The Effects of Bangkibokryeong-tang on Papain-induced OsteoArthritis C57BL/10 Mouse

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￭ 접 수 : 2012년 11월 20일, 수정 : 2012년 11월 27일, 채택 : 2012년 12월 13일

￭ 교신저자 : 오민석, 대전시 서구 둔산동 1136번지 대전대학교부속 둔산한방병원 한방재활의학과교실 Tel : (042) 470-9424, E-mail : ohmin@dju.ac.kr

防己茯苓湯이 papain으로 유도된 생쥐의 골관절염에 미치는 영향

박인선⋅윤일지⋅오민석

대전대학교 한의과대학 한방재활의학과교실

The Effects of Bangkibokryeong-tang on Papain-induced OsteoArthritis C57BL/10 Mouse

In-Sun Park, O.M.D., Il-Ji Yoon, O.M.D., Min-Seok Oh, O.M.D.

Dept. of Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Dae-Jeon University

Objectives :

This study was carried out to know the anti-osteroarthritic effects of Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang(BBT)) on the papain-induced osteoarthritis C57BL/10 mouse.

Methods :

Osteoarthritis was induced by injection of papain(6 μl) into knee joint of mouse. Osteoarthritic mice were divided into 4 groups(normal, control, joinsⓇ, BBT). The injection did not fit the normal group. A week later, after the injection of papain, control group was taken normal saline 200 μl, positive control group was taken joinsⓇ(100 mg/kg), treated group was taken extract of Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang(BBT))(400 mg/kg). After then, we examined hepatotoxicity, nephrotoxicity, inflammation cytokines, expression of inflammation factor mRNA, hemotology, histology through the micro CT-arthrography, and etc.

Results :

1. Hepatotoxicity and nephrotoxicity have not expressed.

2. The levels of IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1, Thromboxane B2, Leukotriene B4, Prostaglandin E2 in serum were significantly decreased.

3. In hematology, the levels of neutrophils and monocytes were significantly decreased.

4. The expression of inflammation factor mRNA like TNF-α and IL-6, COX-2, iNOS-Ⅱ were significantly inhibited.

5. In micro CT-arthrography, cartilage volume was less decreased.

6. The degree of osteoarthritis induced damage of joint of BBT group is low in histopathologic observation(hematoxylin&eosin(H&E), Safranin-O).

Conclusions :

According to this study, BBT has effect of anti-osteoarthritis. Further clinical research for the cartilage protective effect is necessary.

Key words : Osteoarthritis, Anti-inflammation, Bangkibokryeong-tang, Papain, Proteoglycan

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Ⅰ. 서 론

골관절염은 가장 흔한 관절 질환으로 국소적 인 관절에 점진적인 관절연골의 소실 및 그와 관 련된 2차적인 변화와 증상을 동반하며, 점차 고 령화 사회가 되어감에 따라 환자가 더 증가할 것 으로 예상된다^1-3). 2010년도 국민건강영양조사에 서 만 50세 이상을 대상으로 방사선학적 골관절 염 유병률에 대한 조사를 실시한 결과, 전체 38.7%, 여성 46.7%, 남자 29.4%가 골관절염을 앓 고 있으며 2009년에 비해 2.5% 감소 추세인 것으 로 나타났다⁴⁾.

골관절염의 발생은 여러 기계적인 자극이나 염 증으로 인한 효소반응, 대사의 변화 등으로 시작 되며, 결국에는 치유와 재형성 과정이 실패함으로 써 점진적으로 관절연골이 소실되고 연골세포의 동화작용 및 증식 반응의 감소가 나타난다³⁾.

골관절염은 통증과 관절 운동 장애를 주 증상 으로 하기 때문에 한의학적으로는 痺症으로 분류 되며, 골관절의 痺症은 風寒濕熱의 사기가 인체 가 허약한 틈을 타고 경락으로 침입하거나 관절 에 응체됨으로써 血氣運行을 저해하여 肌肉, 筋骨, 關節에 麻木, 重着, 酸楚, 疼痛, 腫脹, 屈伸不利, 진행하면 관절의 강직성 변형을 초래하는 질 병중의 하나이다¹⁾.

골관절염의 치료법에는 약물치료, 물리적 요 법, 수술 및 주사치료 등의 방법이 있다³⁾. 그러나 퇴행성 관절염을 예방하거나 치료할 수 있는 확 실한 약물은 개발되어 있지 않은 실정이며 가장 흔히 사용되는 약제는 NSAIDs(Non-steroidal anti- inflammatory drugs)로서 장기간 사용시 위장관 부작용과 신장 부작용을 야기할 수 있고⁵⁾, 또한 수술 및 주사요법은 처치 후 오히려 강직이나 감 염 등을 유발할 수가 있어서³⁾ 보다 안전하고 효

과적인 치료제가 필요한 실정이다.

여⁶⁾의 보고에 따르면 골관절염에 대한 한의학 적 치료에 관한 논문은 총 79편으로 그 중 약물 연구는 20건, 약침 연구는 32건, 침 및 뜸 연구 13건 등으로 나타났으며, 골관절염은 한방 임상 에서 류마티스 관절염 환자군보다 더 많이 접하 게 되는 질환이므로 지속적인 연구가 더 필요한 상황이다.

본 연구에 사용된 防己茯苓湯(Bangkibokryeong-tang (Fanjifuling-tang), 이하 BBT로 지칭함)⁷⁾은 󰡔金匱要略󰡕에 처음 언급된 처방으로 방기의 去風除濕 작용을 강화한 방기-계지 藥對에 황기, 복령 등의 健脾利水藥을 가하여 구성된 처방이다. 皮水證을 다스리는 효과가 좋다고 알려져 있으며 신장기능 의 개선이나 고지혈증의 개선에 대한 효과^8,9)가 보고된 예가 있을 뿐, 관절염 또는 질환별 연구 대상으로서 그 예를 찾아보기 어려웠다. 그러나 임상에서 마황제를 쓰기 어려운 비만 환자에게 BBT를 다용하고 있다는 점과 체중증가가 골관절 염 증상의 악화에 영향을 미친다는 점에서 착안 하여 BBT가 단순한 체중감량 효과뿐만 아니라 염증 완화 및 연골 재생에 대한 효과를 실험적으 로 입증한다면 허증의 비만 환자의 골관절염에 다용할 수 있으리라 생각되어 이 실험을 계획하 게 되었다. 이에 골관절염을 유발한 생쥐를 대상 으로 BBT을 경구투여 하여 혈청내 염증 사이토 카인의 함량 및 유전자 발현, 조직학적 변화 정 도를 관찰하여 유의성 있는 성적을 얻었기에 보 고하는 바이다.

Ⅱ. 실 험

1. 재료

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1) 시약 및 기기

(1) 시약

본 실험에 사용된 시약은 diethyl pyrocarbonate (DEPC), chloroform, trichloroacetic acid, isopropanol, Tris-HCl, KCl, MgCl2, 적혈구 용혈액(ACK lysis solution), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양액, dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS), sulforhodamin B(SRB), 2-isopropanol, sodium dodecyl sulfate(SDS), PMA, ionomycin, antibiotics는 Sigma 社(st. Louis, MO, USA) 제품 을 사용하였으며, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone 社(Logan, Ut, USA) 제품을, IL-6, TNF-α, prostaglandin E2 그리고 leukotriene B4, ELISA kit는 BioSource社(California, USA) 제품 을 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.

(2) 기기

본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (Formascientific Co., Marietta OH, USA), clean bench (Visionscientific Co., Daejeon, Korea), autoclave (Sanyo Co., Osaka, Japan), micro-pipet(Gilson, Middleton, USA), water bath(Visionscientific Co., Daejeon, Korea), vortex mixer(Visionscientific Co., Daejeon, Korea), spectrophotometer(Shimazue Co., Kyoto, Japan), centrifuge(Sigma-Aldrich Co., st.

Louis, MO,, USA), deep-freezer(Sanyo Co., Osaka, Japan), Quantitative Real Time RT-PCR(Applied Biosystems Co., Foster City, CA, USA), ice-maker (Visionscientific Co., Daejeon, Korea), homogenizer (OMNI Co., NW Kennesaw, USA), plate shaker (Lab-Line Co., Melrose Park, IL, USA) 및 ELISA leader(Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA) 등을 사용하였다.

2) 약재

(1) 구성

본 실험에 사용한 BBT(Bangkibokryeong-tang (Fanjifuling-tang))의 구성 약물은 󰡔圖說韓方診療要 方󰡕⁷⁾을 기준으로 하였으며 약재의 구입은 대전대 학교 부속한방병원에서 구입하여 정선한 후 사용 하였으며, 한첩당 분량은 아래와 같다(Table Ⅰ).

Name of herb Pharmacognostic name Dose(g)

防己 Stem of Sinomenii Radix 6.0 g

茯苓 Sclerotium of Poria(Hoelen) 12.0 g 黃芪 Root of Astragali Radix 6.0 g 桂枝 Branch of Cinnamomi Ramulus 6.0 g 甘草 Root of Glycyrrhizae Radix 4.0 g

Total 34.0 g

Table Ⅰ. The Compositions of Bangkibokryeong-tang (Fanjifuling-tang)

(2) 추출방법

시료 추출은 약재를 분말화한 후 50 g을 환류 추출장치에 넣고 80% 주정(EtOH) 500 ml를 가하 여 60 ℃에서 1시간 동안 추출한 후 동결건조기 를 이용하여 건조한 다음 분말화하여 사용하였다.

3) 동물

암컷 6 주령의 C57BL/10(22 g)는 Harlan(USA) 사에서 공급받았고, 동물은 실험 당일까지 고형 사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co. Korea)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2 ℃, 습도 55±15%, 12 시간(light-dark cycle)의 환경에서 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험은 정상군, 대조군, 양 성대조군(조인스정, Joins®, SK 케미칼 Co., Korea), BBT 투여군으로 하였으며, 동물 수는 각 군당 6 마리로 하였다. 채혈과 무릎관절 조직 분리가 원 활하게 이루어지지 못하여 혈청을 이용한 실험에 서는 각 군당 4마리의 혈액이 사용되었고, 유전

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자 발현에는 각 군당 3마리의 무릎관절 조직이 사용되었다. 본 연구계획은 대전대학교 동물실험 연구위원회의 승인(승인번호 : DJUARB 2010-045) 을 받았다.

2. 방법

1) 모델 및 약물투여

(1) Papain 투여에 의한 골관절염 유발 동물모델 단백분해물질인 papain을 무릎관절강에 주입한 후 약물을 투여하여 약물투여에 의한 변화를 관찰 하는 방법으로 평가하였다. Papain(type IV, double crystallized, 15 units/mg, Sigma Co., USA)은 농도가 1.0%(w/v)가 되도록 조정하며 papain이 활성화되도록 0.03 M L-cystein HCl(Sigma Co., USA)을 보충한 다음 슬개골 인대를 통과하여 우 측 무릎관절에 이용액 6 μl를 투여하였다(papain 용액과 cysteine 용액을 1:1로 희석). Papain 용액 은 투여 전 0.2 μm syringe filter를 통과시켜 박 테리아를 제거하였다.

(2) 약물투여

C57BL/10생쥐에 papain을 주사한 후 일주일 후부터 대조군에는 200 μl의 생리식염수를, 양성 대조군에는 조인스정(100 mg/kg)을, 실험군에는 BBT(400 mg/kg)를 200 μl의 생리식염수에 넣어 서 매일 오전 11시에 총 4주간 경구투여 하였고 음수의 공급은 모든 군에서 제한이 없게 하였다.

2) 염증 사이토카인 및 인자 ELISA 측정

투여 전후 또는 전체 투여기간에 걸쳐 일정한 간 격을 두고 혈액을 채취하였다. 혈액으로부터 혈청을 분리한 뒤, 염증성 지표로서 IL-1β(Interleukin-1β),

TNF-α(Tumor Necrotic Factor-α), IL-6(Interleukin 6)등의 사이토카인은 ELISA로 측정하고, thromboxane B2, prostaglandin E2, leukotriene B4 등의 염증성 매개인자들은 각각의 assay kit를 이용하여 농도 를 측정하였다.

3) 혈액분석

최종 실험 종료 후 EDTA 처리된 튜브형 주사 기로 심장 혈액 1.0 ml를 채혈하였다. 전혈을 바 이오톡스텍(주)에 의뢰하여 백혈구 중 중성구, 단 핵구의 총 세포수를 측정하였다. 혈구세포 수는 심장천자법으로 채취한 혈액을 자동혈구측정기 (MS9-5, MELET SCHLOESING Co., France)로 Fonio법에 준하여 Minos-ST로 측정하였다.

4) Quantitative real time PCR in dorsal skin tissue

(1) C57BL/10생쥐의 등 피부조직에서 RNA 분리 골관절염 유발 C57BL/10생쥐의 무릎관절 조 직을 적출하여 각각에 RNAzol B 500 μl를 넣고 용해될 때까지 homogenizer로 분쇄하였다. 이 조 직분쇄 혼합 부유액에 chloroform(CHCl3) 50 μl 를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음 에 15분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 약 200 μl의 상층액을 회수하여 2-isopropanol 200 μl와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다. 이를 다시 13,000 rpm에서 원 심 분리한 후 80% EtOH로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 DEPC를 처리한 20 μl의 증류수에 녹여 heating block 75 ℃에서 불활성화 시킨 후 first strand cDNA합성에 사용하였다.

(2) 역전사-중합효소 연쇄반응

역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total

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RNA 2 μg을 DNase I(10 U/μl) 2 U/tube를 37 ℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75 ℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5 μl 10 mM dNTPs mix, 1 μl random sequence hexanucleotides(25 pmole/25 μl), RNA inhibitor로서 1 μl RNase inhibitor(20 U/μl), 1 μl 100 mM DTT, 4.5 μl 5×

RT buffer(250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1 μl의 M-MLV RT(200 U/μl)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류 수로서 최종 부피가 20 μl가 되도록 하였다. 이 20 μl의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에 서 5초간 원심 침강하여 37 ℃ heating block에 서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합 성한 다음, 95 ℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega Co., USA)를 불활성화 시 킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다.

(3) Real Time Quantitative RT-PCR

Real time quantitative PCR은 7500 Real-Time PCR system을 이용하여 수행하였다. Mouse oligonucleotid 의 염기배열은 다음과 같다(Table Ⅱ).

Cytokine 유전자 발현은 SYBRⓇ Green PCR Master mix를 사용하였고, internal standard는 GAPDH로 Taqman probe(VIC dye-labeled, ABi Co., USA)를 사용하였으며, primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2, iNOS-II의 mRNA 발현은 무릎관절 조직에 서 관찰하였고 cDNA를 합성하여 분석하였다. Real

time quantitative PCR의 조건은 pre-denaturation 은 2 min at 50 ℃, 10 min 94 ℃, 그리고 40 cycles 을 0.15 min at 95 ℃, 1 min at 60 ℃에서 수행하 였다. Target group의 Quantitative PCR은 y=x(1+e)n

x=starting quantity y=yield

n=number of cycles

e=efficiency로 계산하여 RQ(relative quantitative) 을 측정하였다.

Gene Primer Sequence

IL-1β Forward 5'CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG 3' Reverse 5'GATCCACACTCTCCAGCTGCA 3' IL-6 Forward 5'TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC 3'

Reverse 5'GTGTAATTAAGCCTCCGACTTG 3'

TNF-α

Forward 5'TTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATC GGTCC 3'

Reverse 5'GTATGAGATAGCAAATCGGCTGACGGT GTGGG 3'

COX-2 Forward 5'TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA 3' Reverse 5' TGGCTCTGCAGGATTTTCATG 3' iNOS-II Forward 5' GGCAGCCTGTGAGACCTTTG 3'

Reverse 5' GCATTGGAAGTGAAGCGTTTC 3' IL-1β : Interleukin-1β

IL-6 : Interleukin 6

TNF-α : Tumor Necrotic Factor-α COX-2 : Cyclooxygenase-2 iNOS-II : Nitric Oxide Synthases-II Table Ⅱ. Primer Sequence

5) X-ray와 Micro CT-arthrography 측정

Micro-CT 측정은 조형제인 헥사브릭스(HEXABRICS 320)를 꼬리 정맥에 주사 후 micro CT-arthrography 를 사용하여 무릎관절 연골 파괴 정도를 연골양 (cartilage volume)을 측정하여 분석하였다(Fig. 1).

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Fig. 1. In vivo imaging of cartilage degeneration using mCT-arthrography in joint tissue of papain-induced mouse osteoarthritis.

ROI : Region of Interest

6) 조직병리학적 검사

Micro-CT 촬영이 끝난 후 무릎관절을 절단하여 10% EDTA가 포함된 10% formalin 용액에 넣어 joint를 decalcification 시켰다. Radiographic technique 을 이용하여 decalcification 유무를 확인한 후 parafin wax에 joint를 넣고 고정한 다음 coronal section 을 실시하였다. Decalcification 과정을 거쳐 파라 핀으로 고정된 조직을 7 μm의 크기로 자른 뒤, hematoxylin and eosin(H&E) 및 safranin-O 염 색을 실시하여 조직의 상태를 관찰하였다. 염증 반응 발생 유무나 활막세포의 증식, 염증세포의 조직침윤 여부는 H&E 염색결과에서 확인할 수 있으며, proteoglycan 층을 염색하는 safranin-O 염색결과에서는 연골조직의 손상여부를 확인하 였다.

3. 통계처리

대조군과 약물투여군의 측정치를 양적자료는 측정수치로, 질적자료는 백분율로 표시하였으며, 약물 투여로 인한 변화는 student's T-test 방법으 로 엑셀 통계프로그램을 이용하여 p<0.05, p<0.01, p<0.001 이하에서 유의성을 검증하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 간기능 및 신장기능에 미치는 영향

1) AST(aspartic acid transaminase), ALT(alanine transaminase)

간 기능 측정의 지표 성분인 ALT는 정상군이

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30.9±2.6(U/L), 대조군이 26.9±2.7(U/L), 양성대조 군에서는 32.6±2.5(U/L), BBT 투여군에서는 35.9±4.4 (I.U/L)로 나타났다. AST는 정상군, 대조군, 양성 대조군, BBT 투여군에서 각각 83.5±10.9(U/L), 100.4

±10.5(U/L), 84.0±15.6(U/L), 89.3±6.2(U/L)로 나 타나 간기능에는 영향을 미치지 않는 것으로 나 타났다(Fig. 2).

Fig. 2. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on the ALT and AST in papain-induced mouse osteoarthritis.

Normal : C57BL/10 normal mice group

OAC-control : Papain-induced osteoarthritis mice group OAC-Joins^Ⓡ : Papain-induced osteoarthritis mice and administered JoinsⓇ

OAC-BBT400 : Papain-induced osteoarthritis mice and administered Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)(400 mpk)

Values represent the means±SD of 4 mice.

2) BUN(blood urea nitrogen), Creatinine

혈청 중의 BUN 농도를 측정한 결과, 정상군은 27.9±3.7 mg/dl, 대조군은 29.9±1.9 mg/dl로 나타 났으며, 양성대조군에서는 31.4±2.2 mg/dl, BBT 투여군은 21.3±1.2 mg/dl로 나타나 BBT 투여군 에서 대조군에 비하여 유의성 있는(p<0.05) 감소 를 나타냈고(Fig. 3-1), 혈청 중의 creatinine 농도 를 측정한 결과, 정상군은 0.37±0.01 mg/dl, 대조 군은 0.41±0.02 mg/dl로 나타났으며, 양성대조군 에서는 0.41±0.02 mg/dl, BBT 투여군은 0.33±0.03 mg/dl로 나타났다(Fig. 3-2). 이를 통해 BBT가 신 기능에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.

*

Fig. 3-1. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on the BUN in papain-induced mouse osteoarthritis.

Normal : C57BL/10 normal mice group OAC-control : Papain-induced osteoarthritis mice group OAC-JoinsⓇ : Papain-induced osteoarthritis mice and Joins^Ⓡ

OAC-BBT400 : Papain-induced osteoarthritis mice and BBT(400 mpk)

Values represent the means±SD of 4 mice.

The level of BUN was decreased significantly in the BBT compared with control by T test(*p<0.05).

Fig. 3-2. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on the creatinine in papain-induced mouse osteoarthritis.

OAC-control : Papain-induced osteoarthritis mice group OAC-JoinsⓇ : Papain-induced osteoarthritis mice and JoinsⓇ

OAC-BBT400 : Papain-induced osteoarthritis mice and Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)(400 mpk) Values represent the means±SD of 4 mice.

2. 혈청내 염증 cytokines에 미치는 영향

1) IL-1β 생성량에 미치는 영향

혈청 내의 IL-1β 생성량은 정상군이 6.9±2.1 pg/ml, 대조군이 139.3±23.0 pg/ml, 양성대조군 투여군이 15.6±3.6 pg/ml, BBT 투여군이 34.7±7.8

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pg/ml로 나타나, BBT 투여군에서 대조군에 비하 여 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내었다(Fig. 4).

*

†

Fig. 4. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of IL-1β in the serum of papain-induced mouse. The levels of IL-1β were determined using a Luminex system.

The levels of IL-1β were decreased significantly in the BBT and JoinsⓇ compared with control by T test(*p<0.001,

†p<0.01).

2) TNF-α 생성량에 미치는 영향

TNF-α 생성량은 정상군이 10.6±1.9 pg/ml, 대 조군이 142.4±19.1 pg/ml, 양성대조군 투여군이 38.4±8.0 pg/ml, BBT 투여군이 49.1±6.6 pg/ml 로 나타나, BBT 투여군에서 대조군에 비하여 유 의성 있는(p<0.001) 감소를 나타내었다(Fig. 5).

3) IL-6 생성량에 미치는 영향

IL-6 생성량은 정상군이 58.4±15.0 pg/ml, 대조 군이 1002.4±256.2 pg/ml, 양성대조군 투여군이 145.0

±57.5 pg/ml, BBT 투여군이 270.9±68.8 pg/ml로 각각 나타나, BBT 투여군에서 대조군에 비하여

유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내었다(Fig. 6).

* *

Fig. 5. Effects of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of TNF-α in the serum of papain-induced mouse. The levels of TNF-α were determined using a Luminex system.

The levels of TNF-α were decreased significantly in the BBT and JoinsⓇ compared with control by T test(*p<0.001).

*

Fig. 6. Effects of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of IL-6 in the serum of papain-induced mouse. The levels of IL-6 were determined using a Luminex system.

OAC-BBT400 : Papain-induced osteoarthritis mice and Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)(400mpk) Values represent the means±SD of 4 mice.

The levels of IL-6 were decreased significantly in the BBT and JoinsⓇ compared with control by T test(*p<0.01).

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4) MCP-1(Monocyte chemoattractant protein-1) 생성 량에 미치는 영향

혈청 내의 MCP-1 생성량은 정상군이 2.5±0.4 pg/ml, 대조군이 122.4±15.2 pg/ml, 양성대조군 투여군이 33.4±11.0 pg/ml, BBT 투여군이 46.2±7.4 pg/ml로 나타나, BBT 투여군에서 대조군에 비하 여 유의성 있는(p<0.001) 감소를 나타내었다(Fig. 7).

* *

Fig. 7. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on level of MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein -1) in the serum of papain-induced mouse. The level of MCP-1 was determined using a Luminex system.

The level of MCP-1 was decreased significantly in the BBT and Joins^Ⓡ compared with control by T test(*p<0.001).

3. Arachidonic acid의 대사작용에 미치는 영향

1) Thromboxane B2 생성에 미치는 영향

혈청 내의 thromboxane B2 생성량은 정상군이 17.3±4.1 pg/ml, 대조군이 49.2±14.2 pg/ml, 양성 대조군 투여군이 14.2±1.8 pg/ml, BBT 투여군이 23.6±3.1 pg/ml로 나타나, BBT투여군에서 대조

군에 비하여 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내 었다(Fig. 8).

*

†

Fig. 8. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of thromboxane B2 in the serum of papain -induced mouse.

OAC-control : Papain-induced osteoarthritis mice group OAC-JoinsⓇ : Papain-induced osteoarthritis mice and Joins^Ⓡ

The levels of thromboxane B2 were decreased significantly in the BBT and Joins^Ⓡ compared with control by T test (*p<0.001, ^†p<0.01).

2) Leukotriene B4 생성에 미치는 영향

혈청내의 leukotriene B4 생성량은 정상군이 50.1

±7.9 pg/ml, 대조군이 314.5±46.9 pg/ml 양성대 조군 투여군이 91.0±19.1 pg/ml BBT 투여군이 235.2±30.9 pg/ml로 나타나, BBT 투여군에서 대 조군에 비하여 유의성(p<0.01) 있는 감소를 나타 내었다(Fig. 9).

3) Prostaglandin E2 생성에 미치는 영향

혈청 내의 prostaglandin E2 생성량은 정상군 이 59.2±0.7 pg/ml, 대조군이 271.0±20.8 pg/ml, 양성대조군 투여군이 123.2±42.4 pg/ml, BBT 투 여군이 108.6±26.4 pg/ml로 나타나, BBT투여군 에서 대조군에 비하여 유의성 있는(p<0.001) 감소

(10)

를 나타내었다(Fig. 10).

*

†

Fig. 9. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of leukotriene B4 in the serum of papain -induced mouse.

The levels of leukotriene B4 were decreased significantly in the BBT and JoinsⓇ compared with control by T test (*p<0.001, ^†p<0.01).

*

†

Fig. 10. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on level of prostaglandin E2 in the serum of papain-induced mouse.

The level of prostaglandin E2 was decreased significantly in the BBT and JoinsⓇ compared with control by T test (*p<0.01, ^†p<0.001).

4. 혈액내 면역세포에 미치는 영향

1) 백혈구에 미치는 영향

혈액내 백혈구량은 정상군이 9.03±0.04(×10³/ml), 대조군이 8.43±0.49(×10³/ml), 양성대조군 투여군 이 8.84±0.29(×10³/ml), BBT 투여군이 8.85±0.73 (×10³/ml)로 나타났다(Fig. 11).

Fig. 11. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of white blood cells in the blood of papain -induced mouse.

2) 중성구에 미치는 영향

혈액내 백혈구에 대한 중성구의 비율은 정상군 이 5.9±0.15(%), 대조군이 22.1±4.12(%), 양성대조 군 투여군이 6.9±0.82(%), BBT 투여군이 6.0±0.92(%) 로 나타나, BBT 투여군에서 대조군에 비하여 유 의성 있는(p<0.001) 감소를 나타내었다(Fig. 12).

3) 단핵구(Monocyte)에 미치는 영향

혈액 내 백혈구에 대한 단핵구의 비율은 정상군 이 2.5±0.06(%), 대조군이 5.6±1.10(%), 양성대조군 투여군이 2.7±0.33(%), BBT 투여군이 2.1±0.15(%)

(11)

로 나타나, BBT 투여군에서 대조군에 비하여 유 의성(p<0.01) 있는 감소를 나타내었다(Fig. 13).

* _†

Fig. 12. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of neutrophils in the blood of papain -induced mouse.

OAC-control : Papain-induced osteoarthritis mice group OAC-Joins^Ⓡ : Papain-induced osteoarthritis mice and JoinsⓇ

The levels of neutrophils were decreased significantly in the BBT and JoinsⓇ compared with control by T test (*p<0.01, ^†p<0.001).

*

Fig. 13. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of monocytes in the blood of papain -induced mouse.

The levels of monocytes were decreased significantly in the BBT and JoinsⓇ compared with control by T test(*p<0.01).

5. 염증인자의 유전자 발현에 미치는 영향

1) IL-1β mRNA 발현에 미치는 영향

무릎관절 조직에서의 IL-1β의 mRNA 발현은 대조군의 유전자 발현을 1.07±0.07로 했을 때 정 상군이 0.21±0.03, 양성대조군이 0.51±0.02, BBT 투여군이 0.96±0.02로 나타나, BBT 투여군에서 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성은 없었다 (Fig. 14).

*

Fig. 14. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of IL-1β mRNA in the joint tissue of papain-induced mouse.

Normal : C57BL/10normal mice group

The expression of IL-1β mRNA was inhibited significantly in the Joins^Ⓡ compared with control by T test(*p<0.001).

2) IL-6 mRNA 발현에 미치는 영향

무릎관절 조직에서 IL-6의 mRNA 발현은 대조 군의 유전자 발현을 0.94±0.06로 했을 때 정상군 이 0.16±0.07, 양성대조군이 0.36±0.06, BBT 투여 군이 0.36±0.11로 나타나, BBT 투여군에서 대조 군에 비하여 유의성(p<0.01) 있는 감소를 나타내 었다(Fig. 15).

(12)

* ^†

Fig. 15. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of IL-6 mRNA in the joint tissue of papain-induced mouse.

The expression of IL-6 mRNA was inhibited significantly in the BBT(^†p<0.01) and JoinsⓇ(*p<0.001) compared with control by T test.

3) TNF-α mRNA 발현에 미치는 영향

무릎관절 조직에서 TNF-α의 mRNA 발현은 대 조군의 유전자 발현을 1.01±0.01로 했을 때 정상군 이 0.17±0.04, 양성대조군 투여군이 0.58±0.0, BBT 투여군이 0.38±0.03로 나타나, BBT 투여군에서 대 조군에 비하여 유의성 있는(p<0.001) 감소를 나타 내었다(Fig. 16).

*

Fig. 16. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of TNF-α mRNA in the joint tissue of

papain-induced mouse.

The expression of TNF-α mRNA was inhibited significantly in the BBT(*p<0.001) and Joins^Ⓡ(*p<0.001) compared with control by T test.

4) COX-2 mRNA 발현에 미치는 영향

무릎관절 조직에서 COX-2의 mRNA 발현은 대 조군의 유전자 발현을 1.13±0.13로 했을 때 정상 군이 0.06±0.03, 양성대조군이 0.49±0.06, BBT 투 여군이 0.54±0.14로 나타나, BBT 투여군에서 대 조군에 비하여 유의성(p<0.01) 있는 감소를 나타 내었다(Fig. 17).

*

†

Fig. 17. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of COX-2 mRNA in the joint tissue of papain-induced mouse.

The expression of COX-2 mRNA was inhibited significantly in the BBT(^†p<0.01) and Joins^Ⓡ(*p<0.001) compared with control by T test.

(13)

5) iNOS-II mRNA 발현에 미치는 영향

무릎관절 조직에서 iNOS-II의 mRNA 발현은 대조군의 유전자 발현을 1.09±0.09로 했을 때 정상 군이 0.25±0.09, 양성대조군이 0.51±0.10, BBT 투여 군이 0.66±0.01로 나타나, BBT 투여군에서 대조군 에 비하여 유의성(p<0.01) 있는 감소를 나타내었 다(Fig. 18).

* ^†

Fig. 18. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on levels of iNOS-II mRNA in the joint tissue of papain-induced mouse.

The expression of iNOS mRNA was inhibited significantly in the BBT(^†p<0.01) and JoinsⓇ(*p<0.001) compared with control by T test.

6. 연골파괴에 미치는 영향

실험종료 후 조형제인 헥사브릭스(HEXABRICS 320)를 꼬리 정맥에 주사 후 micro CT-arthrography 를 사용하여 무릎관절 연골 파괴 정도를 연골양 (cartilage volume)을 측정 및 분석하였다. 그 결과 연골양이 정상군이 0.13±0.01 mm³, 대조군이 0.02

±0.01 mm³, 양성대조군이 0.07±0.01 mm³, BBT 투 여군이 0.05±0.01 mm³로 나타나, BBT 투여군은 대

조군에 비하여 유의성 있는(p<0.001) 연골파괴의 감소를 나타내었다(Fig. 19). 이를 통해 BBT이 관 절의 연골 파괴를 억제하여 골관절염 진행을 억 제함을 알 수 있다.

Fig. 19-1. Cartilage volume measured by micro CT-arthrography.

*

Fig. 19-2. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on imaging of cartilage degeneration using micro CT-arthrography in joint tissue of papain-induced mouse osteoarthritis.

The loss of cartilage volume was decreased significantly in the BBT and JoinsⓇ compared with control by T test(*p<0.001).

(14)

7. 조직학적 변화

1) Hematoxylin & Eosin 염색

조직염색 결과 정상군의 관절은 활막조직이 정상적으로 위치하였다. 대조군은 관절주변에 대 식세포, 과립구세포, 단핵구세포, 활막염증화세포 그리고 활막세포 hyperplasia의 침투가 일어나 연골과 뼈의 침하로 관절 구조의 손실이 일어난 것으로 나타났다. 양성대조군은 관절주변에 대조 군에서 관찰된 대식세포, 과립구세포, 단핵구세 포, 활막염증화세포 그리고 활막세포 hyperplasia 의 침투에 의한 연골과 뼈의 침하 등이 거의 사 라졌고, BBT 투여군에서는 관절주변에 대조군에 서 관찰된 대식세포, 과립구세포, 단핵구세포, 활 막염증화세포 그리고 활막세포 hyperplasia의 침 투에 의한 연골과 뼈의 침하 등이 많이 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 20).

Fig. 20. Effects of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on joint pathology(Hematoxylin & Eosin staining) from joint tissue of papain-induced mouse osteoarthritis.

OAC-BBT400 : Papain-induced osteoarthritis mice and Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)(400 mpk)

2) Safranin-O 염색

Proteoglycan 층을 관찰하기 위해 safranin-O 염색을 시행한 결과 정상군의 관절은 연골조직이 정상이었다. 대조군은 관절주변에 대식세포, 과립 구세포, 단핵구세포, 활막염증화세포 그리고 활막 세포 hyperplasia의 침투가 일어나 빨간색 염색 조직이 거의 관찰되지 않아 proteoglycan 층이 소 실되어 연골의 파괴가 나타난 것을 관찰할 수 있 다. 양성대조군은 관절주변에 대조군에서 관찰된 대식세포, 과립구세포, 단핵구세포, 활막염증화 세포 그리고 활막세포 hyperplasia의 침투에 의한 연골과 뼈의 침하 등이 많이 사라졌고, safranin O 염색에서 빨간색 염색 조직이 활막 주변에 많 이 분포하여 proteoglycan 층이 잘 보존되고 있는 것으로 나타났으며, BBT 투여군은 대조군에 비하 여 빨간색 염색 조직이 활막 주변에 많이 분포하 여 proteoglycan 층의 소실이 덜하여 상대적으로 연골의 파괴가 덜한 것으로 나타났다(Fig. 21).

Fig. 21. Effect of BBT(Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)) on joint pathology(Safranin-O staining) from joint tissue of papain-induced mouse osteoarthritis.

OAC-BBT400 : Papain-induced osteoarthritis mice and Bangkibokryeong-tang(Fanjifuling-tang)(400 mpk)

(15)

Ⅳ. 고 찰

골관절염은 55세 이상의 성인에게 가장 흔한 관절염으로, 골관절염은 하나의 질환이 아니라 원인은 각기 다르지만 병리학적, 형태학적, 임상 적 예후가 비슷한 질환들의 집합체인 질병이다.

전신적인 요인과 국소적인 생체역학적인 요인들 이 질병 발생에 기여하는데, 전신적 요인들이 관 절을 취약하게 만들고 그 결과로 국소적인 요인 들이 관절에 더 큰 영향을 미치게 된다. 전신적 인 위험요인으로는 민족, 나이, 성, 호르몬, 유전, 골밀도, 영양 상태 등이 있으며 국소적인 요인으 로는 과거의 관절 손상, 비만, 직업적 요인, 스포 츠 및 신체활동, 비정상적인 관절 생체역학, 근육 약화 등이 있다^10,11).

골관절염은 관절 연골의 소실과 침식, 골증식 체의 형성을 동반한 골비대, 연골하 골의 재배치, 활액막의 만성 염증 반응 등으로 특징 지워지며 결국에는 연골세포가 세포외기질의 합성과 침식 사이의 균형 조절에 실패함으로서 관절 연골의 감소와 완전 소실로 귀결된다¹²⁾.

퇴행성 관절염의 발병기전은 연골기질의 손상 또는 변화, 조직의 손상에 대한 연골세포의 반응, 세포 반응의 감소로 설명된다. 연골에 작용하는 부하와 IL-1과 TNF-α에 의해 nitric oxide(NO)가 발생되어 기질의 변화와 연골세포의 사멸을 가져 온다고 주장되기도 한다³⁾.

골관절염은 비염증성 관절염이지만 연골파괴 가 진행되면 염증과 연관된 변화들이 초래된다.

활막은 경하거나 중간 정도의 염증반응을 보이는 데, 이것은 부분적으로는 활액에 있는 파괴된 연 골조각으로 인해 염증반응이 생기기 때문이다

12,13)

. 염증은 상처를 줄 수 있는 자극에 대한 생 체의 방어 반응으로, cytokines, prostaglandin E2,

lysosomal enzyme, free radicals 등 다양한 매개 물질이 관여하고 있다^14,15). 염증반응을 일으킬 수 있는 세포에 외부자극이 가해지면, 활막세포는 matrix metalloproteinases(MMPs), IL-1, IL-6, TNF-α와 같은 연골을 파괴하는 효소를 생산하게 되고, 이것들은 연골세포로 하여금 더 많은 파괴 효소를 만들도록 자극한다^15,16). IL-β와 TNF-α 등 의 proinflammatory cytokines의 발현이 유도되 고, 유도된 proinflammatory cytokines이 중성구 를 활성화하여 염증 부위로 이동시키고, iNOS, COX-2를 코딩하는 유전자의 발현을 자극함으로 써 염증반응에 관여하는 NO, prostaglandin E2의 반응성 물질을 생성하게 하여 염증반응이 일어나 게 되는데, 이중 NO는 혈관 확장 및 조직 손상에 주로 관여하고, prostaglandin E2는 통증과 발열 의 전달에 주로 관여하는 중요한 염증매개물질로 알려져 있다^17-20). 만성염증에서는 NOS, cyclooxygenase (COX)와 같은 효소 및 signaling proteins의 상승 을 가져와 NO와 prostaglandin을 과량 생성하게 된다^15,20).

痺證이란 인체에 風寒濕의 邪氣가 침범하여 關節酸楚, 疼痛, 重着, 腫大, 活動障碍 등의 증상 등이 나타나는 병증을 말하며 이러한 병리적 변 화가 관절을 중심으로 나타나게 되면 關節痺證이 라 부르고 골관절염, 류마토이드 관절염, 라이터 증후군 등이 關節痺證에 속한다¹⁾. 痺證은 그 원 인에 따라 行痺, 痛痺, 着痺, 熱痺, 瘀血痺, 虛痺 로 나뉘며 그 중 濕邪가 편승한 痺證을 着痺 또 는 濕痺라 한다¹⁾. 着痺란 氣血不足으로 心身이 고갈되고 脾胃運化가 失常하면 正氣가 下降하여 外濕이 침범한 것으로, 특징은 肢節疼痛 하면서 통증 부위가 일정하고 重滯感이 두드러지게 나는 것이다¹⁾. 또한 虛痺중 陽虛痺는 陽氣가 부족하여 表衛가 不固하여 外邪가 침습함으로써 관절이 간 헐적으로 아프게 되고 形寒肢冷, 關節冷感의 증

(16)

상을 호소하는 병증을 말한다¹⁾. 痺症의 치료 원 칙은 寒者는 溫之하고, 熱者는 淸之하며, 濕瘀痰 등의 有形之邪가 있으면 去之하고, 虛者는 補之 하는 것이다. 또한 痺症의 주요한 임상증상은 痛症이며 이는 병리적으로 氣血不通하여 나타나는 것이므로 宣通은 각종 痺症의 공통된 치법이 된 다¹⁾.

본 실험에 사용된 BBT는 방기, 복령, 황기, 계 지, 감초로 이루어진 약물로 풍습성 질환에 자주 쓰인다^1,8). 특히 방기는 관절염에 대한 단일 약물 로서의 효과도 여러차례 보고된 바 있다^21-24). 풍 습증의 관절염에 방기황기탕을 다용하는데 본 실 험에 쓰인 BBT는 방기황기탕에서 출, 생강, 대추 가 빠지고 계지와 복령 가미된 처방으로 방기황 기탕이 表裏에 水가 있는 자에게 쓰는 처방이라 면 본방은 裏의 水에 더 집중된 처방이라 하겠다

7). 또한 有形之邪는 去之하고, 虛者는 補之하며 宣通하는 것이 공통된 치법임을 봤을 때 防己, 茯苓 등은 水濕之邪를 去之하고 黃芪, 甘草는 補之하며, 桂枝는 宣通한다고 볼 수 있겠다. 퇴행성 슬관절염의 치료에 대한 연구 동향을 분석한 결과 다용 약물로는 甘草 8회(44.4%), 當歸 6회(33.3%), 牛膝, 杜冲, 白芍藥 각 5회(27.8%), 蒼朮, 防己, 黃芪 각 4회(22.2%) 순이다. 단미 한약재로는 夏枯草, 牛膝, 秦艽, 威靈仙, 黃芪가 사용되었다^8,24). 이 에 BBT가 관절염 치료에 유용할 것이라 생각하 여 본 실험을 계획하게 되었고, 그 결과 BBT가 각종 염증 cytokine의 생성 억제 및 유전자의 발 현 억제에 효과가 있다는 것과 관절 연골면의 보 호에도 효과가 있다는 결론을 얻을 수 있었다.

국내에서 사용되는 한약재명 방기로는 분방기, 목방기, 광방기 등이 있으며 2001년 시중 유통 중 이던 방기류에서 발암물질이 검출되어 현재는 대한 약전에 방기 정품으로 규정된 淸風藤(Sinomenium acutum)만 수입 및 통관될 수 있게 하였기에⁸⁾,본

실험에서 방기는 淸風藤을 사용하였다. Sinomenine 은 방기에서 추출한 alkaloid로 항염증, 진통, 면역 조절 효능으로 인하여 류마토이드 관절염 및 골 관절염 등의 관절염에서 관절 연골 보호 효과가 입증된 바 있으며 IL-1β의 생성 억제, MMP-13과 TIMP-1의 불균형 해소, TNF-α와 IL-1β mRNA 발현의 감소, prostaglandin E2와 NO의 생성 억 제 등이 보고된 바도 있다^21-23).

계지는 cinnamaldehyde, coumarin, β-sitosterol, protocatechuic acid 등의 화학성분을 함유하며, 진정, 진통, 해열, 소염, 향균, 항바이러스, 항암 작용 등의 약리 작용을 가진 것으로 알려져 있 다. 계지 추출물을 경구 투여한 실험에서 대조군 에 비하여 유의성 있는 부종 억제 효과와 NO와 prostaglandin E2 생성율의 저하, iNOS 및 COX-2 의 발현 감소가 확인된 바 있다¹⁴⁾. 이러한 연구 결 과를 통해 계지의 염증성 질환 치료제 개발 가능 성을 확인할 수 있겠으며 계지의 관절염 치료와 관련한 연구로는, 계지의 cinnamaldehyde 성분 에 대한 연구, 계지작약지모탕, 백호가계지탕, 계 지복령환 등 처방에 관한 연구, 계지 약침에 대 한 연구 등이 있다¹⁴⁾.

또한 rheumatoid arthritis를 유도한 생쥐에 계 지추출액을 경구투여 한 실험에서도 TNF-α 및 관절염 지수가 크게 감소하여 계지가 관절염의 소염에 효과가 있는 것으로 나와 본 실험에서 나 타난 항염 효과를 뒷받침한다²⁵⁾.

황기는 생리활성으로는 혈압강하작용, 이뇨 작 용, 강장 작용, 면역증강 작용, 항염작용 등이 보 고된 바 있는 약재로서, 이전 연구에 따르면 황 기는 COX-2 활성 억제 효과, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α 등의 생성 억제에 유효한 효과가 있는 것 으로 알려진 바 있으며 황기추출물이 골아세포에서 기인하는 기질물질을 조절하여 연골회복을 촉진 한 바 있다^26-28). 본 실험에서 BBT이 염증성 cytokine

(17)

의 분비를 감소시켜 관절염의 염증 반응을 억제 하는 효능에 있어서는 양성대조군과 유사하거나 더 유의성 있는 결과가 나온 반면, cartilage volume이 나 proteoglycan의 보존에 있어서는 양성대조군 에 비하여 상대적으로 효과가 덜한 것으로 나타 났는데 황기의 농도를 달리하여 그 결과를 얻어 낸다면 더 의미있는 결론이 나올 것을 유추해볼 수 있겠다.

감초는 항염증, 항바이러스, 항산성 효능이 있 는 것으로 알려져 있으며 촉매를 용매를 달리한 항염증 효능 평가에서 NO, TNF-α, prostaglandin E2 생성 억제에 유의한 효과가 있는 것으로 나타

났다^29,30). 또한 작약감초탕의 항염증 효과 실험에

서도 IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α의 감소를 가져와 염증성 cytokine들의 생산에 영향을 주어 염증 억제 효과에 긍정적으로 작용하는 것으로 나타났 다³¹⁾.

복령은 항염 효과 외에도 면역 반응 조절, 혈관 생성 억제 효능이 있어 항암물질로서 다용되고 있 으며³²⁾, COX의 활성 억제, luekotreine B4의 분비 억 제 등의 효과가 있어 만성 염증의 치료에 적용할 수 있다³³⁾.

BBT는 皮水表虛의 증을 치료하는 처방으로, 脾肺氣虛로 衛陽이 虛滯되어 水濕을 運化와 散布 시키지 못하고, 水濕의 邪氣가 피부에 침입한 것 을 해결하여 四肢腫의 증상을 치료한다³⁴⁾. 방기, 복령으로 利水하고 계지로서 通陽하며 감초는 調中하고, 계지가 복령을 얻으면 不發表하고 도리 어 行水한다고 하였고, 황기, 감초가 表中之氣를 도와 방기-복령의 利水를 행하게 한다고 하였다.

BBT는 한마디로 保衛通營, 祛散皮水하는 처방이 다³⁴⁾. 따라서 BBT는 痺證 중에서도 着痺 또는 虛痺에 더 적합한 처방이라고 하겠으며 水濕으로 인한 水腫 치료에 효과가 좋으므로 골관절염 중 에서도 부종을 동반한 경우나 고령 및 허약자의

치료제로서 유의성이 있을 것으로 생각된다. 또 한 水濕의 개선과 고지혈증의 개선이 입증⁹⁾된 바 있으므로 골관절염의 원인 중 비만이 차지하는 순위가 높은 환자에게 우선적으로 적용될 수 있 을 것으로 생각된다.

BBT의 구성 약물인 방기, 복령, 계지, 황기, 감 초의 효능을 종합해보면, 항염증 효과 및 각종 염증매개 인자의 발현의 억제 효과와 연골 보호 효과가 있는 것이 이미 선행 연구에 의해 증명된 바 있고, 본 실험에서도 염증 cytokines 및 염증 매개인자의 발현이 억제되는 결과가 나왔다.

많은 수의 혈청 효소에 대한 분석이 간세포 손 상의 표식자로 제안되었지만, 그 중 AST 및 ALT 가 가장 유용하다. 혈청 AST와 ALT는 거의 모든 간질환에서 어느 정도 증가한다³⁵⁾.

혈액과 요중의 BUN 및 creatinine 함량은 신 장 기능을 평가하는데 매우 중요한 인자 중의 하 나이다. 이들은 신장의 기능저하에 의하여 혈중 농도가 상승하는 경향을 가지고 있다. 만성 신부 전 같은 질환에서 BUN과 creatinine 농도의 증가 와 관련된 증상과 증후가 나타는 경우가 많다.

특히 creatinine은 골격근 대사과정의 부산물이어 서 혈장에 비교적 일정한 농도로 존재하므로 환 자의 정맥에 따로 투여할 필요가 없기 때문에 신 장 기능의 평가에 다양하게 이용되고 있다³⁵⁾.

본 실험 연구에서 BBT를 경구투여 한 결과 AST와 ALT는 정상군에 비하여 큰 차이가 없었 으므로 간독성에 영향을 미치지 않아 약물로서 안전한 것으로 나타났으며 BUN과 creatinine은 정상군과 대조군에 비하여 유의하게 낮거나 적은 수치를 나타내어 신독성으로부터 안전한 것으로 나타났다.

IL-1은 생체에서는 감염, 조직장애 등의 자극 에 우선적으로 반응하여 급성기 염증성 단백 생 산을 유도하는 cytokine³⁵⁾으로서, 골관절염에서

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이화작용 진행에 가장 중요한 역할을 담당하는 cytokine이다. Collagen과 proteoglycan 같은 기 질 구조물의 합성을 억제하고 prostaglandin과 leukotriene 같은 물질의 합성과 분비를 촉진하는 역할을 하여 관절연골의 파괴를 가져온다. 일반 적으로 골관절염의 발생은 IL-1β, TNF 등 T cell 의 cytokine의 생산이 증가되면서 단백질 분해 효소의 분비가 증가되어 관절연골의 파괴로부터 시작되는 것으로 알려져 있다^36-38).

TNF-α는 골관절염에서 연골 기질의 침식과 뼈 의 재흡수에 있어 주된 역할을 하며³⁹⁾, IL-6, IL-8 및 MMPs와 같은 하위 염증 매개 물질의 생성을 유발하여 염증을 증폭시키고 관절연골기질로부 터 proteoglycan의 소실율을 증가시키고 재합성 은 억제시켜 관절연골을 손상시키고 골관절염의 진행을 유도한다³⁹⁾. Anti IL-1β therapy와 anti TNF therapy가 관절염 환자의 치료에 효과가 있 다는 보고가 있어 IL-1β, TNF-α가 관절염의 병리 에 중요한 역할을 함을 알 수 있다^40,41).

IL-6는 활막세포 증식과 파골세포의 활동을 촉 진시켜 pannus 형성과 단백기질분해 효소 생산 을 야기하여 연골 관절을 파괴하며, 혈청 및 관 절염으로 손상된 관절의 관절액에서 활성도가 증 가하기 때문에 골관절염의 활성도와 연관이 있다 고 생각된다⁴²⁾. 또한 IL-6이 활액막이나 관절조직 의 혈관에서 분비되어 혈청에서보다 관절액에서 더 높은 활성도를 보인다고 하였는데, 이는 IL-6 이 골관절염에서 면역반응의 매개체로서 중요한 역할을 담당함을 알 수 있다^42,43).

본 실험에서는 BBT가 IL-1β, TNF-α, IL-6 등의 염증성 cytokine의 혈청내 수치를 유의성 있게 감소시켰을 뿐만 아니라 TNF-α mRNA 발현 또 한 억제한 것으로 나타났다. 그리고 유의성은 없 었지만 IL-1β mRNA와 IL-6 mRNA의 발현 또한 대조군에 비하여 낮은 수치를 나타냈다. 따라서

BBT이 골관절염의 진행에 있어서 시발점이라 할 수 있는 염증성 매개인자의 발현을 억제시켜 관 절 연골의 이화작용과 파괴를 감소시킴으로서 골 관절염의 진행을 억제시켜준다고 할 수 있겠다.

본 실험에서는 Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)의 수치 또한 유의성 있게 감소하였는데 MCP-1은 주로 단핵구나 대식세포에서 생성되어 단핵구와 CD4+ T 세포에 작용하는 chemokine으로, 단핵구의 감염 부위 동원에 필수적이며, MCP-1 의 생성은 TNF-α, IL-1, IFN-γ 등과 같은 자극에 의해 유도되며 다양한 만성 염증성 질환과 관련이

있다^44,45). 본 실험에서 BBT 실험군에서 MCP-1의

수치가 유의성 있게 감소하였다는 것은 BBT이 proinflammatory cytokines의 합성을 유도하는 물질의 생산을 억제함으로써 염증 반응의 감소를 가져오는 효과가 있을 것으로 유추할 수 있겠다.

따라서 BBT이 골관절염에서 발생되는 초기 염증 반응을 억제하여 통증 및 연골의 파괴를 억제할 수 있을 것으로 생각된다.

Arachidonic acid는 기계적 자극, cytokines, 호 르몬 등에 의해 세포지질막에서 분비되어 eicosanoids 전환되는 불포화지방산이며, 염증반응에서 eicosanoids 는 proinflammatory molecules, chemoattractants, platelet aggregating factors 등으로 발현되고 작 용한다⁴⁶⁾.

Leukotriene은 prostaglandin과 마찬가지로 arachidonic acid으로부터 유래한 eicosanoids이며³⁵⁾, 그 중 leukotriene B4(LTB4)는 류마토이드 관절염 환자의 관절액 중에서 증가하고 steroid성 항염증 약물 투 여로 감소한다는 보고가 있다^47,48). 염증성 반응의 중개자로 작용하는 많은 물질 중에서 leukotriene은 히스타민보다 수백배 정도로 강력하게 작용한다.

또 이런 leukotriene 중 leukotriene C4, leukotriene D4, leukotriene E4는 완만하게 반응하는 물질인 데 비하여 LTB4는 보다 강력한 화학주성을 나타

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낸다. LTB4는 비만세포와 대식세포에 작용해 중 성구 화학 주성과 혈관투과성을 증가시키며, TXB2

역시 비만세포에 작용해 혈소판 응집과 혈관 확 장을 일으킨다고 알려져 LTB4와 TXB2는 염증반 응 물질임을 알 수 있다^47,48).

본 실험에서 LTB4와 TXB2가 유의하게 감소하 였다는 것은 BBT가 염증 반응을 억제할 뿐만 아 니라 COX계 약물의 부작용 중 하나인 혈전 생성 을 억제할 수 있는 것으로 생각되어 관절염 치료 제로서 의미가 있을 것으로 생각된다.

염증 반응에서 통증과 발열을 주로 전달하는 중요한 매개물질인 prostaglandin은¹²⁾ COX-2가 관여하는 산화반응에 의해 생성되는 대사산물로 서 연골관절에서 이화 작용 및 동화작용 모두에 서 검출된다⁴⁹⁾. Prostaglandin E2(PGE2)는 최근 연 구에 의하면 염증, 세포사멸, 혈관신생 및 관절질 환에서 특징적으로 나타나는 구조적 변화에 관여 한다고 한다^50,51).

본 실험에서 BBT를 경구투여 한 실험군에서 PGE2 발현 역시 유의성 있게 감소하였는데, 이는 BBT가 관절염의 진행에 따른 통증 발생에 억제 효과가 있을 것으로 생각되는 바, BBT가 골관절 염의 치료제로서 의미가 있을 것으로 보인다.

백혈구는 염증 반응과 면역 반응의 주된 세포 성분이며 과립구(중성구, 호산구, 호염기구), 림프 구, 단핵구로 구성되는데³⁵⁾, 중성구는 보통 급성 염증에서 특징적으로 출현하나 지속적인 만성염 증에서도 상당수가 침윤하여 농양형성에 기여하 고 단핵구는 염증이 시작된지 48 시간에 최고에 다다르고 만성 염증에서는 단핵구의 침윤이 가장 특징적이며 림프구는 면역 혈청검사에서 면역 기 능을 평가하는 지표 중 하나이다⁴⁰⁾.

본 실험에서는 백혈구 중에서도 염증 반응과 관련이 깊은 중성구와 단핵구의 수치를 조사하여 BBT 경구투여 군에서 대조군에 비해 유의성 있

게 감소된 수치가 나왔는데 이를 통해 BBT가 급 성 염증 뿐만 아니라 만성 염증에서도 효과를 보 여 관절염의 염증 반응을 억제할 수 있을 것으로 생각된다.

COX-1은 보호 작용을 맡은 효소로서 몸 어디 에나 있으며 혈소판에서는 유일하게 발견되는 효 소로 다양한 생리적인 반응을 매개하는 반면, COX-2는 주로 염증과 관계되는 대식세포, 단핵 구세포, 활액막세포에서 높게 발현된다. 이론적으 로 COX-2를 선택적으로 억제하면 위장관 점막의 세포보호 및 혈소판 기능을 억제하지 않으면서 항염작용을 나타낼 수 있을 것이다⁵³⁾. COX-2는 prostaglandin의 형성에 관여하며, COX-2에 의해 형성되는 prostaglandin은 통증, 염증과 발열을 전달한다⁵⁰⁾. COX-2와 PGE2의 상호의존적인 합성 은 염증성 골질환에서 조직 파괴의 중요한 매개 자로 인식되고 있다⁴²⁾.

iNOS는 NO의 과량 생성을 조장해 골관절염 연골세포에서 염증성 cytokine의 분비와 이화작 용을 촉진하는 효소를 말한다⁴⁹⁾. iNOS에 과량 생 성된 NO는 proteoglycan과 collagen의 합성을 모두 억제하며 기질분해효소로서 작용하여 연골 세포의 사멸과 연골세포의 염증 반응을 조장한다

54). 세포내에 항상 존재하며 소량의 NO를 생성 하는 cNOS와는 달리 iNOS는 염증 등의 자극에 의해 활성화된 대식세포 등에 유도되어 과량의 NO를 생성하고, 과량으로 생성된 NO는 TNF-α, IL-1 및 IL-6 등 proinfalmmatory cytokines 뿐만 아니라 COX-2와 같은 염증매개물질을 과량 생산 하여 과도한 면역반응을 야기한다⁵⁵⁾.

진 등⁵⁶⁾의 연구 결과에 따르면 인체의 골관절 염에서 nitrotryosin의 발현율과 세포자멸사율은 골관절염의 등급이 높아질수록 서로 비례하여 증 가하였으며, 발현 부위도 초기에는 소수의 세포 들이 표층에서 주로 발현하다가 골관절염이 진행