 큰 차이를 보이지 않았다<Table 2>.
<Figure 2> Changes of body weight in ovariectomized rats during administration of
Ssangwha-tang
fermented byLactobacillus fermentum
.C NC SF
Uterus 0.69** + 0.21 0.11 + 0.02 0.11 + 0.02 Brain 1.98 + 0.10 2.00 + 0.10 2.00 + 0.10 Hypophysis 0.016 + 0.003 0.013 + 0.002 0.013 + 0.0017
Lung 1.50 + 0.15 1.42 + 0.14 1.50 + 0.14 Heart 1.14 + 0.11 1.10 + 0.10 1.17 + 0.14 Liver 8.71 + 0.72 8.17 + 1.11 9.10 + 0.51 Spleen 0.66 + 0.14 0.63 + 0.07 0.71 + 0.11 Kidney (left) 1.07 + 0.11 0.96 + 0.10 1.08 + 0.07 Kidney (right) 1.07 + 0.12 0.95 + 0.11 1.06 + 0.05 Adrenal gland (left) 0.04 + 0.01 0.03 + 0.01 0.03 + 0.01 Adrenal gland (right) 0.04 + 0.01 0.02 + 0.01 0.03 + 0.01
<Table 2> Organ Weight of Rats at 12 Weeks after Administration of SF (n=9)
Values were expressed as mean ± SD. **p<0.01, significantly different from negative control group; C, Control group; NC, Negative control group; SF, Ssangwha-tang fermented by Lactobacillus fermentum
3. 혈구 및 혈액 생화학적 검사
시험 물질 투여 종료 후 혈액 분석기를 이용하여 각 동물 의 혈액을 분석한 결과 대조군의 triglyceride의 농도가 음 성대조군과 비교하여 유의성 있는 차이를 보였다. 그리고 발효 쌍화탕군에선 LDL-cholesterol와 triglyceride의 농 도가 유의성 있는 차이를 보였다<Table 3>. 혈액 생화학 적 분석에서 음성대조군과 비교하여 차이를 보이는 다른 지 표는 없었다 또한, 혈구 분석 시 음성대조군과 비교하여 대 조군 그리고 발효 쌍화탕 투여군에서 차이를 보이는 지표는 없었다(data not shown).
C NC SF AST 43.09 + 13.79 42.86 + 9.39 36.37 + 10.37 ALT 120.88 + 31.08 120.94 + 29.77 112.13 + 15.68 ALP 171.11 + 73.20 176.68 + 56.37 206.99 + 61.27 Total cholesterol
(㎎/dl) 107.78 + 27.81 118.56 + 10.42 145.00 + 30.40 HDL-cholesterol
(㎎/dl) 34.81 + 6.61 37.20 + 1.99 38.66 + 3.99 LDL-cholesterol
(㎎/dl) 6.98 + 2.09 7.79 + 0.98 10.86* + 2.97 Triglyceride (㎎/dl) 58.00* + 21.33 81.80 + 19.74 54.14* + 18.60
Phosphate (㎎/dl) 8.79 + 0.87 8.66 + 1.04 9.02 + 0.78 Calcium
(㎎/dl) 11.98 + 0.81 11.59 + 0.43 11.64 + 0.33
<Table 3> Biochemical Parameters in Serum of Ovariectomized Rats after 12 Weeks Administration of SF (n=9)
Values were expressed as mean ± S.D. *p<0.05, significantly different from negative control group; C, Control group; NC, Negative control group; SF, Ssangwha-tang fermented by Lactobacillus fermentum
4. 골밀도 측정 및 조직 소견
발효 쌍화탕 투여 시 난소 적출로 인한 골밀도 감소가 개선되는 지를 확인하기 위하여, 시험 물질 투여 후 흉골과 대퇴골의 골밀도를 측정하였다. 대조군에 비해 음성대조군 은 유의한 수준의 골밀도 감소를 보였고 발효 쌍화탕 투여 군에서 난소 적출로 인하여 감소한 대퇴골의 골밀도(bone mineral density)가 증가하는 경향을 보였다<Table 4>.
시험물질 투여 후 골조직학적 분석을 하였고 대조군에선 대퇴골의 골지주(Trabeculae), 골수 내 지방축적(Fatty accumulation)이 정상으로 관찰되었으나, 음성대조군에서 는 골지주가 현저히 감소되었고 골수 내 지방 축적이 현저 히 증가하였다<Figure 3A>. 그러나, 발효 쌍화탕 투여군 은 음성대조군과 비교하여 골지주의 감소가 미세하게 개선 되었다. 한편, 대조군에서는 정상적인 자궁조직 소견이 관 찰되었으나 난소 적출군에서 자궁위축이 관찰되었고 발효 쌍화탕 투여로 자궁 위축에 변화는 없었다<Figure 3B>.
C NC SF
Sternum (g/cm2) 0.062* + 0.002 0.053 + 0.001 0.055 + 0.001 Femur (g/cm2) 0.238* + 0.005 0.208 + 0.004 0.215 + 0.003
<Table 4> Effect of SF on Bone Mineral Density of Ovariectomized Rats (n=9)
Values were expressed as mean ± standard error. *p<0.05, significantly different from negative control group; *p<0.05, significantly different from negative control group; C, Control group; NC, Negative control group; SF, Ssangwha-tang fermented by Lactobacillus fermentum
<Figure 3> Histomorphological analysis of femur (a) and uterus (b) in rats (H&E stain, x20).
Representative photomicrograph from control (C), negative control (NC) and Ssangwha-tang fermented by Lactobacillus fermentum (SF) group.
IV. 고찰 및 결론
본 연구에서 발효 쌍화탕은 TRAP 활성과 다핵성 파골 세포 형성을 억제시켰고 난소 적출로 인한 골밀도 감소를 부분적으로 억제시키는 효능을 보였다.
난소 적출 랫트 모델은 골다공증 연구에서 일반적으로 널리 사용되며 에스트로겐 호르몬 결핍으로 파골 세포의 활 성을 증가시켜 골다공증을 유발하는 동물 모델이다. 난소 적출 랫트는 칼슘의 장내 흡수율 저하, 체중 증가 그리고 골 미네랄 감소 등의 특징을 보인다
12,13)
. 또한, 난소 적출은 에스트로겐 결핍으로 자궁 위축을 유발하고 에스트로겐 투 여 시 자궁 위축이 감소한다는 보고도 있다14,15)
. 본 연구에 서 발효 쌍화탕 투여는 난소 적출로 인한 자궁 무게 및 수축 에 있어서 변화를 가져오진 않았지만, 대조군과 비교 시 난 소 적출로 인하여 현저하게 감소된 대퇴골 골밀도를 증가시 키는 경향을 보였다. 또한, 대퇴골의 조직 분석에서 발효 쌍 화탕은 골지주 감소를 개선하는 효과를 나타내어 골밀도의 결과를 지지하고 있다. 따라서, 발효 쌍화탕은 에스트로겐 결핍으로 유발된 대사 변화 중에서 골 대사를 부분적으로 개선하는 효과를 보이나 다른 대사 변화에는 적은 영향을 주어 이는 발효 쌍화탕을 항골다공증 치료제로 활용하기 위 해 고려해야 할 점으로 사료된다.한방에선 생약 내 유효 성분의 추출이나 활성 증가를 목 적으로 발효를 한다. 발효는 발효원안의 독특한 미생물이나 효소를 통해 유효 성분에서 활성 성분으로 전환을 증가시키 며 이는 생리 활성 성분의 체내 흡수와 생체 이용률 증가로 이어져 활성 성분의 효능에 기여한다고 알려졌다
10,11)
. 따라 서, 골밀도를 증가시키며 골량의 감소를 완화시키는 효과를 일부분 보이는 발효 쌍화탕은 유산균 발효를 통하여 전환된생리 활성 성분의 흡수율과 이용률이 증가되어 항골다공증 효과를 나타내는 것으로 추정된다.
최근에 쌍화탕을 구성하는 한약재 중에서 일부 한약재 (백작약이나 숙지황)의 추출물이 파골 세포 분화 관련 신호 인자인 ERK, p38 또는 NF-κB의 활성을 억제시키며 파골 세포의 골흡수 기능 억제를 통해 난소 적출 랫트의 골밀도 증가를 유도한다고 보고된 바 있다
16,17)
. 한편, 녹용이 가미 된 쌍화탕이 조골 세포의 성장과 콜라겐 생성을 증가를 통 하여 난소 적출 랫트의 골밀도를 증가시킨다고 보고됐다9)
. 이에 미루어 볼 때, 발효 쌍화탕이 조골 세포 분화의 분화와 성장 그리고 파골 세포 분화 관련 신호 인자의 활성에도 효 과를 보일 것으로 추정되며 앞으로 이를 규명하는 연구가 필요하다고 사료된다.본 연구에서 발효 쌍화탕의 장기간 투여 시 나타날 수 있는 간에 대한 영향을 살피기 위해 간세포의 손상 시 혈액 속으로 다량 방출되어 간질환의 지표로 활용되는 ALT와 AST의 수치를 살펴보았고 큰 변화가 없어 발효 쌍화탕의 장기간 투여가 간손상을 유발하지 않음을 확인하였다.
종합하여 본 연구는 유산균 발효를 한 발효 쌍화탕의 골 다공증 치료 효과를 확인하였고 생리 활성 성분의 전환 증 가와 파골세포 형성 억제가 이런 발효 쌍화탕의 효능에 기 여한 것으로 추정된다. 앞으로 골다공증 치료 효능을 가진 한방 처방인 발효 쌍화탕에서 골다공증 치료 효능을 나타내 는 성분을 발굴하고 그 효능을 검증하여 발효 쌍화탕의 효 능 메카니즘을 규명하는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
V. 감사문
이 연구는 교육과학기술부 지원 한국한의학연구원 (K10050)의 지원을 받아 수행되었으며 이에 감사드립니다.