대한소화기학회지 2000;36:583 - 596
접수: 2000년 9월 15일, 승인 : 2000년 10월 25일
연락처 : 정현채, 110-744, 서울시 종로구 연건동 28번지, 서울대학교 의과대학 내과학교실 Tel: (02) 740-8120, Fax: (02) 743-670 1
※ 본 연구는 보건복지부 공동연구개발과제(HMP-00-CH-02-0002)의 연구비 지원으로 이루어졌음 .
H e licobac te r p y lori 병독인자에 의한 인체 위상피세포의 친염증성 Cy t ok in e 발현과 A p opt os is 유도 및 임상 질환과의 관계
한양대학교 의과대학 미생물학교실 및 의과학연구소 , 서울대학교 의과대학 내과학교실 및 간연구소 *
김정목・김주성 *・정현채 *・고은주 *・송인성 *・김정룡 *
V i ru l e n c e F a c t o r s o f H e l ico ba c te r p y lo r i D o N o t In f lu e n c e o n P r o i n f la m m a t o ry C y t o k i n e G e n e E x p r e s s i o n , A p o p t o s i s o f H u m a n G a s t r i c E p i t h e l i a l
C e l l s a n d t h e C l i n i c a l Ou t c o m e i n K o r e a
J u n g M o g g K i m , M .D ., J o o S u n g K i m , M .D .*, H y u n C h a e J u n g , M .D .*, E u n -J u G o h , M .S .*, I n S u n g S o n g , M .D .* a n d C h u n g Y o n g K i m , M .D .*
Dep artment of Microbiology and Institute of Biomedical Science, Hanyang University College of Medicine, Seoul;
Department of Internal Medicine and Liver Research Institute *, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea
Background/Aims: Cytotoxin-associated gene (cagA) and vacuolating cytotoxin (Vac) production have been reported to be major virulence factors of Helicobacter pylori. We evaluated whether cagA genotype and Vac production might be correlated with gastroduodenal diseases in Korea and whether this correlation could be due to difference in proinflammatory cytokine expression and apoptosis of gastric epithelial cells. Methods: The presence of cagA gene and Vac production were examined after H. pylori was isolated from Korean patients. Gastric epithelial cells were infected with cagA+Vac
+, cagA
+Vac
- or cagA
-Vac
-strains, and then, cytokine gene expression was evaluated using quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction. Apoptosis and caspase-3 activation were measured in H. pylori-infected epithelial cells. Results: There was no significant correlation between the presence of those virulence factors in isolated H. pylori strains and peptic ulcer or gastric cancer. Upregulation of the cytokine gene expression, including interleukin (IL)-1α, IL-8, GM-CSF and monocyte-chemoattractant protein 1, as well as apoptosis and caspase-3 activation showed no difference due to the infection with cagA -positive and cagA -negative strains. Moreover, they were not correlated with the production of Vac. Conclusions: These results suggest that the non-correlation between virulence factors of isolated H. pylori strains and gastroduodenal disease entities in Korea is due to similar capacity in proinflammatory cytokine gene expression and apoptosis by each H. pylori strain infection. (Kor J Gastroenterol 2000;36 :583 - 596)
Key Words: Virulence factors, Apoptosis, Cytokine, Gastric epithelial cells, Helicobacter pylori
5 8 4 대한소화기학회지 : 제 36 권 제 5 호 2000
서 론
Helicobacter p y lori는 만성 위염과 소화성 궤양의 중요한 원인균이다 . 이 균에 의한 초기 염증반응은 숙주 위상피세포층과의 상호작용을 통하여 나타난 다 . 즉, 감염 한 시간 이내에 interleukin (IL)-8과 같 은 chem okine 유전자뿐만 아니라 IL- 1, tumor necrosis factor (TNF)-α와 같은 일련의 친염증성 cytokine 유전자 program이 활성화된다 .1 ,2 결과적으 로 H. py lori 감염은 최종적으로 위상피세포의 apop- tosis로 연결된다 .3 - 5 따라서 chem okine에 의한 염증 세포의 위점막 내 유입, 위점막의 위축, 위상피세포 의 apoptosis 증가 등은 H. py lori 감염증의 중요한 병리조직 소견이다.
H. p y lori 병독인자들로는 세포독소연관 단백질 (cytotoxin -associated protein , cagA )과 세포독소(va- cuolating cytotoxin , Vac) 등이 알려져 있다 .6 ,7 특히 cagA 유전자는 cag pathogenicity island (PAI)의 일 부분을 구성하고 있는 병독인자로서,8 ,9 서구에서 분 리된 H. py lori 균주의 약 60-70%에서 존재하고 있 고, 약 120 kD의 단백질을 생성해내는 정보를 보유 하고 있다 .7 , 10 , 1 1 한편 약 87 kD 단백질인 H. pylori 세포독소는 인체 위상피세포에서 vacuolation을 유 도한다.12
현재 cagA 유전자 또는 세포독소 생성능을 지닌 H. p y lori 균주의 감염은 이와 같은 병독인자를 보유 하지 않은 균주에 비해 소화성 궤양이나 위암과 같 은 보다 심각한 위장질환과 관련이 높다는 보고들 이 발표되고 있다 .1 1 , 13 - 17
이와 더불어 cagA 유전자를 지닌 H. pylori 균주가 이 유전자를 보유하지 않은 균주에 비하여 위상피세포에서 대표적 chemokine인 IL-8을 유도하는 능력이 더 높다는 보고가 발표되기 도 하였다.1 8 , 19 그러나 위의 보고와는 반대로 cagA 유전자 또는 세포독소 생성능과 임상증상과는 별 연관관계가 없다는 보고들도 있다 .2 0 - 2 4 따라서 이들 병독인자들이 인체 위상피세포에 대한 친염증성 cytokine 발현과 apoptosis 유도에 미치는 영향은 아 직까지 확실하게 규명되지 못하고 있는 실정이다 .
본 연구에서는 이들 병독인자의 존재 유무가 우
리 나라 환자의 임상증상과 관련되는지를 연구하였 다 . 동시에 이들 인자가 위상피세포에서의 친염증성 cytokine 발현과 어떤 연관관계를 나타내는지를 알 아보기 위하여 실험실에서 배양한 인체 위상피세포 를 cagA+Vac+, cagA+Vac- 또는 cagA-Vac- H. py lori 균주로 감염시킨 뒤, 발현되는 각종 친염증성 cytokine 유전자를 정량적 역전사 중합효소반응법 (reverse transcription polymerase chain reaction , RT- PCR)으로 검사하였다 . 이와 더불어 위상피세포에서 나타나는 caspase-3 활성도와 apoptosis를 검사하여 H. p y lori 병독인자와 위상피세포 반응과의 관계를 규명하였다 .
대상 및 방법
1. H . p y lo r i 분 리 및 배 양
본 연구에 사용한 H. py lori 균주는 서울대학교병 원에서 소화불량 증상으로 위내시경을 시행한 12 1 명의 환자로부터 분리한 균주였다 . 위내시경 시행 직전 3개월 동안 항생제, proton pump inhibitor, 또 는 비스테로이드성 소염제를 복용한 환자는 본 연 구에서 제외하였다. 각 환자의 위전정부에서 5점, 위체부로부터 2점씩의 조직을 채취하였다. 위전정 부에서 채취한 조직 중 1점은 CLO kit (CLO test, Delta West, Bentley, Australia)를 이용하여 urease 활성을 측정하였고, 2점은 병리조직검사에 이용하 였으며, 나머지 2점은 H. py lori 분리에 이용하였다.
위체부로부터 얻은 2점의 조직은 병리조직검사에 사용하였다 .
균 분리를 위하여 채취한 위점막을 무균 Petri dish에 넣고 수술용 칼을 이용하여 잘게 부순 뒤 H.
p y lori 분리용 배지(GC medium base, 0.024 % yeast extract, 1% hemoglobin, 1% IsoVitalex, 5 mg/L vancomycin, 1 mg/ L mycostatin, 5 % sheep blood)에 심어서 37℃ 미세호기조건(microaerophilic condi- tion, 5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2)에서 배양하였다 . 초기 배양에서 얻은 집락은 재배양한 뒤, 그람염색 과 생화학적 방법을 이용하여 H. py lori 임을 확인하 였다 . 확인된 각 균주들은 15% glycerol이 포함된 Brucella 액체배지(Difco Laboratories, Detroit, Mich .,
김정목 외 5인. H. pylori 병독인자 5 8 5
U SA)에 넣어 -70℃에 보관하였고, 실험 직전 녹인 뒤 증식시켜 사용하였다. 각종 친염증성 cytokine과 apoptosis 실험을 위하여 계대배양 횟수가 10회 미 만의 균을 이용하였다. 한편 실험 대조균으로는 Camp y lobacter j ej uni, Camp y lobacter f etus subsp.
f etus 및 비병원성 대장균인 Es cherichia coli DH5α (Promega, Madison , Wis., U SA)를 이용하였다 .
2 . H . p y lo r i 균 주 의 병 독 인 자 확 인 1) 병 독 유 전 자 확 인
H. p y lori genomic DNA는 hexadecyltrimethyl ammonium bromide (Sigma, St. Louis, Mo ., USA)와 proteinase K (Sigma)를 이용하여 분리하였다. 그 뒤, 병독인자로 보고된 adhesin (hp aA ),2 5 cagA ,2 6 vacA 1/
A 32 7 유전자에 대한 특이 primer를 이용하여 PCR을 시행하였다 . PCR 실험에 사용한 oligonucleotide primer의 염기서열은 다음과 같다 . 즉, adhesin, sense 5＇-GCG TGG TGG CTT TAT TAG TGG-3＇, antisense 5＇-ACT CAT AGG CTC TAG TAT GGT AAC C-3＇; cagA , sense 5＇-GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAT G-3＇, antisense 5＇-CTG CAA AAG ATT GTT TGG CAG A-3＇; vacA 1, sense 5＇-ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC-3＇, antisense 5＇- CTC CAG AAC CCA CTC GGT T-3＇; vacA 3, sense 5＇-TAC AAA CCT TAT TGA TTG ATA GCC-3＇, antisense, 5＇-AAG CTT GAT TGA TCA CTC C-3＇. 이들 PCR 산물의 크기는 adhes in 유전 자의 경우 460 bp, cagA 유전자는 348 bp, vacA 1 유 전자는 730 bp, vacA 3 유전자는 6 15 bp였다 . PCR은 세균 genomic DNA 200 ng을 10 m M Tris (pH 8.3), 50 m M KCl, 1.5 m M MgCl2, 각 200 mM의 deoxyadenosine 5＇-triphosphate (dATP), deoxycyti- dine 5＇-triphosphate (dCTP), deoxyguanosine 5＇- triphosphate (dGTP), deoxythymidine 5＇-triphosphate (dTTP) 및 25 pmole의 5＇ 및 3＇ prim er가 포함된 50 μL 용액에 넣어 hot-start법으로 시행하였다. 온도 조건은 therm al cycler (GeneAmp PCR System 9600, Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn ., USA)를 이용 하여 95℃에서 30초 동안 denaturation을 시행하고 60℃에서 30초 동안 annealing, 72℃에서 30초 동안
extension을 시행하는 cycle을 33회 반복하였다 .
2 ) 세 포 독 소 생 성 균 주 확 인
세포독소(vacuolating cytotoxin) 생성 균주를 확인 하기 위하여 분리한 H. py lori 각 균주를 10 % 우태 아혈청(fetal bovine serum , FBS, Hyclone Labora- tories Inc ., Logan, Ut ., USA)이 포함된 Brucella 액 체배지에 접종한 뒤, 호기성 조건하에서 shaker (Environ-shaker 3597, GMCO Lab Line, Melrose Park, Ill ., USA)를 이용하여 72시간 동안 배양하였 다 . 그 뒤, 배양상청액을 동결건조법과 초여과법을 이용하여 20배 농축시키고, 세균 잔존물을 제거하기 위하여 0.22 μm filter를 이용하여 여과하였다. 이 농축액을 인산완충액(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4)으로 연속 희석하여 monolayer로 키운 HeLa 세포(ATCC CCL2)에 18시간 작용시킨 뒤, 세포질 내의 vacuolation을 관찰하였다.6 ,2 8
3 . 인 체 위 상 피 세 포 배 양 및 H . p y lo r i 감 염 실험에 이용한 인체 위상피세포주로는 AGS (ATCC CRL 1739), Hs746T (ATCC HTB 135), KATO-III (ATCC HTB 103)와 SNU -5 (KCLB 0005)였다 . 이들 세포들은 Dulbecco 's modified Eagle 's medium (DMEM, pH 7.4, Sigma), RPMI- 1640 (Sigma) 또는 Ham ' s F 12 (Sigma)에 10 % FBS 와 항생제( 100 unit/mL의 penicillin, 100 μg/mL의 streptomycin)를 사용하여 37℃, 5 % CO2 조건에서 배양하였다 .
세균 감염은 항생제가 제거된 상태에서 각 세포 를 6-well tissue culture plate에 24-48시간 동안 배양 한 다음 균수 :위상피세포의 비율이 250:1이 되게 균 을 첨가하였다. 균수 측정은 McFarland scale 또는 hemocytometer를 이용하였다 .
4 . R N A 추 출 및 R T - P C R
위상피세포주에 H. pylori를 일정 시간 동안 감염 시킨 뒤, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 법으로 세포 RNA를 분리하였다. IL- 1α, IL-8, m onocyte chemotactic protein (MCP)- 1 및 granulo- cyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)
5 8 6 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 36, No. 5, 2000
에 대한 정량적 RT-PCR은 표준 합성 RNA를 이용 하여 기존의 방법대로 시행하였다 .2 9 즉, 일정 수의 표준 합성 RNA를 추출한 세포 RNA와 함께 역전사 를 시행한 후, 얻어진 cDNA를 각종 cytokine에 특 이한 primer를 이용하여 PCR을 시행하였다. PCR 증폭은 thermal cycler (GeneAmp PCR System 9600) 를 이용하여 1분 동안의 denaturation, 2.5분 동안의 annealing 및 extension (IL- 1α, IL-8 및 MCP- 1은 6 0℃ ; GM-CSF 65℃ ; β-actin 72℃)으로 구성하였으 며, 총 시행 횟수는 32회였다 . 양성 대조군으로는 IL- 1α, IL-8, GM-CSF와 β-actin의 경우 5637 human bladder carcinoma cells (ATCC HTB 9)로부터 분리 한 RNA, 그리고 MCP-1의 경우 Caco-2 colon carcinoma cells (ATCC HTB 37)로부터 분리한 RNA를 이용하였다 . 모든 실험은 3회 이상 반복 시 행하였다 .
PCR 생성물은 2 % Nu Sieve agarose gel (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, USA)을 이용한 전기 영동으로 분리하고 폴라로이드 필름에 영상을 기록 하였다. 이 영상을 imaging densitometer (GS-670, BioRad, Hurcules, Calif., USA)로 처리하여 각 PCR 밴드의 peak에 해당하는 면적을 구하였다. 그 뒤 세 포 RNA로부터 얻은 PCR 면적과 표준 RNA로부터 얻은 PCR 면적 비를 이중 로그 스케일을 이용하여 표준 RNA 분자 수와 동일한 등전점(equim olar point)을 구하여 세포 RNA 내에 존재하는 cytokine m RNA 분자 수를 계산하였다. 한편 5× 103/μg RNA 는 평균 20개 세포 당 1개 분자의 mRNA transcript 가 발현되는 수치이므로 cytokine m RNA 분자 수가 5× 103/μg RNA 이상이 발현된 경우를 생물학적으 로 의미 있는 것으로 간주하였다 .3 0
5 . I L - 8 단 백 질 측 정
H. py lori를 감염시킨 세포에서 발현되는 IL-8 m RNA가 단백질 생성에까지 연결되는지를 알아보 기 위하여 배양상청액을 대상으로 효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 IL-8 양을 측정하였다 . ELISA 방법은 R&D System 사 (Quantikine, Minneapolis, Minn ., USA)의 kit를 이용하였고, 최소 측정 단위는 20 pg/mL이었다 .
6 . 위 상 피 세 포 의 a p op t o s i s 측 정
Apoptosis가 일어난 세포의 형태학적 변화를 검 사하기 위하여 위상피세포를 PBS (pH 7.4)로 1회 세척한 뒤 기존의 방법3 1대로 Hoechst 33258 [5 μg/
mL; 2＇-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-piperazinyl)-2,5- bi- 1H-benzimidazole; CalBiochem , La Jolla, Calif., U SA]을 이용하여 37℃에서 10분 동안 염색한 뒤, epifluorescence microscopy (Axiophot, Carl Zeiss, Oberkochen, Germ any)로 apoptotic body 또는 DNA 분절화를 관찰하였다 .
형태학적 검사로는 객관적인 apoptosis의 정량이 불가능하므로 DiOC6(3)을 이용한 생화학적 검사로 apoptosis의 증감 정도를 측정하였다 . 즉, apoptosis 가 일어난 세포는 mitochondria로부터 cytochrome c 의 분비에 이어 m itochondrial transm embrane po- tential (Δψm)이 감소된다는 점을 이용하여 Δψm에 의하여 세포 내로 유입될 수 있는 DiOC6(3) (3＇
3-dihexyloxacarbocyanine iodide ; Molecular Probes, Eugene, Oreg., USA) (40 nM)로 위상피세포를 37℃
에서 15분 동안 염색한 뒤, flow cytometry (Becton Dickinson , Mountain View, Calif ., USA)로 Δψm이 감소되어 있는 apoptosis 세포들을 관찰하였다.3 1
동시에 apoptosis가 진행 중인 세포에서 나타나는 DNA 분절화를 알아보기 위하여 cell death detection ELISAp lu s kit (Boehringer Mannheim GmbH, Ger- m any)를 이용하여 세포질 내의 nucleosome을 측정 하였다. 즉, H. py lori를 감염시킨 위상피세포 ( 1×
105)의 lysate를 만든 뒤, 미리 streptavidin이 coating 되어 있는 well에 가하였다. 그 후 biotin이 결합된 마우스 항-histone 단세포군 항체를 첨가하여 실온 에서 1시간 동안 방치한 다음, peroxidase가 결합된 마우스 항-DNA 단세포군 항체를 1시간 동안 가하 였다. 최종적으로 2,2＇-azino-di(3-ethylbenzthiazolin- sulfonat)로 10분 동안 발색시킨 다음, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편 세포질 내로 유출된 oligonucleosome의 상대적 증가율은 제조회사의 설 명서대로 감염시키지 않은 대조군에 대한 감염군에 서 나타나는 상대적인 흡광도의 비율(enrichment factor)로 표기하였다 .
Kim, et al. H. pylori virulence factors 5 8 7
7 . H . p y lo r i에 감 염 시 킨 위 상 피 세 포 에 서 의 c a s p a s e - 3 활 성 도 측 정
Caspase-3의 활성도는 기존의 방법대로 p -nitroa- nilide (pNA)로 label된 Asp-Glu -Val-Asp (DEVD)의 분해 정도로 측정하였다.3 2 즉, trypsin 처리하여 떨 어뜨린 위상피세포를 PBS로 1회 세척한 다음 3×
106개의 세포에 lysate buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7 .5), 10 mM NaH2PO4/ NaHPO4 (pH 7 .5), 130 mM NaCl, 1% Triton -X 100, 10 mM NaPPi]를 첨가하였 다 . 그 뒤 얼음 속에서 20분 동안 방치한 뒤, 4℃에 서 12,000 rpm으로 3분 원침하여 상청액만을 회수 하였다. 이 상청액에 1 mM HEPES buffer와 함께 50 μM의 DEVD-pNA (Clontech , Palo Alto, Calif ., U SA)를 첨가한 뒤, 37℃에서 한 시간 방치하였다.
그 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도 를 측정하여 대조군과 비교한 상대적 수치로 caspase-3의 활성도를 평가하였다 . 양성 대조군으로 는 인체 T세포 림프종 세포주인 Jurkat 세포에 항- Fas 단세포군 항체(clone CH- 11, IgM, Upstate Bio- technology, Lake Placid, N .Y ., U SA) (50 ng/mL)을 8시간 동안 가하여 얻은 세포 파쇄액을 이용하였다.
한편 각 실험마다 DEVD-pNA의 첨가에 앞서 caspase-3 억제제인 Asp-Glu -Val-Asp-CH2F (DEVD -
fmk ; Clontech)를 사용하여 증가된 caspase-3 활성도 가 DEVD-fmk (50 μM)에 의하여 억제되는지를 확 인함으로써 활성도 증가가 특이적인 것인지를 평가 하였다.
결 과
1. 위 장 관 질 환 을 지 닌 한 국 인 환 자 로 부 터 분 리 한 H . p y lori 균 주 의 병 독 인 자 분 포 율 총 12 1명의 환자를 대상으로 균 분리를 시행한 결과 82%에서 CLO 검사 양성이었고, 62명(5 1%)에 서 균을 분리할 수 있었다 . 분리 균주 중 80%에서 세포독소(Vac)를 분비하고 있었고, 95 % 이상의 균 주에서 cagA , vacA 1/A 3 및 adhesin 유전자를 보유하 고 있었다(Table 1). 이와 같은 병독인자 보유 유무 와 위내시경적 소견과의 관계를 평가해 본 결과, 분 리된 H. py lori 균의 cagA , vacA 1/ A3 및 adhesin 유 전자 보유 유무와 내시경적 소견과는 아무런 상관 관계를 찾아볼 수 없었다 . 특히 비궤양성 소화불량 (non -ulcer dyspepsia) 환자로부터 분리된 균주 중 83 %에서 세포독소를 생성하고 있었고, cagA , vacA 1/
A 3 및 adhes in 유전자는 분리된 모든 균주가 보유하 고 있었던 것이 특징이었다(Table 2).
Table 1. Prevalence of Virulence Factors in H. p y lori Strains Isolated from Various Gastroduodenal Diseases
Endoscopic findings Vacuolating cytotoxin cagA gene vacA 1 gene vacA3 gene adhesin gene Total Normal mucosa
Gastritis Duodenitis Gastric cancer Total (%)
16 13 12 9 50 (80.6)
19 17 13 11 60 (96.8)
19 17 13 12 6 1 (98.4)
19 17 14 12 62 ( 100)
19 17 14 12 62 ( 100)
19 17 14 12 62
Table 2 . Prevalence of Virulence Factors in H. py lori Isolated from Non -ulcer Dyspepsia
Endoscopic findings Vacuolating cytotoxin cagA gene vacA 1 gene vacA 3 gene adhesin gene Total Normal mucosa
Gastritis Duodenitis Total (%)
12 3 1 16 (84.2)
15 3 1 19 ( 100)
15 3 1 19 ( 100)
15 3 1 19 ( 100)
15 3 1 19 ( 100)
15 3 1 19 (100)
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2 . H . p y lo r i 균 주 의 c ag A 유 전 자 또 는 세 포 독 소 보 유 유 무 에 따 른 인 체 위 상 피 세 포 주 에 서 의 cy t ok in e m R N A 발 현 변 화 본 저자들은 이미 H. py lori에 감염된 위상피세포 에서 각종 친염증성 cytokine이 발현됨을 증명한 바 있고,1 ,2 Table 2, 3에서와 같이 균주의 병독인자 보 유와 임상증상과는 상관관계가 없다는 점을 확인하 였기에 한국인으로부터 분리한 균주 중 cagA 유전 자 또는 세포독소 생성 유무에 따라 위상피세포로 부터 cytokine 발현 정도가 차이가 날 수 있는지를 검사하였다 . 검사 대상 cytokine은 CXC cytokine으 로 IL-8, CC chem okine으로 MCP- 1과 염증반응에 관여하는 친염증성 cytokine으로서 IL- 1α와 GM- CSF를 선정하였다 .
감염 세포로부터 RNA를 분리한 뒤 정량적 RT- PCR로 검사한 결과 H. p y lori에 감염된 Hs746T 세 포에서는 상기의 각종 친염증성 cytokine mRNA가 상향 조절되고 있었다 . 그러나 상향 조절된 cytokine m RNA 발현 분자수는 cagA 양성 및 음성 균에서 거의 비슷한 수치를 나타내고 있었고, 세포독소 생 성 유무와도 별다른 차이를 나타내지 못했다(Table 3) . 이와 같은 mRNA level에서의 증가 양상이 단백 질 level에서도 동일하게 나타나는지의 여부를 알아
보기 위하여 배양상청액을 대상으로 ELISA를 시행 하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 각각의 균주로 감염시킨 각종 위상피세포주에서의 IL-8 생성량은 cagA 유전자 및 세포독소 생성 유무에 따라 유의한 차이를 나타내지 못했다. 또한 Hs746T 세포 이외에 도 다른 세포주인 AGS, KATO-III, SNU-5 세포에서 도 동일한 결과를 나타내고 있음을 알 수 있었다 . 한편 기타 다른 세균인 C. j ej uni, C. f etus subsp.
f etus 및 비병원성 대장균인 E. coli DH5α를 KATO- III 및 SNU-5 세포에 12시간 동안 감염시킨 뒤 측정 한 IL-8 mRNA 분자 수와 단백질 양은 cagA+ Vac+ H. p y lori를 감염시킨 SNU-5 위상피세포에서 발현 되는 것에 비하여 대단히 미약하였다(Fig. 2).
3 . H . p y lo r i 균 주 의 c ag A 유 전 자 또 는 세 포 독 소 보 유 유 무 에 따 른 인 체 위 상 피 세 포 주 에 서 의 a p op t os is 변 화
H. py lori를 Hs746T 세포에 48시간 동안 감염시 킬 경우 이 세포는 전형적인 apoptosis를 나타낸다.3 그러나 Fig. 3에서 보는 바와 같이 cagA+Vac+, cagA+Vac-, 또는 cagA-Vac- 균주를 Hs746T 세포에 48시간 동안 감염시킨 뒤, DiOC6(3)을 이용하여 apoptosis가 일어난 세포 수를 측정하였지만, 이들 병독인자 유무에 따라 apoptosis에 유의한 차이를 Table 3 . Profiles of Proinflammatory Cytokine mRNA Expression in Hs746T Gastric Epithelial Cells Infected with H. py lori according to cagA or Vacuolating Cytotoxin Status*
Cytokines Control cagA+cytotoxin+ cagA+cytotoxin- cagA-cytotoxin- IL- 1α
IL-8 MCP- 1 GM-CSF β-actin
<5× 103 †
<5× 103
<5× 103 5.0× 104 7.6× 106
1.8× 107 (>3600) 4 .2× 107 (>8400) 1.6× 106 (>320) 4 .7× 106 (94) 9 .1× 106
1.5× 107 (>3000) 3.3× 107 (>6600) 1.2× 106 (>240) 5 .4× 106 ( 108)
6.7× 106
1.6× 107 (>3200) 7 .4× 107 (> 14800) 1.7× 106 (>340) 5 .7× 106 ( 114) 8.5× 106
* after Hs746T cells were infected with H. p y lori for 6 hours, cellular RNA was extracted . Quantification of cytokine m RNA was perform ed by RT-PCR using specific primers for each cytokine and synthetic standard RNA . Data represent results from a representative experim ent am ong three different experiments . Three data showed similar increase of the indicated cytokine gene expression in H. py lori-infected cultures compared with uninfected cultures .
† the number of cytokine transcripts/μg of total cellular RNA
parentheses mean fold-increase compared with the control of each cytokine .
김정목 외 5인. H. pylori 병독인자 5 8 9
Fig. 2. IL-8 secretion by SNU-5 gastric epithelial cells infected with H. pylori and other bacteria.
Culture supernatants were obtained after SNU-5 cells were co-cultured with the indicated bacteria for 12 hours. IL-8 levels were determined by ELISA. Data are expressed as the mean±SEM of five separate experiments. Control represents IL-8 production from uninfected controls.
Fig. 1. IL-8 secretion by gastric epithelial cells infected with H. pylori. Culture supernatants were obtained after gastric epithelial cells, AGS, Hs746T, KATO-III and SNU-5, were co-cultured with the indicated strains for 12 hours. IL-8 levels were determined by ELISA. Data are expressed as the mean±SEM of five separate experiments. Control represents IL-8 production from uninfected controls.
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나타내는 현상은 관찰할 수 없었다(Table 4). 이와 같은 생화학적 변화를 재확인하기 위하여 cell death detection ELISA를 이용하여 세포질 내로 유리된 oligonucleosome의 양을 측정한 결과 앞서와 유사한 성적을 얻을 수 있었다(Fig. 4). 한편 H. pylori를 감 염시킨 48시간 후 Hoechst 33258을 이용한 염색에 서도 cagA 유전자 및 세포독소 생성 유무에 따른 차 이를 관찰할 수 없었다(Table 4). 그러나 C. j ej uni, C. f etus subsp . f etus 및 비병원성 대장균인 E. coli DH5α를 Hs746T 세포에 48시간 동안 감염시켜도
cagA+Vac+ H. py lori 감염에서 나타나는 것과 같은 apoptosis는 관찰할 수 없었다(cagA+Vac+ H. py lori, 3.2±0.4; C. j ej uni, 0 .9±0 .2 ; C. f etus subsp . f etus, 1.2±0.4; E. coli DH5α, 1. 1±0 .6; cell death detec- tion ELISA 측정값, enrichment factor 평균± SEM, n =3).
Apoptosis 과정에는 세포기질을 분해시키는 데 필요한 caspase의 활성이 요구된다. 대표적인 것으 로 caspase-3을 들 수 있는데, 이것은 세포질 내의 DNase를 활성화시켜 핵내 DNA를 분절화시키는 Fig. 3. Flow cytometric analysis of apoptosis of Hs746T gastric epithelial cell line
infected with H. pylori. Confluent monolayers of Hs746T cells in six-well plates were left uninfected as a control (A), or were infected with cagA+Vac+ (B), cagA+Vac- (C) or cagA-Vac- (D) H. pylori strain for 48 hours. Adherent and nonadherent cells were pooled, and were incubated with 40 nM DiOC6(3) for 15 minutes at 37℃ and analyzed by flow cytometry. The area marked as M1 to the left of the maj or peak contains the apoptotic cell population. Quantitative data for M1 obtained in five independent experiments are presented in the results.
Kim, et al. H. pylori virulence factors 5 9 1
Fig. 5. Caspase-3 activation following H. pylori infection of Hs746T cells. Confluent monolayers of Hs746T cells in six-well plates were infected with cagA+Vac+, cagA+Vac- or cagA-Vac- H. pylori strains. Cells were assayed for caspase-3 activity at 12 hours after infection. Values represent the means±SEM of three separate experiments. As a comparison, caspase-3 activation was increased 3.2 fold in Jurkat cells treated with anti-Fas monoclonal antibody (clone CH-11, 50 ng/mL) for eight hours.
Fig. 4. DNA fragmentation in Hs746T cells after infection with H.
pylori. Confluent monolayers of Hs746T cells in six-well plates were infected with cagA+Vac+, cagA+Vac- or cagA-Vac- H. pylori strains.
Apoptosis was assessed using the cell death detection ELISA 24 (black bar) and 48 (open bar) hours after infection. Numbers refer to DNA fragmentation as measured by the enrichment factor . Values represent the means±SEM of five separate experiments.
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역할을 한다.3 3 이전의 연구 결과에서 caspase-3은 apoptosis 현상보다 앞선 감염 12시간에 최대의 활 성을 나타냄을 확인한 바 있다 .4 이를 토대로 본 실 험에서는 cagA+Vac+, cagA+Vac-, 또는 cagA-Vac- 균 주를 Hs746T 세포에 12시간 동안 감염시킨 뒤, caspase-3의 활성을 측정하였다 . 그러나 apoptosis에 서와 같이 cagA 유전자 및 세포독소 생성 유무에 따 른 유의한 차이는 관찰할 수 없었다(Fig. 5).
고 찰
소화성 궤양 및 위암과 같은 위장관질환과 관계 되는 H. pylori의 병독인자를 확인하기 위해 많은 연 구자들이 지속적으로 노력하고 있다. 이러한 작업의 일환으로 H. pylori 균주를 I 형과 II 형으로 분리하 기도 한다 . 즉, I 형은 cagA 유전자를 보유하고 있으 면서 세포독소를 생성해 내는 균주를 의미하고 II 형은 cagA 유전자가 없으면서 세포독소도 생성해 내지 않는 균주를 의미한다 .17 많은 연구 보고들은 I 형 균주가 소화성 궤양 또는 위암과 관련이 높을 뿐 만 아니라 cagA 단백질을 갖고 있는 H. pylori 균주 는 이러한 단백질을 갖고 있지 않은 균주에 비해 위 점막에 훨씬 더 강하게 정착(colonization) 한다는 결 과들을 발표하고 있다.1 1 , 13 - 17 그러나 이와는 반대로 세포독소 생성 또는 cagA 유전자와 같은 병독인자 의 존재와 임상질환과는 관계가 없다는 보고들도 있을 뿐만 아니라 cagA 또는 vacA 유전자형(geno-
type)은 임상증상을 예견할 수 없다는 보고도 발표 되고 있다 .2 0 - 2 4
본 연구에서 우리 나라 분리 균주의 약 80 %에서 세포독소를 생성하고 있었고, 95 % 이상에서 cagA 유전자 양성을 나타내고 있었다 . 이와 같은 결과는 세포독소 생성과 cagA 유전자는 임상증상과는 관계 없이 한국인으로부터 분리한 H. pylori 균주에서 공 통적으로 나타나는 현상임을 시사해 준다 . 반면 서 구의 여러 보고들은 본 연구 결과와는 차이를 나타 내고 있다. 즉, 서구 분리 균주의 60-70%에서 cagA 유전자를 보유하고 있고, 약 50 % 균주에서만 세포 독소를 생성하고 있다는 점에서 본 연구 결과에 비 해 병독인자 보유율이 상대적으로 낮음을 알 수 있 다 .7 , 10 , 1 1 ,2 7
한편, 우리 나라 분리 균주에서의 cagA 유 전자 및 세포독소 양성률이 일본의 보고와 유사하 다는 점은 매우 흥미로운 점이다 .2 3 이와 같은 점들 로 미루어 병독인자 존재율의 차이는 지역적 차이 에 기인하는 것으로 추정된다.
위상피세포는 H. pylori 감염 후 제일 먼저 접촉 하는 부위이다. 따라서 세균 접촉 후 또는 위점막에 존재하는 호중구로부터 생성되는 TNF-α및 Fas ligand와 같은 친염증성 자극제에 대해 각종 세포 반응을 나타낸다 .3 이와 같은 세포반응의 일환으로 본 연구자들은 이미 IL- 1α/β, GM -CSF, TNF-α와 같은 각종 친염증성 cytokine뿐만 아니라 IL-8, MCP- 1과 같은 chemokine이 H. py lori에 감염된 위 상피세포와 호중구로부터 발현됨을 보고한 바 있 Table 4 . Apoptosis of Hs746T Gastric Epithelial Cells infected with H. pylori according to cagA or Vacuolating Cytotoxin Status*
Assay Control cagA+cytotoxin+ cagA+cytotoxin- cagA-cytotoxin- Flow cytometry analysis
using DiOC6(3) stain Stain with Hoechst 33258
6.8±0.5 1.20±0.32
14 .3± 1.1 (2 .1)† 2 .30±0 .36 ( 1.9)
14 .0± 1.3 (2 .1) 2.33±0.40 ( 1.9)
14 .8± 1.8 (2.2) 2.40±0.35 (2 .0)
* confluent m onolayers of Hs746T cells in six-well plates were infected with cagA+Vac+, cagA+Vac- or cagA-Vac- H. py lori strains for 48 hours. Apoptosis was assessed by flow cytometry analysis using DiOC6(3) or by fluorescent microscopic observation using stain with Hoechst 33258. Values represent the means± SEM of three separate experiments. These data showed similar increase of the apoptosis compared with uninfected cultures.
† parentheses mean fold-increase compared with the control of each detection method .
김정목 외 5인. H. pylori 병독인자 5 9 3
다 .1 ,2 ,3 4 이 연구 결과들은 위상피세포가 H. pylori 감
염에 대한 sensor로서의 역할을 할 뿐만 아니라 점 막 염증반응을 시작하는 데 중요한 signal을 생성할 수 있다는 점을 제시해 주고 있다. 따라서 친염증성 cytokine의 분비는 H. py lori가 감염된 점막에서 위 염을 일으키는 원인 인자일 뿐만 아니라 위염의 지 표로서도 인정받고 있다.
여러 연구 보고에서 cagA 음성 균주에 비해 양성 균주에 의한 위상피세포주에서의 chemokine 발현이 더 높다고 발표하고 있다 .1 8 , 19 그러나 본 연구 결과 (Table 2, 3)에 의하면 세포독소 생성뿐만 아니라 cagA 유전자 양성 유무와 임상증상과는 유의한 연 관관계를 찾을 수 없었다 . 따라서 본 연구자들은 우 리 나라에서 분리한 균주의 cagA 유전자 형과 세포 독소 생성 유무가 각종 위상피세포주로부터의 cytokine 생성에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 관찰하였다 . 그 결과 cagA+Vac+, cagA+Vac- 또는 cagA-Vac- 균주로 감염시킨 위상피세포에서는 균주 의 특성에 관계없이 IL-1, IL-8, MCP-1, GM -CSF와 같은 친염증성 cytokine mRNA 발현 증가가 거의 동일한 수준을 나타내고 있었다 . 이와 같은 결과는 Table 1에서 제시한 바와 같이 분리한 H. py lori 균 주의 독성 인자의 존재와 위내시경적 진단과는 관 련이 없다는 결과와 일치되는 소견이라 할 수 있다 . 한편 이와 같은 가설은 cagA 음성 isogenic mutant 를 이용한 실험에서 IL-8 유도 실험 결과에 의해 뒷 받침되고 있다 .3 5
위점막 상피세포는 위선 경부에서 기원하는 세포 로 약 2-6일의 수명을 지니고 있다. 생체에서는 apoptosis라는 기전을 통하여 위상피세포의 수를 일 정하게 유지한다 .3 6 ,3 7 이와 같은 apoptosis 기전은 주 로 점막 표면에서 일어난다 . 비록 apoptosis가 위장 관 영역의 세균 감염에 대한 방어 기전으로 작용하 기도 하지만,3 1 ,3 8 H. py lori 감염증에서는 상피세포 손상이라는 병리기전으로 작용한다 .3 - 5 따라서 본 연 구에서는 cagA 유전자 또는 세포독소 생성이 H.
py lori 감염에 의한 위상피세포 apoptosis에 영향을 미치는지를 관찰하였다 .
본 연구에서 cagA 양성 균주와 음성 균주에 의한 apoptosis의 정도는 거의 동일 수준을 나타내고 있
었고, 세포독소 생성 유무에 의해서도 별다른 차이 를 나타내지 못했다. 이를 확인하기 위하여 apop- tosis의 선행 signal에 해당되는 caspase-3 활성도를 관찰하였다 . 그 결과 caspase-3의 활성도도 cagA+ Vac+, cagA+Vac- 또는 cagA-Vac- 균주로 감염시킨 위상피세포에서 유의한 차이를 나타내지 못했다 . 이 와 같은 결과는 cagA 유전자 음성 균주와 세포독소 를 생성할 수 없는 균주도 caspase-3을 활성화시켜 결과적으로 apoptosis를 유도할 수 있음을 의미한다.
이와 같이 위상피세포에서의 cytokine 발현뿐만 아 니라 apoptosis 유도에 있어서 cagA+Vac+, cagA+ Vac- 또는 cagA-Vac- 균주 상호간에 차이점이 없다 는 사실은 위질환의 심한 정도와 분리 균주의 독성 인자와 관련이 없다는 본 연구자들의 관찰을 지지 해 주는 결과라고 할 수 있다. 결론적으로 본 연구 결과들은 한국인에서 분리한 균주의 병독인자 보유 와 위장관질환이 관계가 없는 이유가 H. pylori 균주 간의 친염증성 cytokine 발현 능력과 apoptosis 유도 능력이 동일한 것에 기인할 것이라는 점을 시사해 준다 .
요 약
목 적 : 세포독소연관 유전자(cagA)와 세포독소
(Vac)는 H. pylori 균주의 주요 병독인자로 인정받고 있다 . 그러나 이들 병독인자와 임상적 진단 사이에 관계가 없다는 보고도 제시되고 있음에 비추어 아 직까지 이들 상호간에는 논란이 많다 . 이에 본 연구 에서는 균주의 cagA 유전자와 세포독소 생성이 한 국인의 위장관질환과 연관되는지의 여부와 이들 관 계가 위상피세포에서의 친염증성 cytokine 발현과 apoptosis 유도에 의해 초래되는지를 검사하였다. 대 상 및 방 법 : 한국인 환자를 대상으로 H. pylori 균주 를 분리한 뒤, 분리 균주의 adhesin (hpaA), cagA , vacA 1/ A 3 병독유전자를 PCR로 검사하였고, 세포독 소 생성은 세균 배양액과 HeLa 세포를 이용하여 확 인하였다 . 병독인자의 유무가 위상피세포 반응에 어 떤 영향을 미치는지 관찰하기 위하여 cagA+Vac+, cagA+Vac- 또는 cagA-Vac- 균주를 위상피세포주에 감염시킨 뒤, 발현되는 친염증성 cytokine (IL-1α,
5 9 4 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 36, No. 5, 2000
IL-8, MCP- 1, GM-CSF)을 표준 합성 RNA를 이용 한 역전사 PCR로 검사하였다. 동시에 H. pylori 감 염 세포주에서 apoptosis와 caspase-3 활성도를 측정 하여 감염된 위상피세포의 최종 반응을 관찰하였다.
결 과 : 환자로부터 분리된 H. pylori 균의 cagA , vacA 1/ A 3 및 adhesin 유전자 보유 유무 및 세포독소 생성 유무와 내시경적 소견과는 유의한 상관관계를 찾아볼 수 없었다 . cagA 양성 균주와 음성 균주에 의한 친염증성 cytokine의 발현은 거의 동일 수준을 나타내고 있었고, 세포독소 생성 유무에 의해서도 유의한 차이를 관찰하지 못했다 . 또한 apoptosis의 정도와 caspase-3 활성도도 cagA+Vac+, cagA+Vac- 또는 cagA-Vac- 균주 감염에 따라 유의한 차이를 나 타내지 못했다 . 결 론 : 본 연구 결과들은 한국인에서 분리한 균주의 병독인자 보유와 위장관 질환 사이 에 관계가 없는 이유가 H. pylori 균주 간의 친염증 성 cytokine 발현 능력과 apoptosis 유도 능력이 동 일한 것에 기인할 것이라는 점을 시사해 준다.
색 인 단 어 : 병독인자, 사이토카인, 아포프토시스, 위 상피세포, 헬리코박터 파이로리
참 고 문 헌
1. Jung HC, Kim JM, Song IS, Kim CY. Helicobacter p ylori induces an array of pro-inflammatory cyto- kines in human gastric epithelial cells: quantifica- tion of mRNA for interleukin-8, -1α/β, granu- locyte-macrophage colony-stimulating factor, mono- cyte chemoattractant protein-1 and tumor necrosis factor-α. J Gastroenterol Hepatol 1997;12:473-480.
2. Jung HC, Kim JM, Song IS, Kim CY. Increased motility of Helicobacter p ylori by methylcellulose could upregulate the expression of proinflammatory cytokines in human gastric epithelial cells. Scand J Clin Lab Invest 1997;57:263-270.
3. Kim JM, Kim JS, Jung HC, Song IS, Kim CY.
Apoptosis of human gastric epithelial cells via caspase-3 activation in response to Helicobacter p ylori infection: possible involvement of neutrophils through tumor necrosis factor-α and soluble Fas
ligands. Scand J Gastroenterol 2000;35:40-48.
4. Rudi J, Kuck D, Strand S, et al. Involvement of the CD95 (APO-1/Fas) receptor and ligand system in Helicobacter pylori-induced gastric epithelial apoptosis. J Clin Invest 1998;102:1506-15 14.
5. Wagner S, Beil W, Westermann J, et al. Regulation of gastric epithelial cell growth by Helicobacter p ylori: Evidence for a maj or role of apoptosis.
Gastroenterology 1997;113:1836-1847.
6. Cover TL, Dooley CP, Blaser MJ. Characterization of and human serologic response to proteins in Helicobacter pylori broth culture supernatants with vacuolizing cytotoxin activity. Infect Immun 1990;
58:603-610.
7. Covacci A, Censini S, Bugnoli M, et al. Molecular characterization of the 128-kDa immunodominant antigen of Helicobacter p ylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer . Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:5791-5795.
8. Censini S, Lange C, Xiang Z, et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter p ylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:14648- 14653.
9. Tummuru MK, Sharma SA, Blaser MJ. Helicobac- ter pylori p icB, a homologue of the Bordetella p ertussis toxin secretion protein, is required for induction of IL-8 in gastric epithelial cells. Mol Microbiol 1995;18:867-876.
10. Tummuru MK, Cover TL, Blaser MJ. Cloning and expression of a high-molecular-mass maj or antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production . Infect Immun 1993;61:1799- 1809.
11. Rudi J, Rudy A, Maiwald M, Kuck D, Sieg A, Stremmel W. Direct determination of Helicobacter p ylori vacA genotypes and cagA gene in gastric biopsies and relationship to gastrointestinal diseases.
Am J Gastroenterol 1999;94:1525-1531.
12. Harris PR, Cover TL, Crowe DR, et al. Helico- bacter pylori cytotoxin induces vacuolation of primary human mucosal epithelial cells. Infect
Kim, et al. H. pylori virulence factors 5 9 5
Immun 1996;64:4867-487 1.
13. Basso D, Navaglia F, Brigato L, et al. Analysis of Helicobacter p ylori vacA and cagA genotypes and serum antibody profile in benign and malignant gastroduodenal diseases. Gut 1998;43:182-186.
14. Gunn MC, Stephens JC, Stewart JA, Rathbone BJ, West KP. The significance of cagA and vacA subtypes of Helicobacter p ylori in the pathogenesis of inflammation and peptic ulceration . J Clin Pathol 1998;51:761-764.
15. Navaglia F, Basso D, Piva MG, et al. Helicobacter p ylori cytotoxic genotype is associated with peptic ulcer and influences serology. Am J Gastroenterol
1998;93:227-230.
16. Peek RM Jr, Miller GG, Tham KT, et al.
Heightened inflammatory response and cytokine expression in vivo to cagA+ Helicobacter pylori strains. Lab Invest 1995;73:760-770.
17. Xiang Z, Censini S, Bayeli PF, et al. Analysis of expression of cagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter p ylori reveals that clinical isolates can be divided into two maj or types and that cagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect Immun 1995;63:94-98.
18. Crabtree JE, Covacci A, Farmery SM, et al.
Helicobacter p ylori induced interleukin-8 expression in gastric epithelial cells is associated with CagA positive phenotype. J Clin Pathol 1995;48:4 1-45.
19. Sharma SA, Tummuru MK, Miller GG, Blaser MJ.
Interleukin-8 response of gastric epithelial cell lines to Helicobacter p ylori stimulation in vitro. Infect Immun 1995;63:1681-1687.
20. Tokumaru K, Kimura K, Saifuku K, et al. CagA and cytotoxicity of Helicobacter p ylori are not markers of peptic ulcer in Japanese patients.
Helicobacter 1999;4:1-6.
21. Kurihara N, Kamiya S, Yamaguchi H, et al.
Characteristics of Helicobacter p ylori strains isola- ted from patients with different gastric diseases. J Gastroenterol 1998;33(Suppl 10):10-13.
22. Ito Y, Azuma T, Ito S, et al. Analysis and typing of the vacA gene from cagA -positive strains of
Helicobacter p ylori isolated in Japan . J Clin Micro- biol 1997;35:17 10-1714.
23. Maeda S, Ogura K, Yoshida H, et al. Major virulence factors, VacA and CagA, are commonly positive in Helicobacter p ylori isolates in Japan . Gut 1998;42:338-343.
24. Yamaoka Y, Kita M, Kodama T, Sawai N, Kashima K, Imanishi J. Induction of various cyto- kines and development of severe mucosal inflam- mation by cagA gene positive Helicobacter p ylori strains. Gut 1997;4 1:442-45 1.
25. Evans DG, Karjalainen TK, Evans DJ Jr, Graham DY, Lee CH. Cloning, nucleotide sequence, and expression of a gene encoding an adhesin subunit protein of Helicobacter p ylori. J Bacteriol 1993;
175:674-683.
26. Yamaoka Y, Kodama T, Gutierrez O, Kim JG, Kashima K, Graham DY. Relationship between Helicobacter p ylori iceA , cagA , and vacA status and clinical outcome: studies in four different countries.
J Clin Microbiol 1999;37:2274-2279.
27. Cover TL, Tummuru MK, Cao P, Thompson SA, Blaser MJ. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter p ylori strains. J Biol Chem 1994;269:10566-10573.
28. 정현채, 김정목, 진영주 등. Helicobacter p ylori의 병 독성 유전자 및 운동성이 인체 위점막 염증 반응의 병태 생리에 미치는 영향 (I) - 병독 인자 보유 유무 에 따른 친염증성 cytokine의 발현능. 대한소화기학 회지 1997;29:579-590.
29. Jung HC, Eckmann L, Yang SK, et al. A distinct array of proinflammatory cytokines is expressed in human colon epithelial cells in response to bacterial invasion . J Clin Invest 1995;95:55-65.
30. Kim JM, Jung HC, Jin DZ, Im KI, Song IS, Kim CY. Cytokine genes are down-regulated when attachment of Entamoeba histolytica to HT-29 colon epithelial cells is prevented. Scand J Immunol 1997;45:613-617.
31. Kim JM, Eckmann L, Savidge TC, Lowe DC, Witthoft T, Kagnoff MF. Apoptosis of human intestinal epithelial cells after bacterial invasion . J
5 9 6 대한소화기학회지 : 제 36 권 제 5 호 2000
Clin Invest 1998;102:1815-1823.
32. 김정목, 김주성, 정현채, 송인성, 김정룡. Helicobac- ter pylori 감염 후 caspase-3 활성을 통한 인체 위상 피세포의 apoptosis. 대한소화기학회지 1999;33:765- 775.
33. Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 1998;39 1:43-50.
34. 김주성, 정현채, 김정목, 송인성, 김정룡. Helico- bacter p ylori 수용성 추출물에 의한 인체 호중구로부 터의 neutrophil-activating chemokine 발현. 대한소 화기학회지 1999;34:176-178.
35. Crabtree JE, Xiang Z, Lindley IJ, Tompkins DS, Rappuoli R, Covacci A. Induction of interleukin-8
secretion from gastric epithelial cells by a cagA negative isogenic mutant of Helicobacter p ylori. J Clin Pathol 1995;48:967-969.
36. Crawford JM. The gastrointestinal tract: Stomach . In : Cotrans RS, Qumar V, Robbins SL, eds.
Pathologic Basis of Disease. 5th ed. Philadelphia:
WB Saunders, 1994:767-783.
37. Bursch W, Oberhammer F, Schulte-Hermann R.
Cell death by apoptosis and its protective role against disease. Trends Pharmacol Sci 1992;13:245- 25 1.
38. Zychlinsky A, Sansonetti P. Perspective series:
host/pathogen interactions. Apoptosis in bacterial pathogenesis. J Clin Invest 1997;100:493-495.
