http://dx.doi.org/10.3938/NPSM.67.922
Temperature Dependence of the Elastic Properties of Bio Silk Films Crystallized in a Water Vapor or Ethanol Environment
Jeong Woo Lee · Byoung Wan Lee · Jae-Hyeon Ko
∗Department of Physics, Hallym University, Chuncheon 24252, Korea
Yeung Kyu Yeon · Ok Joo Lee · Chan Hum Park
Nano-Bio Regenerative Medical Institute, Hallym University, Chuncheon 24252, Korea
Jaehoon Park
Department of Electronic Engineering, Hallym University, Chuncheon 24252, Korea (Received 3 July 2017 : revised 25 July 2017 : accepted 27 July 2017)
The effects of temperature on the heat flow, the weight, and the elastic properties of silk fibroin films crystallized by using hydration or ethanol exposure were investigated and compared to those of amorphous silk films. The heat flow of the crystallized films did not exhibit any exothermic crystallization peak, indicating that the prepared films were crystallized appropriately. The water content was approximately 5%, as confirmed by the thermogravimetric analysis. The existence of crystalline β-sheets did not have any substantial effect on the elastic properties, suggesting that the sizes of the β-sheets may be much smaller than the wavelengths of the longitudinal acoustic waves. The evaporation of the water content due to heat treatment decreased the elastic constant at temperatures below∼60◦C and removed some relaxational anomalies that existed before heat treatment.
PACS numbers: 78.35.+c, 62.60.+v
Keywords: Silk fibroin, Crystallization, Elastic property, Brillouin scattering
에탄올 침지 혹은 수화방법으로 결정화된 바이오 실크 필름의 탄성 특성의 온도 의존성
이정우 · 이병완 · 고재현
∗한림대학교 응용광물리학과, 춘천 24252, 대한민국
연응규 · 이옥주 · 박찬흠
한림대학교 나노바이오재생의학연구소, 춘천 24252, 대한민국
박재훈
한림대학교 전자공학과, 춘천 24252, 대한민국
(2017년 7월 3일 받음, 2017년 7월 25일 수정본 받음, 2017년 7월 27일 게재 확정)
수화 방법 및 에탄올 침지법에 의해 결정화된 실크 피브로인 필름의 열 흐름, 중량, 그리고 탄성 특성에 대한 온도의 효과를 조사한 후에 비정질 실크 필름의 특성과 비교하였다. 결정화된 실크 필름의 열 흐름
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데이터에서는 결정화에 관련된 발열 피크가 존재하지 않았고 이에 따라 준비된 실크 필름들이 적절히 결정화되어 있음을 확인할 수 있었다. 열중량 분석의 결과 준비된 실크 필름 내 물의 함유량은 약 5%
정도였다. 결정질 베타 시트의 존재는 결정질 시료들의 탄성 특성에 별다른 영향을 미치지 않았고, 이는 결정질 베타 시트의 크기가 종음향 모드의 파장보다 훨씬 작을 가능성이 있음을 보여주었다. 열처리를 통한 물의 제거는 섭씨 60도 이하의 온도에서 탄성계수의 감소를 야기시켰고 비슷한 온도에서 열처리 전에 보이던 완화과정과 관련된 신호를 제거하였다.
PACS numbers: 78.35.+c, 62.60.+v
Keywords: 실크 피브로인, 결정화, 탄성 특성, 브릴루앙 산란
I. 서 론
다양한 응용분야에서 활용되고 있는 바이오 실크 피브로 인 (silk fibroin, SF) 은 누에고치가 형성하는 실크 필라멘 트에서 세리신 (sericin) 단백질을 제거함으로써 얻어지는 천연 고분자이다 [1]. 이렇게 얻어진 순수한 SF는 생체친 화적 속성으로 인해 다양한 의학 분야에서 활용되고 있는 의료 소재로 각광받아 왔다. 특히 SF으로 만든 필름은 높 은 투명도와 기계적인 견고성, 열적 안정성과 형상 자유도 등을 가지고 있어 통상적인 생물의학적 응용뿐 아니라 조직 공학 (tissue engineering), 바이오센서 등 다양한 응용 분 야에서 활발히 사용되거나 연구되고 있다 [2–4]. 전형적인 방법으로 형성된 SF는 보통 무게 비중으로 수 % 정도의 물분자를 함유하고 있다. 이 물분자는 고분자 체인 사이에 위치하면서 수소결합을 통해 실크의 유연성이나 작업성 (workability) 등에 영향을 주게 되고 완화과정 (relaxation process) 과 같은 동역학적 거동이나 열적 특성에도 변화를 주는 것으로 알려져 있다 [5,6]. 이 물분자들은 유리상전이 온도 이하의 고온에서 열처리를 하면 제거된다.
SF 필름의 물리적 화학적 특성에 영향을 주는 또 다른 주요 요인은 실크 내부의 분자 구조, 특히 결정화 정도이다.
알파-나선 (α-helix) 이라 불리는 무작위적인 코일로 구성된 비정질 실크는 메탄올이나 에탄올과 같은 유기 용매 침지법, 고온에서의 등온 결정화법 등을 통해 베타 시트 (β-sheet) 라는 결정질 구조로 일부 변화된다 [7–9]. 결정질 베타 시 트의 부피비는 결정화 방법에 의존하는 것으로 알려져 있 다. 섬유 축 방향으로 정렬된 베타 시트 결정질 피브로인 으로 인해 높은 인장 강도 등 실크 특유의 기계적 성질이 발현된다. SF를 포함한 생체고분자의 기계적 강도나 탄성 모듈러스는 이 재료들의 성능 개선이나 소자 응용을 위해 필요한 중요한 물성이다. 그간 거미줄을 포함한 다양한 천연 고분자가 보이는 높은 기계적 강도의 미시적 원인을 밝히기 위한 연구가 많이 진행되어 왔다 [10–13]. SF 필름에 대해서도 브릴루앙 산란법을 통해 비정질 실크 및 메탄올
∗E-mail: [email protected]
침지법에 의해 결정화된 실크의 탄성 특성이 보고된 바 있다 [14,15]. 특히 온도와 압력, 그리고 물의 함유 여부에 따른 탄성 특성의 변화가 체계적으로 조사되었다.
본 연구에서는 수화 (hydration) 방법 및 에탄올 침지법 에 의해 결정화된 실크 필름의 탄성 특성을 온도의 함수로 조사한 후 이를 비정질 실크 및 메탄올 침지법으로 결정화한 실크의 탄성 특성과 비교하였다. 탄성 특성은 기가 헤르츠 대역에서 탄성파를 측정할 수 있는 브릴루앙 산란법을 활용 하였고 온도에 따른 질량 변화와 열의 출입도 함께 측정하여 탄성 특성의 변화와 비교해 분석하였다.
II. 실 험
누에나방 (Bombyx mori)의 누에고치를 0.02 M Na2CO3
수용액에서 60분 동안 100 ◦C로 가열하고 증류수로 3회 반복 세척하여 세리신 단백질과 불순물 등을 제거하여 순 수한 실크 피브로인을 얻었다. 정련된 실크 피브로인은 CaCl2:H2O:EtOH = 1:8:2 mol 비의 혼합용매에 98 ◦C 에서 2시간 동안 용해시킨 다음 증류수에서 72시간 동안 투석하여 순수한 실크 피브로인 용액을 제조하였다. 제조된 실크 피브로인의 최종 농도는 6 wt%였다. 6% 실크 용액을 페트리디쉬에 3 또는 5 ml 부어서 건조시켰다. 건조 후에는 미라클로스 천으로 덮어 수증기 환경 속에 10분 간 장치하 는 수화방법 혹은 에탄올에 2시간 동안 침지시키는 방법을 이용하여 실크 필름을 결정화하였다. 실크 피브로인 필름의 구체적인 준비 과정에 대해서는 참고문헌 [16]에 자세히 기록되어 있다.
브릴루앙 산란 실험은 탄뎀 다중 통과 간섭계 (TFP-2, JRS Co.) 와 532 nm 파장의 다이오드 여기 고체 상태 레이 저 (Excelsior 532-300, Spectra Physics) 를 활용해 이루어 졌다. 현미경을 이용한 역산란 구도로 실험을 진행하였고 시료의 온도는 현미경 제물대 위에 장착 가능한 작은 온도 조절기 (THMS600, Linkam) 를 활용해 변화시켰다. 실험 장치 및 구도에 대한 상세한 설명은 다른 참고문헌에서 확인 할 수 있다 [17,18]. 실크의 열중량 분석 (thermogravimetric
analysis) 은 질소 분위기에서 5 ◦C/min의 가열 속도로 열 분석 장비 (Sinco, TGA N-1000) 를 이용해 이루어졌다. 실 크 필름의 열 흐름은 시차 주사 열량계 (SETARAM DSC 131 EVO) 를 활용해 수행하였다.
물의 함유가 실크 필름의 탄성 특성에 미치는 영향을 알아보기 위해 다음 두 가지 방법으로 실험을 진행했다.
우선 액체 질소 온도 혹은 상온에서부터 실크의 유리상전이 온도 이상의 고온까지 가열하면서 각종 특성을 평가하였다.
그 후 실크 필름을 100 ◦C로 올려 1시간 동안 대기한 후 저온으로 내리고 다시 가열하는 과정에서 특성을 평가하였 다. 1시간 대기 과정 중 함유된 물분자는 대부분 증발하는 것으로 확인되었다. 이를 통해 결정화도 및 물의 함유 가 탄성 특성에 미치는 영향을 정량적으로 평가할 수 있었다.
III. 본 론
Fig. 1(a) 와 (b) 는 각각 수화 방법으로 결정화된 실크 필름의 온도에 따른 열의 흐름 및 중량의 변화를 보여주고 있다. 중량은 상온에서의 값을 기준으로 줄어드는 비중을 나타냈다. Fig. 1(a) 의 내부 작은 그림 속에는 참고문헌 [14]에서 보고된 비정질 실크의 온도에 따른 열의 출입을 포 함시켜 결정질 시료와 비교하였다. Fig. 2(a) 와 (b) 는 각각 에탄올 침지법으로 결정화된 실크 필름의 온도에 따른 열의 흐름 및 중량의 변화를 보여주고 있다. 우선 Fig. 1(a) 의 내부 그림에서 제시된 비정질 시료의 열 흐름 데이터를 보게 되면 세 개의 특징적인 온도가 화살표로 표시되어 있음을 알 수 있다. 이는 저온에서부터 순차적으로 유리상전이 온도 (∼175 ◦C), 결정화 온도 (∼225 ◦C), 그리고 실크 필름이 변성되는 온도 (∼280◦C) 를 가리킨다. 반면에 Fig. 1(a) 와 Fig. 2(a) 에서 제시된 결정화시료 들의 경우는 유리상전이 온도 부근 (∼210 ◦C) 에서 약간의 흡열 (endothermic) 반 응이 존재하고 고온에서 변성에 의한 커다란 흡열 반응이 확인된 반면, 결정화에 따른 발열 (exothermic) 피크는 존 재하지 않음을 알 수 있다. 여기서 언급한 결정화 시료의 유리상전이 온도란, 실크 필름 내에서 결정화되지 않은 부 분의 유리상전이 과정에 관련된 온도를 의미한다. 결정화된 베타 시트의 부피비는 결정화 방법에 따라 약 10∼60% 사 이인 것으로 알려져 있다 [9]. 결정화가 일어나는 경우에는 엑스선 회절 패턴에서 결정화에 따른 링 패턴이 형성되는 것으로 알려져 있다 [7,19] 한편 ∼100 ◦C 부근에 보이는 넒은 흡열 반응은 함유된 물의 증발에 기인한 것이다 [6,7].
Fig. 1(b) 와 Fig. 2(b) 에 제시된 온도에 따른 중량 변화를 보게 되면 결정화 실크 필름들은 상온에서 유리상전이 온도
Fig. 1. (Color online) (a) Temperature dependence of the heat flow of hydration-crystallized silk film measured by using differential scanning calorimetry. (b) Temper- ature dependence of the weight of hydration-crystallized silk film with respect to the value at ambient condition.
The horizontal dashed line indicates the weight of 95%.
Inset of (a) is the heat flow of amorphous silk reported in Ref. 14.
까지 가열함에 따라 약 5% 정도의 중량이 줄어듦을 알 수 있다. 이는 가열 전 결정질 실크에 함유된 물의 중량 비중이 약 5% 정도라는 것을 의미한다.
Fig. 3(a) 와 (b) 는 에탄올 침지법으로 결정화된 실크 필 름을 100◦C에서 1시간 동안 열처리한 후에 상온으로 낮추 고 나서 가열 과정 중에서 측정한 온도에 따른 열의 흐름 및 중량의 변화를 각각 보여주고 있다. 우선 Fig. 3(b) 를 보면 100 ◦C에서 1시간 동안 대기하는 과정에서 함유된 물의 대부분이 증발되었음을 알 수 있다 (이 그림 속 화살표와 숫 자는 온도 변화의 순서를 보여준다). 이에 따라 Fig. 3(a) 의 열 측정 데이터에서 물의 증발과 관련된 넓은 흡열 피크가 존재하지 않음을 알 수 있다. 수화 방법으로 결정화된 실크 시료의 열 출입 및 중량의 온도의존성도 Fig. 3의 에탄올
Fig. 2. (Color online) (a) Temperature dependence of the heat flow of ethanol-crystallized silk film measured by using differential scanning calorimetry. (b) Tempera- ture dependence of the weight of ethanol-crystallized silk film with respect to the value at ambient condition. The horizontal dashed line indicates the weight of 95%.
처리 시료의 데이터와 거의 동일하게 나왔고 이에 따라 본 논문에는 포함시키지 않았다.
Fig. 4(a) 는 에탄올 결정화 시료의 열처리 전 (original) 과 열처리 후 (heat-treated) 동일 온도인 영하 150◦C에서 측정된 브릴루앙 스펙트럼을 비교한 것이다. 두 스펙트럼 모두 20 GHz 이상의 주파수에서 대칭적인 브릴루앙 피크를 보여주고 있고 이는 실크 필름 내 종 음향 모드 (longitudinal acoustic mode) 에 의해 입사 레이저광의 주파수로부터 변 화된 광산란 성분을 의미한다 (왼쪽과 오른쪽 피크는 각각 anti-Stokes 와 Stokes 성분을 가리킨다). 두 스펙트럼을 비교해 보면 열처리를 통해 물분자를 증발시킨 시료의 브 릴루앙 주파수가 약 1 GHz 정도 낮아졌음을 알 수 있다.
Fig. 4(b) 는 에탄올 결정화 시료를 열처리한 후에 액체질소 온도까지 낮추고 나서 가열 과정에서 측정된 브릴루앙 스 펙트럼의 일부를 보여주고 있다. 전체적으로 온도가 올라 감에 따라 종 음향 모드의 브릴루앙 주파수가 줄어들면서
Fig. 3. (a) Temperature dependence of the heat flow of the ethanol-exposed and heat-treated silk film mea- sured by differential scanning calorimetry. (b) Temper- ature dependence of the weight of the ethanol-exposed and heat-treated silk film with respect to the value at ambient condition.
반치폭이 증가하는 경향성을 보이는 것을 알 수 있다. 수화 방법으로 결정화된 시료의 브릴루앙 스펙트럼 역시 동일한 경향성을 보여주었기에 본 논문에는 해당 스펙트럼 데이터 를 포함시키지 않았다.
이렇게 측정된 브릴루앙 스펙트럼을 Voigt 함수로 곡선 맞춤을 수행, 종음향 모드의 브릴루앙 주파수와 반치폭의 온도의존성을 구했다. 브릴루앙 주파수와 반치폭은 각각 종음향 모드의 음속도 및 음향 감쇄 계수, 즉 음향 모드의 수명의 역수와 관련이 있다. Fig. 5(a) 와 (b) 는 각각 수화 방법으로 결정화된 시료의 열처리 전과 후의 브릴루앙 주파 수와 반치폭 (full width at half maximum, FHWM) 의 온 도의존성을 보여준다. 비교를 위해 참고문헌 [14]에 보고된 비정질 실크의 브릴루앙 주파수와 반치폭을 함께 그렸다.
Fig. 6(a) 와 (b) 는 각각 에탄올 침지 방법으로 결정화된 시료의 열처리 전과 후의 브릴루앙 주파수와 반치폭의 온 도의존성을 보여주고 있다. Fig. 5와 Fig. 6의 결과, 그리고
Fig. 4. (Color online) (a) Two Brillouin spectra of the as-prepared and heat-treated silk film, crystallized by ethanol immersion method, at -150◦C. (b) Temperature dependence of the Brillouin spectra of the heat-treated silk film crystallized by ethanol immersion method. The red lines denote the best-fitted results.
참고문헌 [15]에서 보고된 메탄올 침지법에 의해 결정화된 실크 시료의 브릴루앙 데이터를 비교함으로써 다음과 같은 몇 가지 결과를 얻을 수 있다.
첫째, 열처리 전단계, 즉 물이 함유되어 있는 조건에서는 결정화 과정이 탄성 특성의 온도의존성에 별다른 영향을 끼치지 않는다. 열처리 전 결정질 시료들의 브릴루앙 주파 수와 반치폭의 온도의존성은 비정질 실크의 결과와 거의 동일하였다. 이는 베타 시트 결정질 구조의 형성이 음속 도나 탄성계수에 영향을 주지 않음을 의미한다. 브릴루앙 산란실험을 통해 검출되는 음향 모드의 파장은 보통 수백 nm 정도이다 (본 실험에서는 약 180 nm 정도이다). 만약 형성된 베타 시트 결정질 구조의 크기가 이보다 훨씬 적다면 종음향 모드가 형성하는 변형 (strain) 하에 놓이는 결정질 구조의 음파에 대한 영향은 음파의 파장 내에서 평균화될 것이고 이에 따라 음파의 속도에 영향을 주지 않을 가능성이 높다. 보통 수화 방법을 통해 형성되는 실크 내 베타 시트
Fig. 5. (Color online) Temperature dependences of (a) the Brillouin frequency shift and (b) the full width at half maximum of the as-prepared and heat-treated silk films which were either amorphous or crystallized by hydration method. The data of the amorphous silk were taken from Ref. 16. The notation ‘(H)’ indicates that the data were obtained from the heat-treated sample.
의 부피비에 비해 알코올 침지법으로 형성되는 시료 내의 결정질 비중이 훨씬 높은 것으로 알려져 있다 [9]. 두 가지 방법으로 결정화된 실크 필름의 탄성 특성이 비정질 시료의 탄성 특성과 동일한 본 결과는 결국 베타 시트의 비중과 무관하게 성립한다고 볼 수 있다.
둘째, 고온에서 열처리를 해서 물분자를 제거하게 되면 실크 필름의 브릴루앙 주파수가 저온에서∼60◦C 사이에서 큰 차이를 보인다. 즉, 물분자의 존재는 실크 필름의 탄성 모듈러스를 증가시킨다 [14]. 이러한 결과는 물분자에 의해 유연성을 획득함으로써 탄성 모듈러스가 줄어들 것이라는 예상과는 반대의 결과였다. 또한, 위의 결과는 이러한 탄성 모듈러스의 증가가 실크 필름의 결정화 여부와 무관하게 일어남을 보여준다. 물분자들은 실크 고분자 체인 사이에 자리잡고 수소 결합을 하는 것으로 알려져 있다 [5]. 이러한
Fig. 6. (Color online) Temperature dependences of (a) the Brillouin frequency shift and (b) the full width at half maximum of the as-prepared and heat-treated silk film exposed to ethanol. The notation ‘(H)’ indicates that the data were obtained from the heat-treated sample.
수소 결합은 전체적으로 실크 필름 내 체인 사이 결합력을 강화시키고 탄성 모듈러스를 증가시키는 데 기여하는 것으 로 판단된다.
셋째, 결정질 실크의 유리상전이 온도는 비정질 실크에 비해 약 25도 이상 높아졌다. 유리상전이 온도를 넘어서게 되면 벌크 시료의 점도가 급격히 감소하면서 브릴루앙 주 파수의 온도 변화에 따른 감소 기울기가 크게 바뀌는 것이 일반적이다. Fig. 5(a) 를 보게 되면 고온에서 브릴루앙 주 파수의 기울기가 갑자기 변하는 온도가 있는데, 이 온도가 바로 실크의 유리상전이 온도이다. 동일한 그림은 비정질 시 료의 유리상전이 온도가 약 175◦C인데 반해 결정질 시료의 유리상전이 온도는 대략 200◦C 부근에 존재함을 보여준다 (Fig. 6(b) 에 보이는 에탄올 침지법에 의해 결정화된 시료 의 유리상전이 온도 역시 비슷한 구간에 존재한다). 이런 차이는 Fig. 1과 Fig. 2의 열 흐름 측정의 결과와 일치하는
것이다. 베타 시트의 형성은 고분자 체인의 교차 결합의 정도를 강화하고, 이에 따라 체인의 분절 운동 (segmental motion) 에 관련된 이동도를 줄여주고 이에 따라 유리상전 이 온도가 증가하게 되는 것으로 판단된다 [9].
마지막으로, 열처리 전과 후의 브릴루앙 주파수가 같아지 게 되는 온도 부근에서, 열처리 전 시료가 보이는 반치폭의 피크가 열처리 후에 줄어들거나 사라지며 평탄화되는 것을 확인할 수 있다. 이는 실크 필름의 결정화와는 무관하게 발생하였다. 물분자가 존재할 경우 특정 온도에서 발생하는 브릴루앙 주파수의 감소와 반치폭의 증가는 실크 필름 내에 종 음향 모드와 결합하는 완화 과정이 존재함을 보여준다 [20]. 즉 완화과정의 주파수와 종음향 모드의 주파수가 비 슷한 조건 하에서 두 과정 사이의 결합이 발생하면 에너지 교환이 발생하고 이것이 반치폭 상에 피크를 형성하게 한다.
그런데, 물분자가 빠져나가면서 이 완화과정에 의한 기여가 사라지는 점에 비추어 볼 때 이 완화과정은 물의 증발에 따라 감소하는 수소 결합 네트워크 속에 존재하는 물분자의 완화 과정일 가능성이 높다고 보여진다. 그렇지만, 이러한 시나리오는 메탄올에 의해 결정화된 실크 필름을 열처리할 경우, 왜 상온 부근에서 매우 현저한 완화과정의 신호가 보이는지를 설명하지는 못한다 [15]. 따라서 비정질 혹은 결정질 시료의 어떤 동적 특성에 의해 종 음향 모드와 강 하게 결합하는 완화과정이 발생하는지에 대한 보다 면밀한 조사가 필요할 것으로 보인다.
IV. 결 론
본 연구에서는 수화 방법 및 에탄올 침지법에 의해 결정 화된 실크 피브로인 필름의 온도 변화에 따른 열의 흐름, 중량의 변화, 탄성 특성의 변화를 조사하였고 이를 기존의 비정질 실크 필름 및 메탄올 침지법에 의해 결정화한 시료의 특성과 비교하였다. 결정질 시료의 열 흐름 데이터에서는 비정질 시료에서 보이는 결정화 흡열 피크가 보이지 않아서 해당 시료들이 적절히 결정화되었음을 알 수 있었다. 온도 에 따른 중량 변화는 결정질 시료들의 물의 함량이 약 5%
정도라는 것을 보여주었다. 섭씨 100도에서 열처리하기 전과 후의 탄성특성의 변화 결과를 통해 물분자가 함유된 실크 필름의 종음향 모드에 대응되는 탄성 계수가 더 높다는 것을 알 수 있었고 이는 물분자에 의한 수소결합에 기인한 것으로 해석되었다. 결정질 베타 시트의 함유는 실크 피 브로인 필름의 탄성 특성에 별다른 영향을 끼치지 않았고, 결정질 여부와 무관하게 함유된 물의 제거 과정에서 열처리 전 확인되었던 완화과정의 특징들이 두 결정질 시료에서 사라짐을 확인할 수 있었다.
감사의 글
본 연구는 2015년과 2016년도 한국연구재단 연구비 지 원에 의한 결과의 일부임을 밝힙니다 (NRF-2016R1A2 B4012646, NRF-2015R1A4A1041631).
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