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추간판 조직에서 연령 및 퇴행성 변화와
신생혈관과 섬유모세포 성장인자발현에 대한 연구
전창훈・김한겸*・강신영
아주대학교 의과대학 정형외과학교실, 고려대학교 의과대학 병리학교실*
– Abstract –
The Study for the Neovascularization and Basic Fibroblast Growth Factor(bFGF) Expression in the Intervertebral Disc Tissue Associated with
Aging and Disc Degeneration
Chang Hoon Jeon, M.D. Han-Kyeom Kim, M.D.* and Shin-Young Kang, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea Department of Pathology, Korea University School of Medicine, Seoul, Korea*
Numerous studies have shown neovascularization and basic fibroblast growth factor(bFGF) expression in herniated nucleus pulposus. It is not clear whether the neovascularization and bFGF expression are due to herniated nucleus pulposus with sec- ondary reaction phenomenon or due to disc aging and degeneration. The purpose of this study is to investigate neovasculariza- tion and bFGF expression in both nucleus pulposus and anulus fibrosus tissues from aging and degenerated discs and compare it to neonate intervertebral disc. Thirty disc blocks obtained during anterior interbody fusion of the lumbar spine with degener- ative spine disease were studied by immunochemical stains to observe neovascularization with vascular endothelial cell growth factor(VEGF) and bFGF expression. There were 8 disc blocks from the patients with degenerative disc disease, 15 with spondy- lolytic spondylolisthesis, and 7 with spinal stenosis with instability. For the control group, 12 neonate disc blocks obtained at autopsy. The neovascularization and bFGF expression were observed in the outer one half layer of the anulus fibrosus in the disease group but not in the nucleus pulposus. The neovascularization and bFGF expression were not observed in the control group. There was a statistical significant difference of neovascularization and bFGF expression between the control and disease group(p<0.05). There was no statistical significant difference of neovascularization and bFGF expression among the disease group(p>0.05). The results of this study suggest that neovascularization and bFGF expression are inherently related to aging and degeneration of the intervertebral disc.
Key Words : Neovascularization, Fibroblast Growth Factor, Intervertebral Disc
Journal of Korean Spine Surg.
Vol. 6, No. 3, pp 329~335, 1999
서 론
무혈관 조직으로 알려진 추간판 조직에서 탈출된 추간판의 조직 병리학적 연구에서 신생 혈관이 발견 되었다. 신생 혈관의 기원은 아직 알려져 있지 않으 며, 탈출된 추간판 조직에서 관찰되는 신생 혈관이 탈출된 추간판 조직에 대한 2차적인 현상이나 연령 변화나 퇴행성 변화로 인한 것은 분명하지 않다. 요 통의 원인이 되는 퇴행성 추간판 질환의 추간판 조 직에서 혈관형성과 연령변화 및 퇴행성 변화와의 관 계에 대해서는 아직 연구된 것이 없다.
저자들은 본 연구에서 첫째, 퇴행성 척추질환이 있 는 환자의 추간판조직에서 신생혈관의 발현형태와 섬유모세포 성장인자의 발현을 연구하고, 둘째 질환 별 추간판 조직에서 신생혈관형성과 연령변화 및 퇴 행성 변화와의 관계를 연구하고자 한다.
연구재료 및 방법
1. 연구대상
본 연구의 대상은 주된 증상이 요통인 퇴행성 추간 판 질환 환자 3 0례를 대상으로 하였으며, 질환별로는 퇴행성 추간판 질환 8례, 협부형 척추전방 전위증 1 5례, 불안정성이 동반된 척추관내 협착증 7례였다(Table 1).
전 환자에게 전방추체 유합술을 실시하여 채취한 추간판 조직을 검사하였다.
환자에 대한 검사는 이학적 검사, 일반방사선 검사, 추간판조영술, 자기공명영상 검사를 실시하였다. 전 환자에게서 요추부 전방 추체유합술을 실시하였으며, 수술중에 조직의 채취는 칼로 추간판 부위에 창을 내 어 블록( b l o c k )으로 채취하였으며(Fig. 1), 수핵과 섬 유륜이 포함된 추간판 조직을 연구대상으로 하였다.
2. 연구방법
전 환자는 1명의 정형외과 척추전문의가 전방 추체 유합술을 시행하였다. 질환별로 추간판 조직에서 H e m a t o x y l i n - e o s i n e염색과 면역 조직화학 염색을 이용 하여 신생 혈관의 분포와 섬유모세포 성장인자의 발 현을 관찰하였다.
대조군으로 정상 추간판 조직을 얻을 수 없어 부 검시 채취한 신생아의 추간판 조직 1 2례를 대상으로
하였다(Fig. 2).
Table 1. The Causes of Diseases.
Dx. No
Degenerative Disc Derangement 08
Spondylolytic Spondylolisthesis 15
Spinal Stenosis with Instability 07
Fig. 1. Disc specimen from the anterior interbody fusion.
Fig. 2. Neonatal disc specimen.
모든 추간판 조직은 수술직후 - 7 0℃로 급냉하여 보 관하였다.
3. 조직학적 관찰
추간판 조직을 통상적인 H e m a t o x y l i n - e o s i n e염색법과 신생 혈관에 대해서 혈관내피세포 성장인자( V a s c u l a r endothelial Cell Growth Factor, VEGF, DaKo patts, C o p e n h a g e nⓇ, Denmank) 및 섬유모세포 성장인자( b a s i c Fibroblast Growth Factor, bFGF, Cabiochem-Nova- b i o c h e mⓇ, Denmark)를 이용한 면역 조직화학 염색법 을 이용하여 추간판 조직내의 혈관형성과 섬유모세포 성장인자의 발현을 관찰하였다. 염색 방법은 다음과 같이 실시하였다.
1) Hematoxylin-eosine 염색법
7 0℃로 냉동시킨 조직을 실온에서 녹힌 후 B oüi n 용액에 3 0분에서 4 0분간 고정한 후 흐르는 물에 고정 액을 제거하고 Formalin 용액을 이용하여 고정하였 다. 저농도에서 고농도 알코올를 이용하여 수분을 제 거하고 탈알코올 과정과 X y l e n e으로 투명 과정을 거 친 후 연질 파라핀부터 경질 파라핀까지 항온기에 침투시켜 파라핀포매블럭을 만들었다. 박절기로 조직 을 얇게( 6±2㎛) 자른 후, 각각의 조직을 4% neutral buffered solution으로 고정한 후, 파라핀으로 고정하였 다. 각각의 조직( 6±2㎛)을 H e m a t o x y l i n - e o s i n e으로 염색하였다.
2) 면역 조직화학염색
조직절편을 3 0분에서 6 0분간 5 6℃~ 6 0℃ 항온기에 서 가온시켜 조직을 슬라이드에 잘 부착시킨 후 6 0
℃ 항온기에서 충분히 건조시켰다. 이 후 X y l e n e으로 1 0분간 3회에 걸쳐 탈파라핀시키고 증류수로 세척하 였다. 내재성 p e r o x i d a s e를 억제하고자 3% 과산화수 소( H2O2)와 M e t h a n o l을 섞은 용액으로 1 0분에서 1 5 분간 처리한 후 증류수로 3분간 세척하였다. Phos- phate buffered solution(PBS)으로 5분간 3회에 걸쳐 세척한 후 비특이성 반응을 억제하고자 정상 G o a t 혈청으로 2 0분에서 3 0분간 처리한 후 1차 항체로 실 온에서 1시간에서 2시간 정도 감작시켰다. 이후 P B S 로 5분간 3회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항체로 2 0분에 서 3 0분간 반응한 후 5분씩 3회에 걸쳐 P B S로 세척 하였다. Labelled serum으로 2 0분간 처치 후 P B S로 세척하였다. AEC(3Amino-9-Ethyl-Carbazone) 용액으 로 처리한 후 다시 P B S로 세척하였다. Hematoxylin- eosine 염색법으로 대조 염색을 실시하였다.
혈관내피세포 성장인자 항체는 1 : 5 0의 농도로 염색 하였으며, 섬유모세포 성장인자 항체는 1 : 1 0 0의 농도 로 염색하여 추간판 조직내의 신생혈관의 형성 및 섬유모세포 성장인자의 발현을 관찰하였다.
3) Hematoxylin-eosine 염색과 면역 조직화학적 염색판독 H e m a t o x y l i n - e o s i n e염색의 판독과 혈관내피세포 성 장인자 및 섬유모세포 성장인자를 이용한 면역 조직 화학 염색의 판독은 현미경으로 판독하였으며, 혈관 형성이 관찰되고 면역염색상 갈색에서 적색으로 염 색되는 것에 한해 양성으로 판독하였다. 조직의 관찰 은 2명이 환자의 임상기록 및 수술 결과에 대해 숙 지되지 않은 상태에서 동시에 조직표본을 관찰하여 혈관형성과 면역 염색의 결과가 일치하는 경우에 한 해 양성으로 판독하였다.
4. 결과분석
질환군과 대조군으로 나누어 추간판 조직의 해부 학적 위치에 따른 신생 혈관의 발현 및 분포형태 및 섬유모세포 성장인자의 면역염색상의 발현도의 차이 를 비교 검증하였다. 통계학적 처리에는 각 지표에 따라 Log-linear model를 사용하여 분석하였다.
연구 성적
1. 조직화학적 염색판독결과
질환군에서 H e m a t o x y l i n - e o s i n e염색 및 혈관내피세포 성장인자와 섬유모세포 성장인자를 이용한 면역 조직 화학염색상 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현 은 전례에서 섬유륜의 바깥 1/2 층에서 관찰되었으나, 수핵에서는 혈관 형성이나, 면역염색상 양성반응을 보 이는 세포는 관찰되지 않았다. 질환군에 대한 H e m a - t o x y l i n - e o s i n e염색상 혈관 형성은 3 0례( 1 0 0 % )에서 관 찰되었으며(Fig. 3A), 혈관내피세포 성장인자를 이용 한 면역염색에서는 퇴행성 추간판 질환 7례, 협부형 척추전방전위증 1 3례, 불안정성이 동반된 척추강내 협 착증 6례 에서 양성반응이 관찰되었다(Fig. 4). 섬유모 세포 성장인자를 이용한 면역염색에서 양성반응은 퇴 행성 추간판 질환 7례, 협부형 척추전방전위증 1 3례, 불안정성이 동반된 척추강내 협착증 5례에서 관찰되 었다(Fig. 5). 질환별 염색결과는 Table 2와 같다.
대조군 1 2례의 추간판 조직에서 H e m a t o x y l i n - e o s i n 염색상 혈관 형성이 관찰되었으나(Fig. 3B), 혈관내
피세포 성장인자 항체와 섬유모세포 성장인자를 이 용한 면역염색상 양성 반응을 보이지 않는다.
2. 통계학적 검색
대조군과 질환군 사이의 신생 혈관에 대한 혈관내 피세포 성장인자와 섬유모세포 성장인자의 발현의 차이점은 통계학적으로 의미가 있었다( P＜0 . 0 5 ) .
질환군 사이의 신생혈관에 대한 혈관내피세포 성 장인자 항체 및 섬유모세포 성장인자의 발현의 차이
는 없었다( P＞0 . 0 5 ) .
고 찰
추간판 조직은 1) 치밀하게 형성된 교원질 섬유 층 판(collagen fibril lamella)이 환형태로 구성된 섬유륜의 바깥층(outer anulus fibrosus), 2) 섬유연골내 섬유륜 (fibro cartilagenous inner anulus fibrosus), 3) 섬유륜의 내층과 수핵사이의 얇은 층인 이행부( t r a n s i t i o n a l Fig. 3. Disc tissue showing blood vessels seen in specimen.(A: Disease group , B: Control group.)
A B
Fig. 4. Disc tissue showing positive reaction vascular endothe- lial cell growth factor(VEGF) for blood vessels(×400).
Fig. 5. Disc tissue stained which shows positive reaction for basic fibroblast factor(bFGF)(×400).
Table 2. The results of stainings.
H-E stain VEGF bFGF
+ - + - + -
Neonate(Control Group) 12 0 00 12 00 12
Degenerative disc disease 08 0 07 01 07 01
Spondylolytic Spondylolisthesis 15 0 13 02 13 02
Spinal Stenosis with instability 07 0 06 01 05 02
zone), 4) 수핵 중심부로 나누어져 있다1 ). 추간판 조직 의 조직학적 연구에서 P e a c o c k8 )은 출생시에 추간판의 후측면에서 작은 혈관등이 섬유륜의 층사이에 존재하 나, 수핵은 무혈성 조직이라고 하였다. Coventry 등2 ) 의 보고에 의하면 1 0대에서는 혈관들이 종판내를 깊 게 침투하는 양상이 관찰되나 이런 현상도 연령이 증 가함에 따라 점차 사라지며, 19세 이상에서는 관찰되 지 않는다고 보고되고 있다. 또한 3 0세 이전에는 추간 판 조직이 무혈관 조직이며 4 0대 이후에는 섬유륜에 서 퇴행성 변화가 광범위하게 일어나며, 2차적으로 섬 유륜에 혈관형성이 된다고 하였다. 섬유륜 내의 혈관 형성이 손상된 조직에 대한 치유기전으로 혈관형성과 거식세포( M a c r o p h a g e )의 침윤은 연령변화에 따른 변 화일 수도 있다는 보고도 있다2 ).
추간판 조직의 혈관형성에 대해서는 추간판의 퇴 행성 변화와 함께 종인대(longitudinal ligament)와 섬 유륜의 바깥층 사이에 있는 결체조직에 혈관형성을 여러 저자가 보고하고 있다2 , 5 , 1 1 ). 저자들의 연구에서 도 섬유륜의 바깥 1 / 2층에서 혈관이 관찰되었다.
K a u p p i l a6 )는 섬유륜의 전측부에서 섬유륜의 혈관형 성은 추간판의 퇴행성 변화가 밀접한 관계가 있다고 보고하면서 추간판의 퇴행성 변화없이 발견된 혈관 형성은 퇴행성 변화이전에 추간판 조직에 영양 공급 의 장애로 인한 것으로 사료된다고 보고하고 있다.
섬유륜에서 관찰되는 신생혈관 형성의 기전에 대해 H i r s c h와 S c h a j o w i c z5 )는 인접한 척추체나 종인대로부 터 동맥이 자라나 추간판으로 향한다고 보고하고 있 으며, 이런 현상이 추간판 파열에 대한 치유 현상이 라고 제안하였으나, 반흔형성 및 풍부한 혈관조직이 관찰되지 않았기에 인정받지 못하였다. Kauppila6 )는 추간판의 퇴행성 변화가 시작되면 전종인대나 섬유 륜의 바깥층 사이에 있는 모세혈관이나 가는 혈관 등이 열( c l e f t s )을 형성하여 점차적으로 혈관사이에 섬유화의 연결이 일어나, 섬유륜의 바깥층에서 파열 이 일어난다고 하였다. 본 연구에서는 신생혈관이 관 찰된 섬유륜 부위에서 파열이 관찰된 예도 있으나 이런 현상이 K a u p p i l a가 보고한 결과와 같은 것인지 또는 조직을 박절기로 얇게 자를 때 생기는 의인성 결함(iatrogenic defect)에 의한 것인지 정확히 구분할 수 없었다.
여러 저자들에 의해서 형태 및 조직학적으로 추간 판의 퇴행성 변화에 대한 등급화가 제시되었으나3 , 7 ) 많이 인용되지 않고 또한 객관적인 분류가 불가능하 므로, Kauppila6 )가 제안한 추간판의 퇴행성 변화가 증가할수록 혈관형성이 증가한다는 가설에 대해서 본 연구에서 K a u p p i l a의 가설을 증명할 수 없었으나
대조군과의 연구결과를 비교해보면 추간판 조직내에 퇴행성 변화와 혈관 형성은 상관관계가 있었다.
배양된 추간판 조직세포에 섬유모세포 성장인자를 주입한 연구에서 세포성장 등이 섬유륜 부위에서 촉 진되며, 이런 성장인자에 의해서 추간판의 수핵과 이 행부에서 추간판의 손상이 치유가 될 수 있다고 하
였다1 0 ). 섬유모세포 성장인자의 생화학적 기능에 대
해서는 생체실험을 통해 섬유모세포 성장인자가 세 포성장을 일으키며, plasminogen의 활동성과 간질성 교원섬유(interstitial collagen)를 유도하고 세포의 이 동을 증가시키며, 또한 시험관내의 배양된 추간판 조 직세포에 섬유모세포 성장인자를 주입한 후 신생혈 관형성 및 섬유증식( f i b r o p l a s i a )이 관찰되므로써 창상 치유 시 섬유모세포 성장인자의 역할을 증명하였다
9 ). 본 연구에서도 대조군과 비교하여 질환군의 추간 판 조직에서 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발 현이 관찰되어 추간판 손상의 결과나 또는 연령 및 퇴행성 변화의 결과로 신생혈관이 활성화된 것으로 예상되었다. 섬유모세포 성장인자의 양에 따라 혈관 의 발생정도가 관계있다고 한 보고가 있으나4 ), 본 연 구에서는 정량적 분석을 시행하지 않아 섬유모세포 성장인자의 양과 혈관의 발생정도를 직접 비교할 수 없었으나 질환별 신생혈관의 형성이나 섬유모세포 성장인자의 발현에는 차이가 없었다. 질환군의 연령 에 따른 신생혈관의 형성이나 섬유모세포 성장인자 의 발현의 차이는 개체수가 적어서 통계학적으로 비 교할 수 없었다.
저자의 연구에서 탈출된 추간판 조직에서 관찰되 는 신생혈관 분포와는 달리 요통의 원인이 되는 퇴 행성 척추 질환의 추간판 조직에서 신생혈관의 형성 이 수핵 내에서는 관찰되지 않고 섬유륜의 바깥 1 / 2 층에서 관찰되므로써 자가면역 반응외에 추간판의 연령 및 퇴행성 변화도 혈관형성의 요인 중의 하나 라고 사료되나 가설로만 제시되는 추간판내의 신생 혈관의 형성기전에 대한 집중적인 연구가 필요하다.
결 론
추간판내의 신생혈관과 섬유모세포 인자의 발현과 연령 및 퇴행성 변화에 대한 연구에서 퇴행성 척추 질환이 있는 추간판 조직의 섬유륜 바깥 1 / 2층에서 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현이 관찰되었 다. 퇴행성 척추질환별 신생혈관과 섬유모세포 성장 인자의 발현의 차이점은 없었다. 대조군인 신생아의 추간판 조직에서는 신생혈관과 섬유모세포 성장인자
의 발현이 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 추간판내 의 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현은 추간 판 조직의 연령 및 퇴행성 변화와 관계가 있다고 사 료되었다.
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연구계획 : 추간판 조직에서 신생혈관의 연구는 탈출된 추간판 조직에서 이루어졌다. 본 연구는 퇴행성 척추질환의 추간판 조직에서 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현에 대한 연령 및 퇴행성 변화와의 관계를 연구하고자 한다.
연구목적 : 추간판 조직에서 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현을 관찰하고 추간판 조직의 연령 및 퇴행성 변화와의 상관관계를 연구하고자 한다.
대상 및 방법: 주된 증상이 요통인 퇴행성 척추 질환으로 전방 추체유합술을 시행받고 1 2개월 이상 추시 가능하 였던 환자의 추간판 조직 3 0례를 연구대상으로 하였다. 조직학적 관찰은 H - E염색과 혈관내피세포 성장인자와 섬유 모세포 성장인자를 이용한 면역 조직화학염색을 실시하였다. 대조군으로 부검시 채취한 신생아의 추간판 조직 1 2례 를 대상으로 하였다.
결과 : 질환군에서 H e m a t o x y l i n - e o s i n e염색 및 혈관내피세포 성장인자와 섬유모세포 성장인자를 이용한 면역 조직 화학염색상 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현은 전례에서 섬유륜의 바깥 1/2 층에서 관찰되었으나, 수핵에서 는 혈관형성이나, 면역염색상 양성반응을 보이는 세포는 관찰되지 않았다. 대조군 1 2례의 추간판조직에서 H e m a t o x y l i n - e o s i n염색상 혈관형성이 관찰되었으나, 혈관내피세포 성장인자 항체와 섬유모세포 성장인자를 이용한 면역 염색상 양성 반응을 보이지 않는다. 대조군과 질환군 사이의 신생혈관에 대한 혈관내피세포 성장인자와 섬유 모세포 성장인자의 발현의 차이점은 통계학적으로 의미가 있었다( P＜0.05). 질환군 사이의 신생혈관에 대한 혈관내 피세포 성장인자 항체 및 섬유모세포 성장인자의 발현의 차이는 없었다( P＞0 . 0 5 ) .
결론 : 추간판내의 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현은 추간판 조직의 연령 및 퇴행성 변화와 관계가 있다 고 사료되었다.
색인단어: 신생혈관, 섬유모세포 성장인자, 추간판 국 문 초 록
※ 통신저자 : 전 창 훈
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