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요화학 및 일반검사
(Urinalysis & General Analysis Lab)
임상병리학과 김 평 환
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Chapter 6. 요 단백 (화학적 검사)
▲ 시험지 (strip)
1) 일상요검사 (Routine test)
- pH, 비중, 단백, 당, ketone체, bilirubin, urobilinogen, occult blood, nitrite, leukocyte 2) 화학적 검사를 위해서는 아침 첫뇨가 가장 좋다. (신선한 뇨, 4시간 이내).
3) strip을 담그기 전에 요의 온도는 실온이 되도록 한다. / 효소반응 방해 방지 : 질환의 조기 발견을 위한 screening test 중의 하나로 매우 중요
▶ 시험지 사용상, 보관상 주의 사항
1) 보 관 - 실온 보관 (15℃-30℃) –보관 시 냉동 보관 금지.
직접적인 햇빛 금지 (불투명병 사용)
필요한 만큼만 꺼내고 뚜껑을 바로 받으며, 밀폐된 용기에서 건조제 제거 말 것.
2) 시약부분 – 손으로 만지지 말 것. / 유효기간 지난 것 사용 금지.
3) 오래 담가두지 않는다. (1초이내 꺼낸다) 4) 씻기지 않도록 한다. / 과잉뇨를 제거한다.
5) 항상 신선뇨 사용. 검체 원심분리 하지 말 것.
6) Vitamin C는 포도당, 잠혈, 빌리루빈, 백혈구, 아질산염 (nitrite) 반응을 저지한다.
화학적 검사
▲ 단백뇨 (Proteinuria)
: 요단백 정성검사법에서 양성이 나타날 수 있는 농도의 단백질이 요 중에 존재하는 것.
: 24시간 정량검사법에서 일부 조금 검출이 되나 (알부민뇨) 정성검사법에서는 검출이 되지 않 아야 함.
: 정상성인의 protein 배설량은 150-150 mg/24hrs 이하이며, 이상일 경우 Proteinuria
: Pus, 혈액, 질 분비물 등이 혼입되어서 나타나는 반응 위양성
: 실질적 단백뇨는 사구체에서 여과 될 때 혈청단백이 세어 나오는 경우를 말함.
: 초기의 신장질환에서 흔히 발생.
화학적 검사 – 요 단백
▶ 요단백이 나타나는 원인
1) 혈청 중의 저분자 단백의 누출 2) 사구체에서 단백누출
3) 세뇨관에서 재흡수 저하
2) 요세관 단백뇨
: 요세관에서 저분자량의 단백질이 재흡수 되지 않는 단백뇨.
: 중금속중독, 판코니증후군, 윌슨병, 갈락토오즈혈증의 질환에서 발생.
3) 생리적 단백뇨 (비병적인 단백뇨)
: 과격한 운동, 생리, 목욕 후, 장시간 보행, 정신적 stress, 다량의 육류 섭취 등에 의해서 일과성으로 증가하여 500 mg/day 이하로 배설.
: 기립단백뇨, 체위단백뇨, 일과성단백뇨
화학적 검사 – 요 단백
▲ 단백뇨의 분류
1) 병적단백뇨
(A) 신외성 단백뇨 : 저분자량 단백질에 관련된 질환으로, 신장에서 hemoglobin, myoglobin, bence- jones protein (BJP) 등이 배설됨. 보통 일상적인 검사에서는 발견되지 않음.
(B) 사구체성 단백뇨: 세균, 독소, 자가항체, 면역복합체 등에 의해 사구체 모세혈관막의 손상을 초래, 정상 혈장단백질의 투과력이 증가되어 단백뇨 생성.
: 사구체로 들어가는 혈액의 압력이 증가.
: 사구체 투과력의 증가로 여과액에 다양한 크기의 단백질이 존재.
: 다발성 골수종에 걸린 사람에게서 생성되는 BJ 단백질은 Ig의 light chain의 증가에 따라 세뇨관의 재흡수 용량 초과시 검출됨.
40-60도에서 응고 혼탁, 100도 투명 에서 용해되는 특징.
▲ 요단백 정성검사
▶ 단백질 응고 침전법 : 열 응고, 산에 의한 침전반응 유도 (단백질 구조 변성 유도) 1) Sulfosalicylic acid (SSA법): 대표적 침전법이며 예민한 방법임.
: albumin과 globulin을 응고 침전 시킴.
▶ 시험지법 :지시약을 이용하여 변색 변화 유도
1) 단백질 종류 중 albumin과 가장 잘 반응. 상대적으로 globulin 반응성 낮음.
2) 요의 용질 농도가 높으면 요단백 결과가 낮게 나옴.
3) 현재 임상에서 일반적으로 사용하는 검사법
4) Tetrabromophenol blue 지시약의 색 변화로 판별
- pH 3.0 에서 peptid의 전하와 만나면서 pH 지시체의 error 유발 (protein error)
- 지시약의 음이온 성분과 단백의 양이온이 결합하여 지시약의 수소이온 제거함으로 단백 오차 반응 유도
- pH 3.0 yellow blue
화학적 검사 – 요 단백 (정성검사)
5) 이방법의 위양성 or 양성인 경우 Sulfosalicylic acid, Heat법으로 재검토
강알카리성 요인 경우 위양성 : pus, 혈액, 질분비물 혼입, 시험지 검체에 장시간 노출
BJP, Globulin 함유 요인 경우 위음성 : 알부민 이외의 다른 단백질
화학적 검사 – 요 단백 (정성검사)
▶ 단백질 응고 침전법 : 열 응고, 산성용액 등을 사용하여 단백질 구조 변성 유도
1) Sulfosalicylic acid (SSA) : 대표적 침전법이며 예민한 방법임. (민감도 : 5 mg/dL) : albumin과 globulin을 응고 침전 시킴.
: pH변화에 따라 극성이 변하는 단백질성질을 이용(단백은 산에 의해 쉽게 변성되고 침전)
(-): 혼탁이 없음
(±):흑색 배경에 흰 혼탁(20mg/dl↓) (+):흑색배경없이 흰 혼탁(20~50mg/dl) (2+):쉽게 알 정도의 혼탁(100mg/dl) (3+):작은 침전과 심한 혼탁(200mg/dl) (4+):덩어리 침전과 심한 혼탁(500mg/dl)
결과가 음성이면 확실한 음성 (정성검사중 가장 예민)
화학적 검사 – 요 단백 (정성검사)
시험지법과 SSA법의 비교
시 험 지 법 SSA법
원 리 PH 지시약과 단백오차 산에 의한 단백의 변성 혼탁
감 도 15~20mg/㎗ 정도 5mg/㎗ 정도
특이성 알부민 알부민, 글로부린, BJP단백
위양성 PH 8 이상의 강알카리뇨 X-ray 조영제, 덱스트린.
위음성 PH3 이하의 강산성뇨, BJP단백 PH 8 이상의 강알카리뇨
화학적 검사 – 요 단백 (정성검사)
▲ 자비법 (Heat acetic acid )
: 등전점 부근의 pH에서 열응고 현상을 이용 : 3% acetic acid, Heat
: 결과 - 혼탁유무로 판정, 감도가 낮으나 요단백이 양성이면 확실한 양성
▲ Purdy법 (식염첨가 자비법)
1) 원리 : 포화 식염수 용액 + 끊임
2) 시약 : 50% acetic acid, 포화수용액 3) 결과 : 자비법과 유사
화학적 검사 – 요 단백 (정성검사)
1) Trichloroacetic acid (TCA법=Henry법) – 정량검사중 가장 예민
- 임상에서 가장 많이 사용하는 정량검사법 - 원리 : TCA 시약에 의한 단백 혼탁을 420 nm에서 비색정량
- 시약 : 12.5% TCA
- 특징 : 단백질 분자량의 크기에 관계없이 반응하여 일정한 입자의 혼탁 부유액형성 : 신장질환의 경과를 보는데 중요한 검사법. 24시간 요검체 사용.
▲ 단백뇨의 정량검사
2) Esbach 법
- 원리 : Albuminometer를 이용
- 시약 : Picric acid, Citric acid, 5% HCl - 특징 : 응고 침전 높이를 측정
화학적 검사 – 요 단백 (정량검사)
▲ 특수 단백체의 검사
1) Bence-Jones 단백
: 약 40% 다발성 골수종(multiple myeloma) 환자의 요중에서 발견되는 일종의 특징적인 단백
: Plasma cell, Lymphocyte 의 악성 증식에 의해 만들어진 monoclonal antibody로 골수에서 생산되는 특수단백질
: Ig 단백분자의 일부가 불완전 과잉생산되어 Ig 합성에 이용되지 못하고 혈장 중에 존재하는 L-Chain 분자량이 작기 때문에 사구체를 통과하여 요중에 배설
: 정상인에게서도 소량 발견됨.
: 전기영동(electrophoresis)하면 α-globulin이나 β-globulin 분획위치에 높은 peak 관찰
: 이 단백은 다발성 골수종 이외 전이한 종양 만성임파구성백혈병, Amyloidosis 등에서 나타나는 수도 있다.
1) 요단백 검사법 (SSA) : SSA법과 시험지법 병행 2) Heat test
3) 단백질 전기영동
4) IEP 법 (Immunoelectrophoresis) 5) RID 법 (Radial immunodiffusion)
화학적 검사 – 요 단백 (정량검사)
▲ 1) Bence-Jones 단백 검사법
1) 요단백 검사법 (SSA) : SSA법과 시험지법 병행
2) Heat test (가온시험) : 임상에서는 사용하지 않으며, putman법을 이용함.
: 10% 초산 + 가열 ⇒ pH5.0～5.1에서 단백의 열응고, 열융해의 특성을 조사
3) Putman 법 : 교재 참조
4) Toluene sulfonic acid(TSA) : 0.3mg/㎗ 의 적은양이 있어도 침전시키는 가장 예민한 방법임.
5) Bradshaw 법
6) 단백질 전기영동법 : β - ϒ Globulin 사이 M-protein spike형성
화학적 검사 – 요 단백 (정량검사)
7) 면역전기이동법=IEP 법 (Immunoelectrophoresis) : L-chain에 대한 항원항체 면역반응 ⇒ 침강선
화학적 검사 – 요 단백 (정량검사)
8) RID 법 (Radial immunodiffusion) : 항원항체 면역확산 반응
: 면역확산이란 항원 및 항체가 확산하는 현상을 말한다. 항원과 항체가 정량으로 부딪혀 침전물 이 생성될 때 까지 용액내에서 계속 확산함.
