1. 개요 □ 연구목적
○ Tetrahymena의 주전성 확인
Tetrahymena의 전기장에 따른 민감도를 측정하여 Tetrahymena를 유인할 수 있는 최적 전기장의 세기를 구한다.
○ 전기장을 이용한 치료 메커니즘 설계
실제로 감염된 Guppy를 전기장을 이용하여 치료해 보고 최적화한다.
○ 공학적 설계를 통한 치료 장치의 개발
Guppy가 스트레스를 받지 않으면서 Guppy disease를 효과적으로 치료할 수 있는 장치를 설계한다.
□ 연구범위
연구 범위는 크게 Guppy disease와 Tetrahymena 둘에 대한 내용으 로 나눌 수 있다. Tetrahymena의 경우 그 운동성에 대한 논문과 배양 조건에 따른 성장정도와 분리방법, 다른 동물성 개체에 대한 영향에 대한 논문들이 진행되어 있으며 가장 효율적인 연구 결과로는 마이크 로 구조를 부착한 Tetrahymena에 대한 운동성 부여에 대한 내용이다.
동물성 개체에 대한 영향에 대한 논문의 한 종류로서 Guppy disease에 대해서는 일반적으로 배양조건에 따른 감염률과 치사율, 저항성과 감염후의 Guppy에 대한 관찰에 대한 논문들이 진행되었다.
2. 연구 수행 내용
□ 이론적 배경 및 선행 연구 ○ Tetrahymena
Tetrahymena는 원생동물 중 섬모충류에 속하는 일반적으로 민물 에 사는 미생물이다. 자연 상태의 편리 공생에서 병원체로써 다른 생물에 기생할 수도 있다. Tetrahymena는 특이하게도 7개의 성이 있으며 21 조합의 유성생식과 스스로 번식하는 무성생식을 통해 환경
에 큰 제약을 받지 않고 번식하는 것이 가능하다. 하위 종으로는 Tetrahymena hegewischi, Tetrahymena hyperangularis, Tetrahymena malaccensis, Tetrahymena pigmentosa, Tetrahymena pyriformis, Tetrahymena thermophila, Tetrahymena vorax 가 있으며 이중 모델 생물로써 연구에 자주 쓰이는 대표적인 종이 Tetrahymena pyriformis와 Tetrahymena thermophila이다.
○ Tetrahymena의 운동성
Tetrahymena vorax의 주전성은 1980년대에 보고되었고, 최근에 Tetrahymena pyriformis가 주전성을 띈다는 사실이 발견되었다.
Tetrahymena pyriformis는 약 40~60μm 정도 되는 몸길이에 걸쳐 600개가량의 섬모가 돋아 있다. 주전성을 띄기 때문에 전기장에 의해 운동성이 영향을 받는데, 세포막에는 Ca2+과 K+이 온 몸 전체에 균일하 게 분포해 전기장에 즉각적으로 반응한다. 이러한 전기장에 의한 Tetrahymena의 운동성 변화는 두 개의 반대되는 힘에 의해 나타난다.
음극 쪽의 Ca2+채널의 활성화와 막전위의 음극화로 인한 섬모 운동을 강화하는 힘과 K+채널의 활성화와 막전위의 양극화로 인해 생기는 섬모 운동을 억제하는 힘이 작용한다. 따라서 전류가 주변 유체에서 세포내로 흘러들어올 때는 섬모 운동이 느려지고, 전류가 몸에서 몸 밖으로 흘러나가는 부분의 섬모는 운동이 가속되어 세포의 방향이 전류의 방향과 정렬되도록 알짜 토크가 작용하고 그 후에 전류 방향으 로 운동을 한다.
○ Tetrahymena의 배양
Tetrahymena는 운동성섬모충의 한 종류이다. 실험을 위한 배양 다른 균류와 비슷하게 배지 상에서 배양을 한다. Feeding with arachidonic acid-rich triacylglycerols from the microalga Parietochloris incisa improved recovery of guppies from infection
with Tetrahymena sp. (D.Zilberg, 2005) 논문에서 사용된 배지는 ATCC-357 이라는 배지로, Tryptone, Proteose peptone, K2HPO4의 조 합으로 이루어져 있으며, Penicillin G, Streptomycin을 첨가시켜 무균 환경을 조성해 준다. 이후 Multi well plate에 옮겨 담아 Subculture를 일주일 주기로 실시한다.
○ Guppy의 배양
Guppy 배양에 있어, 초점은 Guppy의 건강과 생존에 맞춰진다.
Guppy를 기르는 데 있어 생각해 주어야 할 것들에는 온도, pH, 삼투, 미생물 환경, 충분한 공간, 치어들이 자랄 수 있는 환경 등이 있다.
이러한 조건들을 모두 만족시키기 위해 0.5L당 Guppy를 1마리씩 기르 기로 하였으며 미생물을 키우기 위한 필터와 조명, 바닥재, 수초가 장착된 수조를 구비하여 온도가 일정하게 유지되는 방에 넣어주기로 하였다. 건강한 Guppy를 위하여 Guppy가 자주 걸리는 병들의 치료를 위해 약품도 넣어주어야 하며, 적절한 pH유지를 위해 완충용액을 이 용한다. 또한 수조를 여러 개 구비하여 건강한 Guppy들을 기르는 수조와 Tetrahymena에 의한 감염을 위한 수조를 나눈다. 수조에서 필터가 하는 역할은 단순히 물을 정화해 주는 기능뿐만이 아니다.
필터는 미생물의 배양을 돕고 치어들의 서식 공간이 되는 등 Guppy 배양에서 매우 중요한 역할을 한다. 새 수조는 미생물의 개체 수가 부족하여 Guppy들이 적응하지 못하고 죽는 빈도가 높다. 건강한 Guppy들을 기르는 수조의 경우 수조에 적응하지 못하고 죽는 Guppy 의 수를 최소화하기 위해서 수조에 미리 물과 바닥재, 수초 등을 배치 한 상태로 일주일동안 미생물들이 번식할 수 있도록 충분한 기간을 기다려야 한다.
○ Guppy의 감염
Guppy의 감염에 대한 방법은 크게 Immersion, Co-habitation,
Injection의 세 가지 방법이 있다. . 첫째로 Immersion은 40mL 용량의 Petri dish에 전체적으로 봤을 때 Tetrahymena.sp 40,000 ~ 400,000 개체수를 가지는 농도로 조절하여 0.060.01g 규격의 Guppy를 10마리 배양한다. 두 번째로 Co-habitation은 같은 용량의 Petri dish에 이틀 동안 두 마리의 감염된 Guppy와 건강한 Guppy를 총 10마리 정도 넣어준다. 이 때 감염된 Guppy는 살아있어도 죽어있어도 무방하다.
세 번째로 Injection은 0.600.19g 규격의 Guppy에 500,000 ciliates/mL 의 Tetrahymena.sp 배양액 0.02mL를 주사한다. 감염의 여부는 아가미 와 표피의 관찰을 통해 알 수 있으며, 8~10일에 60% 정도의 치사율도 가지므로 빠른 실험이 요구된다. Guppy disease의 증상의 백점병의 증상과 매우 비슷한데 이를 구별하기 위해 전문가의 조언을 구하였다.
백점병은 주로 급작스러운 수온의 하락으로 인해 Guppy에게 발생하 는 질병으로 일종의 감기 같은 질병이다. 따라서 치료방법도 이미 잘 정립되어 있으며 수온을 다시 높여 주거나 약을 투여하면 대부분의 Guppy들이 치료된다. 치사율 또한 낮아 치사율이 높은 Guppy disease 와는 비교된다. 따라서 Tetrahymena.sp에 의한 Guppy disease와 백점 병을 구별하기 위해서는 Guppy disease 또는 백점병이 의심되는 Guppy 개체들에게 백점병 치료약을 투여해 주면 된다. 백점병의 치료 는 빠르면 몇 시간, 늦어도 하루 만에 이루어지기 때문에 비교적 빠르 게 Guppy disease와 백점병을 구별할 수 있다.
□ 연구주제의 선정
○ Tetrahymena의 주전성을 이용한 Guppy disease의 치료법
현재 Guppy disease의 명확한 치료법이 존재하지 않는 상태이다.
Guppy disease의 원인 생물인 Tetrahymena의 주전성을 이용하여 Tetrahymena를 Guppy의 체내에서 물리적으로 빠져나오게 함으로써 Guppy disease를 치료할 수 있는 방안이 있을 것이라고 생각했다.
Tetrahymena는 전기장에 매우 민감하여 강한 주전성을 가지므로
Guppy disease에 대한 새로운 치료법의 개발이 가능할 것으로 보고 이를 연구주제로 선정하게 되었다.
□ 연구 방법
○ 주전성 생물의 주전성에 의한 운동성 관찰 ○ Tetrahymena의 주전성에 의한 운동성 관찰 ○ Guppy disease의 양상 관찰
○ 지속적인 전기장의 노출이 Tetrahymena와 Guppy에 미치는 영향 ○ Tetrahymena의 주전성을 이용한 Guppy disease 치료 메커니즘 고안 ○ Guppy disease 치료 장치의 설계 및 개발
□ 연구 활동 및 과정
○ Tetrahymena 분양 및 배양
국내에서 Tetrhymena pyriformis를 배양해서 분양하는 기관을 찾지 못해, Tetrahymena를 이용한 연구에 관한 논문을 여러 편 읽고, 논문 의 저자들에게 이메일로 문의하여 결국 미국의 Cornell University의 Cornell University Tetrahymena Stock Center에서 Stock ID SD00707 의 T. pyriformis GL-C strain을 분양받았다. 이후 1L 만큼의 ATCC-357 배지를 만들고, 7개의 250mL 삼각플라스크에 나눠 담았 다. 14mL 멸균액에 ampicillin 항생제를 50mg 녹여 2mL씩 각 플라스크 에 투여 하였으며, 이후 Cornell University에서 분양받은 Tetrahymena pyriformis 를 각 플라스크에 등분하여 나눠담았다. 이후 상온의 Shaker에 100rpm 설정하여 배양을 시작하였다.
그림 1. 배양 중인 Tetrahymena
○ 주전성 생물의 주전성에 의한 운동성 관찰
주전성이라는 생물의 특성 자체가 매우 생소했기 때문에 연구에 앞서 직접 생물의 주전성을 확인해보는 실험을 수행할 필요를 느꼈다.
그러나 연구 준비 과정 초기에 Tetrahymena를 분양하는 곳을 국내에 서 찾는 것을 실패해서 분양에 어려움을 겪었었다. 그렇기 때문에 Tetrahymena의 주전성을 확인하는 실험을 수행하기에 앞서 길이가 약 50μm 되어 Tetrahymena보다 2배에서 7배 정도까지 커서 개체 하나하나가 육안으로 관찰하기 쉬운 Paramecium을 이용해 예비 실험 을 수행하였다. Paramecium은 학교와 인접한 위치의 경기도 과학교육 원에서 배양을 하는 덕분에 쉽게 분양받을 수 있었다. 예비 실험의 정확한 목적은 주전성을 띄는 생물의 주전성을 직접 확인하여 주전성 실험의 대표적인 실험 대상 중 하나인 Paramecium의 전압과 전류에 따른 주전성에 의한 운동성 정도를 알아보는 것과 주전성 실험에서 주의해야 할 점들을 깨닫는 것이었다.
실험을 수행하기 위해 직접 주전성 실험 키트를 설계･제작하였다.
이를 위해 두께 2mm의 아크릴판을 여러 직사각형 모양으로 절단하여
결과적으로 5*3*3cm크기의 직육면체 형태로 제작하였다. 그리고 전 류를 흘러줄 수 있도록 직육면체 내부 양쪽에 3*3cm크기의 유리전극 을 부착하여 전압을 걸 수 있도록 한 주전성 실험 키트를 그림 1와 같이 제작하였다. 제작을 완료한 후에, 직접 만든 배양액에서 배양한 Paramecium을 배양액과 함께 실험 키트에 담아 양쪽의 유리 전극에 DC Power Supply를 연결해 전압을 걸어주어서 실험을 하였고, 전압을 조작 변인으로 하여 Paramecium의 주전성에 의한 운동성의 변화를 관찰하였다.
그림 2. 주전성 실험장치
그림 3. Paramecium
○ Tetrahymena의 주전성 확인 실험
현미경으로 Tetrahymena의 주전성을 관찰하기 위해서 프레파라 트 자체에다 전압을 걸어주는 장치를 제작하였다. 이 장치의 제작을 위해 전기영동 장치의 작동 원리를 참고하였다. Tetrahymena 배지의 전해질 성분으로 인해 배지 자체가 전기 전도성을 띄므로 탄소 전극으 로 전압을 걸어주었을 때 현미경으로 Tetrahymena의 움직임을 관찰
함으로써 주전성을 확인한다.
○ Guppy의 배양
Guppy는 적절하게 배양당하기 위해 정수된 물이 채워진 20L 들이 의 산소공급장치와 조명이 장착되어 있는 Amazon 사의 수조를 사용 하였다. 1차적으로 수조 안에는 20마리의 Guppy가 주거하였으며, 거주지를 이동당한 Guppy들에 대해서는 2일 동안의 단식기간을 거쳐 적응기간을 갖게 해주었다. 하지만 기본적인 대조군 Guppy에 대해서 치사율이 높게 관찰 되었다.
○ Guppy의 접종 및 Tetrahymena의 개체 수 확인
접종에 사용된 방법은 Guppy에 대해 직접적인 상처를 내준 후 감염 시키는 방법이 아닌, 주사법을 사용하였다. 주사법의 경우 특정 부위 에 직접 투여하여 경과를 관찰 하는 데에 이점을 가지고 있으며, 전체 적으로 감염의 정도에 대한 시작을 표준화 시키는 데에 적절하다고 판단되어 사용되었다. 사용한 주사 개체 수는 이론적 배경에 명시된 방법에 따라 사용하였다. 이 과정에서 Hemacytometer를 이용하여 개체수를 조절하였으며, 추가적인 설명을 붙이자면 Hemacytometer 방법이란 커버글라스와 준비된 슬라이드 글라스사이에 0.0001 ml의 부피를 가지는 프레파라트를 준비하여, 미생물을 모세관현상에 따라 주입시킨 후, 칸 수에 따른 개체의 밀도를 계산하여 전체 부피에 대해 적용시켜 전체의 특정 개체에 대한 수밀도를 결정하는 것이다. 이 때 관찰을 용이하게 만들기 위해 tyrypan blue 염색약을 대표적으로 사용하였으며, 현미경을 사용하여 관찰하였다.
○ Tetrahymena의 조직투과성 실험
Tetrahymena는 기본적으로 상처를 파고들어 기생하는 형식의 생 활을 하기 때문에 이를 빼내기 위해서는 상처가 아물기 전에 치료를
완성시키는 방법이외에는 다시 조직을 따라 나오는 방법을 사용해야 만 한다. 따라서 Tetrahymena는 조직에 대한 투과성을 가져야만 하 며, 이에 대해서는 일반적인 생선의 조직에 대해서 조직투과성 실험 을 시행하고자 한다. 조직투과성 실험은 테두리에 외부 출입을 막는 벽을 가지는 용기에 대해 가운데에 양쪽을 분리시키는 생선조직을 얇게 도포한다. 이에 대해서 한쪽 공간에 대해 Tetrahymena 배양액을 주입시키고 반대쪽에는 Tetrahymena가 이동할 수 있도록 개체수를 가지지 않는 배양액을 도포하여 반대편에서의 검출이 확인 되는지에 대해 결과를 분석한다.
○ Guppy disease 치료 장치의 설계 및 개발
치료 장치의 현실적인 구현에 있어서 두 가지의 방안을 구상하였다.
먼저 마취를 통한 물고기의 개별적인 치료이다. 이는 보다 확실한 치료가 가능하겠으나 경제적인 측면에서도 좋지 않을 뿐더러 마취로 인해 또 다른 문제가 발생할 것으로 예상된다. 두 번째는 마취를 하지 않고 물고기가 지나는 터널을 만들고 물의 흐름을 한 방향으로 줌으로 써 물고기의 경로를 제한하고 제한된 경로를 따라 전기장을 걸어줌으 로써 Tetrahymena를 체외로 빠져나오게 할 수 있다. 첫 번째 장치보다 는 효율이 낮겠지만 물고기에게 주는 영향이 적다는 장점이 있다.
① 첫 번째 방안
․ 치료에 있어서 guppy의 운동을 제한할 필요가 있으나 이는 스트레 스로 이어질 수 있기 때문에 마취의 필요성이 있다. 감염된 물고기 를 마취시킨 상태로 전기장을 걸어주어 Tetrahymena를 몸 밖으로 나오도록 유도하는 것이 기본적인 설정이다.
․ 일반적으로 마취시킨 물고기는 헤엄을 치지 못하고 거꾸로 떠다니 기 때문에 인공적인 물의 흐름을 조성하여 물고기가 죽지 않도록 신경 써야 한다.
․ Tetrahymena의 감염은 주로 비늘의 상처를 통해서 이루어진다.[3]
따라서, Tetrahymena가 Guppy의 체외로 빠져나올 때에도 전기장 을 걸어줌으로써 같은 경로를 통해 나올 수 있을 것이다.
․ Guppy disease의 발병 장소에 따라 Tetrahymena의 최소이동경로가 다를 것이기 때문에 치료 장치를 원통형으로 만들어 전극이 회전이 가능하도록 디자인한다.
그림 4. 첫 번째 방안의 대략적인 구조
② 두 번째 방안
․ Guppy의 운동을 마취를 통해 제한하지 않기 위한 모델
․ 실험 결과, Tetrahymena가 guppy의 몸 밖으로 나오는데 시간이 충분히 짧아야 실현가능하다.
․ Guppy가 몸의 방향을 바꾸지 못할 정도로 작은 폐쇄된 트랙 을 만들어 한번 들어간 guppy는 길을 따라 갈수 밖에 없도록 하고, 트랙의 외벽에 일정한 방향으로 음극과 양극을 설치해 guppy 입장에서는 트랙을 통과하는 동안 일정한 방향의 전기 장을 지속적으로 경험하도록 하여, guppy가 트랙을 통과하는 과정에서 Tetrahymena가 주전성에 의해 체내 밖으로 나오도 록 하는 모델이다.
그림 4. 두 번째 방안의 대략적인 구조
․ 추가적으로 웹캠과 프로그래밍을 이용해서 수조 속의 물고기 의 작은 움직임을 따라가며 전극의 위치를 보정하는 기계장치 를 개발, 설치하도록 한다.
3. 연구 결과 및 시사점 □ 연구 결과
○ Tetrahymena에 대한 음극주전성이 확인 되었다.
○ Hemacytometer를 이용하여 Tetrahymena의 배양 주기에 따른 수밀도 를 파악하였다.
○ Guppy 배양에 원인모를 높은 치사율로 많은 어려움을 겪었다.
○ 접종 이후의 Guppy는 문헌 값과는 다르게 환경적인 요인에 의해 빠른 시간 특징적으로 높은 치사율을 또 가지게 된다.
○ Guppy 배양 및 접종 과정에서의 치사율을 줄이는 방안을 고안하는 연구 또한 결과를 가져올 것으로 예상된다.
○ Tetrahymena에 대한 조직투과성에 대한 실험의 결과에 따라 치료장 치의 설계나 추가적인 실험들이 진행될 예정이다.
○ 아직 연구가 진행 중이며, 연구기간 내 연구를 마무리 할 예정이다.
□ 시사점
○ Tetrahymena의 주전성의 민감도를 보아, Tetrahymena 뿐만 아니라 다양한 주전성을 가진 원생생물들의 주전성을 기계적인 원동력으로 사용하는 것도 가능할 것으로 보인다.
4. 홍보 및 사후 활용
○ Guppy disease를 치료할 수 있는 새로운 방법을 제시하는 것이므로 특허를 등록할 수 있다.
○ 수의학 관련 학회지, 어류 관련 학회지 등에 개제할 수 있다.
○ Tetrahymena의 주전성을 이용한 Guppy disease의 치료 메커니즘에 관한 연구를 통해 Guppy disease를 효율적으로 치료할 수 있는 공학적 인 장치를 개발하여 수족관 등에서 물고기의 질병 치료 및 방지를 도울 수 있다.
○ 기존의 약물을 이용한 화학적인 기생충 치료와는 달리 공학적인 치료 법을 제시할 수 있다.
○ 주전성을 이용한 치료 방법이 Tetrahymena 이외의 다른 기생충에도 적용될 수 있는가에 관한 추가 연구를 진행한다면 다른 질병도 같은 메커니즘을 통해 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
5. 참고문헌
[1] Glenn L. Hoffman. (1955, 1975). A Disease of Freshwater Fishes Caused by Tetrahymena Corlissi Thompson and a Key for Identification of Holotrich Ciliates of Freshwater Fishes. The Journal of Parasitology.
[2] Jihoon Kim. (2011). Quantitative measurement of dynamic flow induced by Tetrahymena pyriformis (T. pyriformis) using micro-particle image velocimetry. Visualization Society of Japan.
[3] Imai, S., et al. (1990). Tetrahymena infection in guppy, Poecilia
reticulata.
[4] D.Zilberg., et al. (2009) Protective immunization against Tetrahymena sp. infection in guppies.
[5] D.Zilberg., et al.(2009) Tetrahymena sp. infection in guppies, Poecilia reticulata Peter parasite characterization and pathology of infected fish.
[6] D.Zilberg., et al.(2005) Environmental and physiological conditions affecting Tetrahymena sp. infection in guppies, Poecilia reticulata Peters.
