2007년 8월 박사학위논문
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2007년 8월 25일
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이 논문을 의학박사학위 신청 논문으로 제출함.
2007년 4월 일
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목
목목 차차차
도 목 차 ABSTRACT
서 론 ---1
실험재료 및 방법 ---4
결 과 ---6
고 찰 ---9
결 론 ---12
참 고 문 헌 ---13
LegendsforFi gures
---17Fi gures
---19도
도도 목목목 차차차
FFFiiiggg...111...A 30㎛ transversesection oftheDCN and VCN immunostained for Calbindin D-28ka immunoreactive neurons in the cochlear nucleusofchinchilla.--- 19
FFFiiiggg...222...Theschematicofthecochlearnucleus(rightandleft).
Continuous lines indicate major division, dashed line indicate subdivision, dotted lines indicate parts or sectors of subdivisions.
CalbindinD-28kaimmunoreactiveneurons.--- 20
FFFiiiggg...333...A 30㎛ transverse section of the superior olivary nucleus of thechinchillaimmunostainedforcalbindinD-28ka.---20
FFFiiiggg...444... Electronmicrographofthecochlearnucleus.
Note conspicuous cytoplasmic density resulting from intracytoplsmicorganelles. ---21
FFFiiiggg...555...Note the positive immunoreactive calbindin D-28ka particle(CP) and non labled immunoreactive calbindin D-28ka particle(NCP).
---22 FFFiiiggguuurrreee666...Electronmicrographofthecochlearnucleus.---23
FFFiiiggg...777...Electron micrograph ofthe DCN immunostained with antibody tocalbindinD-28ka.---24 FFFiiiggg...888...Electron micrograph ofthe myelinated axonalprocess(A)ofthe
VCN immunostainedwithantibodytocalbindinD-28ka.---25
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A unique class cells, strongly immunopositive for anti-calbindin D-28ka were observed in and near the cochlear nucleus of the chinchilla( ).They were preferentially located in the dorsalcochlear nucleus,as wellas in the adjacent superior olivary nucleus.The calbindin D-28ka positive neurons had relatively large cell bodies with thick, heavy spinal dendrites, and were typically situated in the immediate subpial position. The calbindin D-28ka immunoreactive neurons were very varied morphologically; bitufted, bipolar,multipolarand horizontalcells in shape,and the diameters of theneuronsare16～30㎛ havebeen described in thecochlearnucleus ofthe chinchilla.Also,the calbindin D-28ka positive dendrites were considerably moredensely arrayedthan thoseofothercochlearnuclear
cells,including thecartwheelcellsofthedorsalcochlearnucleus.
The fine structure of the cells in the cochlear nucleus in the chinchilla( ) was studied by transmission electron microscopy.Theneuronshad a large,round,centrally located nucleus, andtheircytoplasm containednumerousmitochondria,myelinatedaxon, dense granular endoplasmic reticulum, abundant Golgi apparatus, groups of free ribosomes, some heterogeneous particles and neurofilaments. Cell surfaces were studied irregularly with small spinous processes,and they contained a few fine irregularly arranged neurofilaments and some granular endoplasmic reticulum. Boutons contacting the soma and dendrites of the cochlear nucleus neurons weredefined astheaxosomaticsynapses.Based on differencesin the bouton and vesicle morphology,the foursynaptic bouton types were identified;
1. Asymmetrical and symmetrical synapses with small rounded vesicles.
2. Asymmerical synapses with pleomorphic admixture contained predominantly sphericalvesicles.
3. Symmerical synapses with pleomorphic vesicles of flattened, sphericalanddense-corevesicles.
4.Asymmetricalaswellassymmetricalsynapseswith heterogeneous andlargedense-corevesicles.
Synaptic boutons containing the rounded vesicles and the large dense-corevesiclesweremostfrequently observed.
서
서서 론론론
청각정보는 속귀신경(CN VIII)의 달팽이신경(cochlearnerve)을 거쳐 뇌 줄기에 도달한다.달팽이신경은 나선신경절(spiralganglion)에 있는 신경 세포체와 1차 감각신경섬유의 집합체로서 말초돌기는 달팽이털세포 (cochlear hair cell)에 분포하고, 중추돌기는 다리뇌숨뇌이음부 (pontomedullary junction)에 위치한 등쪽과 앞쪽 달팽이핵(cochlear nucleus)에서 끝난다.달팽이핵의 2차신경세포는 일부 다른 감각계통과는 대조적으로 마름체(trapezoidbody)에서 교차하여 양쪽으로 투사되어 청각 계통의 상위수준에 도달한다.이런 특이성은 양쪽 귀로부터 오는 소리의 위치 파악을 가능하게 한다.양쪽 귀에서 오는 정보를 해석하는 장소는 위올리브핵(superiorolivary nucleus)으로서 각각의 올리브핵에서 오는 운 동신경섬유는 달팽이핵의 모든 신경섬유가 모여 가쪽섬유띠(lateral lemniscus)를 타고 아래둔덕(inferiorcolliculus)으로 올라간다.이후 아래 둔덕팔을 통해 시상의 안쪽무릎핵(medialgeniculatenucleus)으로 투사하 여 여기서 관자엽의 청각겉질로 투사하여 소리로 해석되며,이들 여러 기 관 중 청각의 기능을 수행하는 가장 중요한 기관은 달팽이핵이다.달팽이 핵은 특이한 세포로 구성되어 있으며 등쪽달팽이핵(dorsal cochlear nucleus,DCN)과 배쪽달팽이핵(ventralcochlearnucleus,VCN)으로 구성 되어 있으며,DCN은 넷째뇌실바닥의 가장외측에 융기를 형성하고 있고, VCN은 달팽이신경섬유의 주행에 따라 달팽이신경의 머리쪽에 위치하는 앞배쪽핵과 뿌리쪽에 위치하는 뒤배쪽핵으로 나뉜다(Morest등,1990).
한편 달팽이신경핵은 glutamate와 glycine등과 함께 calbindin D-28ka(CB)가 주된 신경표지물질인 것으로 알려지고 있다(Celio,1990;
Ferrer등,1992).이들 신경표지물질의 하나인 CB은 calmodulin,S-100, calretinin,그리고 troponin-C 및 일부 다른 단백질은 높은 친화력을 가지 고 칼슘과 결합하는 것으로 알려지고 있으며,이들을 vitamin-D의존성 칼 슘결합단백질(calcium-binding protein)이라 하며 “E-F hand”계에 속하며 대부분의 포유동물 및 척추동물의 말초신경계 및 중추신경계 전역에 걸쳐 광범위하게 분포하고 있는 것으로 알려지고 있으며,CB의 기능은 아직까 지 명료하게 밝혀지지 않았으나 최근 CB는 신경세포안에서 칼슘의 항상 성을 조절하고 여러 가지 다양한 세포작용의 과정에서 일시적인 칼슘의 수송/완충단백질(transport/bufferprotein)로서 작용하는 것으로 알려지고 있으며 고농도의 칼슘이 신경세포 내에 축적되어 손상 받은 신경세포를 보호할 뿐만 아니라 허혈(ischemia),Parkinson 병,Huntington 병 그리고 Alzheimer 병 등 신경퇴행성 질환에서 특수한 신경세포를 보호할 뿐만 아니라 신경전기생리학적인 성질과 대사작용에서 특수한 기능을 수행하는 것으로 알려지고 있다(Alonso등,1995;Celio,1990;Devenecia등,1995;
Nag와 Wadhwa,1996).
특히 최근에는 청각기능을 수행하는데 있어서 CB는 칼슘체널의 일원으 로 매우 중요한 기능을 수행하며 특히 속귀의 나선기관(organofCorti)안 에 있는 지지세포 및 내부 및 바깥털세포에서 감지된 신경자극을 달팽이 신경절을 경유해서 달팽이신경,달팽이핵에 전달하여 최종적으로 대뇌 관 자엽의 청각중추로 전달하는데 매우 중요한 기능을 수행하는 것으로 알려 지고 있다(Brederode 등,1991;German 등,1997;De venecia 등,1995;
Kubota와 Jones,1993;Magusson등,1996).
chinchilla는 청각에 관계되는 달팽이 기관의 기능과 구조에 대한 연구 를 수행하는데 많이 이용되는 설치류 동물이다.이 동물은 작은 포유동물 과 비교할 수 있고 사람의 청각기능과 매우 유사할 뿐만 아니라 특히 매
우 낮은 주파수의 소리도 감지할 수 있어서 청각세포의 신호전달기능,항 체표지 및 외상,그리고 신경로 추적 방법 등 청각기능을 연구하는데 많 이 이용되고 있다(Morest등,1990).
따라서 저자는 chinchilla 달팽이핵에서 CB양성반응신경세포(CB-IR세 포)의 분포상과 세포의 형태 및 크기를 면역조직화학적방법을 이용하여 분석하고 이 세포의 미세구조를 관찰하고자 본 연구를 시도 하였다.
실실실험험험재재재료료료 및및및 방방방법법법
111...실실실험험험동동동물물물
본 실험에 사용한 동물은 체중 600～700gm의 chinchilla 3마리를 암수 구별 없이 사용하였다.
222...조조조직직직표표표본본본처처처리리리 및및및 면면면역역역세세세포포포화화화학학학적적적 염염염색색색 111...광광광학학학현현현미미미경경경
실험동물은 ketamine(3㎖/kg,i.p.)으로 마취시켜 좌심실을 통하여 500
㎖의 ringer-dextrose로 관류한 다음 1000 ㎖의 4% paraformaldehyde와 1% glutaraldeyde(0.1M Phosphate buffer,pH 7.4) 혼합한 고정액을 3 8℃～40℃ 온도로 조절한 후 심장을 통하여 관류 고정시켰다.관류 고정 시킨 후 실험동물은 고정대에서 1시간～2시간 방치시킨 다음 뇌줄기를 적 출하여 2차 고정액에 넣어 4℃에서 하룻밤 더 고정하였다.그 다음날 뇌줄기에서 실험에 사용할 달팽이핵을 적출한 후 30% sucrose가 들어 있 는 phosphatebuffer용액에 넣어 조직속에 충분히 침투되도록 4℃에 하 룻밤 동안 침적시켰다.그 다음날 조직을 꺼내 vibratome과 cryocut을 이 용하여 35～40㎛두께로 연속 관상절편과 시상절편을 만들었다.이 절편들 은 항체의 조직 투과성을 높이기 위하여 0.05% Triton X-100(Sigma)을 사용하였으며 그 후 조직절편 전체를 phosphatebuffersaline(PBS)에 수 차례 씻어 낸 후 10% normalserum에 30분 동안 침적시킨 후 PBS로 여 러 차례 세척하여 3% H2O2로 20～30분간 실온에서 처리하여 내인성 과 산화효소의 활성을 억제시킨 다음 1% normalalbumin과 0.05% Triton X-100이 들어 있는 PBS 혼합 용액에 약 2시간 정도 처리하여 비특이적
반응을 억제시킨 후 제 1항체인 monoclonal mouse anti-calbindin D-28ka(Sigma)항체를 1:2,000～1:5,000으로 희석하여 4℃에서 24～36 시간 반응시켰다.PBS에 10분씩 3회 세척한 후 제2항체인 biotinylated goatanti-rabbitIgG(Dako)를 1:200으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 다시 세척한 다음 제3항체인 avidin-biotin peroxidase complex(Vector)를 1:100으로 희석하여 1시간 반응시켰다.과산화효소에 대한 발색제는 3.3‘-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB,Sigma)을 사용하였다.반응이 끝난 조직은 gelatin이 피막된 slide위에 얹어 통상의 탈수 과정을 거쳐 polymount로 봉입하여 광학현미경을 이용하여 CB에 대한 양성반응세포(CB-IR세포)를 관찰하였다.
222...전전전자자자현현현미미미경경경
광학현미경에서 CB-IR세포를 관찰 확인하여 1% osmium tetroxide용 액(pH 7.4,0.1M cacodylatebuffer,4℃에)에 2시간 동안 후 고정하였다.
고정된 조직은 통상방법에 따라 PBS로 세척한 다음 저 농도의 ethanol(50%)로부터 고농도(100%)의 순서로 탈수하여 propylene oxide를 사용하여 치환시켰으며 Epon혼합액에 포매하여 35℃,45℃,60℃ oven에 서 36시간 중합하였다.이 epon block을 1㎛정도의 두께로 절편을 만든 다음 0.1% toluidinblue로 염색하여 관찰한 뒤 ultramicrotome(LKB-V)으 로 초박절편을 만든 다음 통상법에 의한 uranylacetate와 citrate로 이중 염색하여 가속전압 80KV하에서 투과전자현미경(Hitachi(H-7600))으로 관 찰하였다.
결
결결 과과과
111...광광광학학학현현현미미미경경경관관관찰찰찰
CB-IR세포는 달팽이핵의 등쪽달팽이핵의 과립층에서 가장 많이 출현하 는 것을 관찰할 수 있었다.특히 중간내측의 연막아래층과 접촉하고 있는 부위에 많이 출현하고 있었으며 중간층에서도 비록 소수이긴 하지만 관찰 할 수 있었다(Fig.1)그러나 등쪽달팽이핵의 깊은 층에서는 전혀 관찰할 수 없었다.또한 배쪽달팽이핵에서는 매우 작고 소수의 CB-IR세포가 출 현하였으며 주로 배쪽달팽이핵의 앞쪽에서 관찰할 수 있었다(Fig.1과 2).
CB-IR세포체는 긴타원형,원형,피라밋형,삼각형등 다양한 형태로 출현 하였으며 가지돌기를 포함한 신경세포의 형태는 뭇극,이극,홑극,수평형 등 다양한 세포의 형태를 관찰할 수 있었으며 크기는 16～30㎛정도였다.
한편 청각기능을 도와주는 달팽이핵에 인접하고 있는 위올리브핵에서도 강한 CB-IR세포들을 관찰할 수 있었다(Fig.3).
222...전전전자자자현현현미미미경경경관관관찰찰찰...
전자현미경관찰의 결과 배쪽달팽이핵(anteroventral cochlear nucleus AVCN)에서 큰 타원형세포는 축삭세포체연접(axosomatic synapse)을 하 고 있음을 관찰하였다(Fig.4).그러나 양성반응을 나타내는 귀신경의 종 말장치에 출현하는 형태학적인 특성을 가지고 있는 축삭세포체연접은 세 포체에서는 전혀 관찰할 수 없었다.커다란 둥근 소포 모양의 연접이후부 위에서 팽출융기가 비대칭적 활동대에서 출현 하였고 연접이전부위에서는 함입 된 상태로 활동대에서 출현함을 관찰할 수 있었다.활동대 사이의 세포바깥공간의 확장영역에서는 신경교세포가 점유하고 있음을 관찰할 수 있었다.CB-IR세포는 면역반응을 나타내는 귀신경종말장치에서 신경교세 포의 성분을 가지고 있었으며 말이집으로 둘러싸인 축삭을 관찰할 수 있
었고 다양하고 강력한 면역반응 산물이 커다란 원형세포의 세포체와 일차 가지돌기에서 출현함을 관찰할 수 있었다(Fig.5,6,8).CB-IR세포의 수 용체의 소단위(subunit)에서 대부분의 항체는 일부연접의 연접이후 영역 에서 치밀하게 출현하였다.연접이후 부위에서 치밀하게 염색된 연접이 다형성(plemorphic)의 소포가 신경말단에 출현하는 것이 일부 항체에서 흔하게 출현하지 않았지만 전형적으로 이들 연접은 구멍을 갖는 비대칭성 의 치밀도를 보였고 원형의 소포로 출현하였다.즉 다양한 형태를 가진 CB-IR세포의 종말이 달팽이핵의 여러 부위에 출현함을 관찰할 수 있었다 (Fig.5,6).이끼형태의 종말은 토리(glomerulosa)의 가운데에서 둥글고 불규칙하게 종말하고 있었으며 수많은 연접소포와 사립체가 출현함을 관 찰할 수 있었다(Fig.4,5).수평섬유(parallelfiber)의 종말은 가시돌기와 가지돌기 모두에서 연접을 형성하고 있었다.DCN의 수평섬유의 연접의 가장 흔한 것 중의 하나는 커다란 가시돌기의 머리를 형성하고 있었다.
그러나 대부분의 경우 연접이후 신경세포에 염색된 물질을 관찰할 수 없 었다(Fig.4,7)일부 수상돌기의 세포질과 신경세포체에서는 CB에 양성 반응을 나타내는 항체를 가장 많이 관찰할 수 있었다.그러나 항체의 염 색의 형태는 매우 다양하였으나 대부분의 경우 세포질 전체에 염색이 되 어 있었으며 일부는 세포질에 작은 구획을 이르고 있었다.
달팽이핵에서 관찰된 CB-IR세포와 신경아교세포들의 형태는 중추신경 계에서 관찰된 세포들과 비슷하였으며 chinchilla의 달팽이핵에서 신경세 포의소포의 크기,모양,연접의 형태에 따라 3가지형태의 CB-IR세포를 관 찰할 수 있었다.제1형의 CB-IR세포는 세포체가 크고 둥글며,명료한 연 접소포를 가지고 있었다.이들은 사립체와 연접소포로 둘러싸인 미세섬유, 신경미세섬유를 가지고 있었으며 연접 끝 부위에서 매우 치밀한 염색성을 보였으며 전형적인 말이집섬유가 분포하고 있음을 관찰할 수 있었다.제2
형의 CB-IR세포체에서 다양한 형태로 수상돌기가 뻗어 나가고 있었다.
매우 커다란 원형의 핵과 핵속의 인이 동심원상으로 매우 뚜렷한 형태를 취하고 있었으며 때때로 막대모양의 가는 섬유도 관찰할 수 있었다.핵은 둥근 형태였지만 핵막은 보통 주름처럼 군데군데 겹쳐 있었다.제3형의 CB-IR세포에서는 납작한 형태의 소포였지만 때때로 이들 소포 사이에 작 고 둥근 형태의 소포도 관찰할 수 있었으며 연접 끝은 원형이었다.제 1,2,3형의 CB-IR세포의 세포질에서는 공히 과립세포질그물,세망섬유와 골지복합체,수많은 사립체,리보소체,미세섬유,미세신경섬유등 세포소기 관을 관찰할 수 있었다.연접은 축삭축삭연접(axoaxonicsynapse),축삭가 지돌기연접(axodendritic synapse),축삭세포체연접(axosomatic synapse), 가지돌기사이연접(dendodendritic synapse), 세포사이연접(somstosomatic synapse)의 다양한 연접의 형태를 관찰할 수 있었다(Fig.4,5,6,8).
고고고 찰찰찰
달팽이핵에서 CB의 중요한 기능에 대해서는 아직까지 확실히 밝혀지지 않았지만 여러 연구자들의 보고에 의하면 CB는 신경세포안에서 칼슘농도 를 조절하여 주는 완충역할을 수행하여 발생중인 신경세포 또는 성숙한 신경세포를 보호해 주는 것으로 알려지고 있다(Kashiba등,1996;Kurobo 등,1992;Miki등,1997;Rhodes등,1981;Seress등,1993).또한 흥분 독 성으로부터 신경세포를 보호해 주고 신경세포내의 신호전달 체계의 수용 기를 조절해 주는 것으로 알려지고 있으며 신경세포의 죽음을 유도하는 물질로부터 허혈,퇴행성신경질환,노화등과 관련이 있는 특수 신경세포 집단을 보호하는 것으로 보고되고 있다(Tortosa와 Ferrer,1994;Tunon 등,1992;Villa등,1994).이들 세포는 신경전달물질로서 이용될 뿐만 아니 라 최근에는 청각기능을 수행하는데 있어서 칼슘체널의 일원으로 매우 중 요한 기능을 수행하며 특히 속귀의 나선기관안에 있는 지지세포 및 내부 털세포와 바깥털세포에서 감지된 신경자극을 달팽이신경절을 경유해서 달 팽이 신경,그리고 달팽이핵에 전달하는데 중요한 기능을 수행하는 것으 로 알려지고 있다.
CB는 척추동물이나 포유동물의 새 피질층에서 뿐만 아니라 뇌 전체의 여러핵에 고루 분포하고 있다고 보고 하였다(Ferrer 등,1992).그러나 chinchilla의 중추신경계나 말초신경계에서 CB에 대한보고는 접할 수 가 없었다.
광학현미경으로 관찰한 결과 본 연구의 chinchilla달팽이핵에서 CB-IR 세포는 등쪽달팽이핵에 집중적으로 분포하고 있었으며,CB-IR의 형태는 방추형,타원형,원형 이었고 두극 및 뭇극신경원으로 Celio등(1990)의 보
고와 일치하였다.또한 CB-IR세포의 크기를 보면 본 연구에서 16～30㎛
로 다양 하였다. Ferrer 등(1992)은 흰쥐의 후각피질층에서 10～15㎛, Schmidt등(1992)은 흰쥐의 시각계에서 15～20㎛,Alonso등(1995)은 흰쥐 달팽이핵에서 Purkinje세포와 비슷한 형태의 양성반응세포를 관찰하였는 데 세포의크기가 18～30㎛였다고 보고 하였고,Tortosa 등(1994)은 사람 의 흑색질에서 18～22㎛ 크기 등으로 저자들은 각각 보고하였으나 본 연 구의 결과와 약간 차이를 보였다.이와 같이 여러 보고자들의 CR-IR세포 의 크기가 서로 차이가 있는 것은 실험에 사용한 동물과 실험동물의 뇌의 관찰 부위가 다르기 때문이며 또한 저자들의 실험 방법의 차이 때문이라 고 사료된다.
전자현미경으로 관찰한 결과 chinchilla의 달팽이핵의 구조는 중추신경 계의 일반적인 형태학적 특성과 거의 유사하였다.달팽이핵은 동심원상의 핵으로 이루워진 커다란 둥근핵으로 핵소체가 특히 발달되어 있으며 자유 리보솜과 과립세포질그물이 풍부하며 미세섬유소체가 세포질에서 자주 관 찰되는데 이는 쥐의 가쪽전정핵(Sotelo와 Palay,1968)과 앞복측달팽이핵 (Gentschev와 Sotelo,1973)의 미세구조를 관찰 보고와 일치 하였다.그러 나 일부 연구자들(Feldman과 Peters,1972)은 세포질에서 미세섬유체를 전혀 관찰 할 수 없다고 보고하였다.이는 미세섬유체의 역할이 아직 명 료하게 밝혀지지 않았기 때문으로 생각된다.최근 달팽이핵의 미세구조에 대한 보고가 많지 않으며 심지어 3가지 신경연접의 형태도 지금까지 알려 진 일반 신경조직의 연접형태와 거의 유사하게 취급하고 있으며 이는 저 자의 실험 결과와 거의 일치하였다.Ibata와 Pappas(1976)는 고양이의 앞 복측달팽이핵에서 연접소포의 크기와 형태에 따라 3가지형태 즉 둥굴고 큰 연접소포(직경 48nm)와 둥굴고 작은 연접소포(직경 37nm)그리고 납 작하고 편평한 연접소포(50x30nm)로 구분하였으며 Tolbert와
Morest(1990)는 고양이와 chinchilla를 이용하여 달팽이핵의 미세구조에서 연접의 형태와 연접부위의 구조에 대해서 지금까지 알려진 신경계통의 연 접구조와 매우 유사하다고 보고하여 이는 저자들의 연구결과와 비슷하였 다.
이상에서 chinchilla 달팽이핵에서 CB-IR세포에 대한 고도의 특이성을 지닌 단세포군항체를 이용한 면역조직화학적 방법을 적용하여 CB-IR세포 의 분포상과 세포의 형태 및 크기 등에 대하여 광학현미경과 전자현미경 을 이용하여 관찰하였다.앞으로 이 방법을 더욱 활용하여 chinchilla이외 의 다른 동물들의 달팽이핵에서 CB-IR세포의 분포상과 세포의 형태 및 크기를 일반 구조를 바탕으로 미세구조를 자세히 비교 분석해야 되리라고 생각되며 또한 칼슘결합단백질인 pavalbumin, S-100, troponin-C, calmodulin,calretinin 등 소위 “EF-hand계”에 대한 자세한 연구를 수행 하여 CB-IR세포와 비교 하여 그 기능을 밝히는 일도 매우 의미가 있으리 라 생각된다.또한 이들 칼슘결합단백질과 GABA와의 공존관계에 대해서 도 자세한 연구가 수행되어야 할 것으로 생각되며 정상동물과 노화된 동 물의 달팽이핵을 비롯한 대뇌 및 소뇌 각 부위에서 칼슘결합단백질의 변 화 양상을 비교 분석하여 노화에 따른 치매 및 청각장애 등 퇴행성신경질 환의 연관성에 대해서 더욱 심도 있는 연구가 수행되어야 되리라 사료된 다.
결
결결 론론론
chinchilla 달팽이핵의 신경표지물질의 하나인 calbindin D-28ka은 칼슘 결합단백질의 일종으로 여러 포유동물의 신경계통에 널리 분포하고 있는 것으로 알려지고 있다.chinchilla달팽이핵에서 CB에 대한 고도의 특이성 을 지닌 단세포군항체를 이용하여 광학 및 전자현미경적 면역화학염색방 법을 이용하여 CB양성세포의 분포상과 세포의 형태 및 크기와 CB세포의 미세구조에 대하여 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1.calbindin D-28ka 양성반응세포는 chinchilla 달팽이핵의 전 분야에서 관찰할 수 있었으나 특히 등쪽달팽이핵에서 더 많이 관찰할 수 있었으 며 CB양성세포의 형태는 방추형,타원형,이극 및 뭇극형이었고 세포 의 크기는 16～30㎛였다.
2.수많은 미토콘도리아와 축삭세포체 연접,미세섬유등을 관찰할 수 있 으며 축삭을 둘러싸고 있는 말이집과 calbindin D-28ka 양성반응세포 의 침착물과 모세혈관을 관찰할 수 있었고 커다란 핵과 축삭의 주변에 작은 슈반핵과 말이집으로 둘러싸인 가로 단면의 수많은 축삭들을 관 찰할 수 있었다.
이상의 결과로 보아 calbindin D-28ka 양성반응세포는 청각기능세포를 보호할 뿐만 아니라 청각기능을 수행하는데 매우 중요한 역할을 하는 것 으로 판단된다.
참참참 고고고 문문문 헌헌헌
AlonsoJR,ArevaloR,Garcia-ojedaE,PorterosA,Brinon JG,Aijon J,"
NADPH-Diaphorase active and calbindin D-28k-immunoreactive neurons and fibers in the olfactory bulb ofthe hedgehog." J Comp Neurol351:307-327,1995.
Brederode JFM, Helliesen MK, Hendrickson AE, "Distribution of the calcium-binding proteins parvalbumin and calbindin-D28k in the sensorimotorcortexoftherat."Neuroscience44:157-171,1991.
CelioMR,"Calbindin D-28k andparvalbumin in theratnervoussystem."
Neuroscience35:375-475,1990.
DeveneciaRK,SmelserCB,LossmanSD,McmullenNT,"Complementary expression ofparvalbumin and calbindin D-28K delineatessubdivisions oftherabbitmedialgeniculatebody."JCompNeurol359:595-612,1995.
FerrerI,Tunon T,SorianoE,delRioA,IraizozI,FonsecaM,Guionnet N,"Calbindinimmunoreactivity innormalhumantemporalneocortex."
BrainRes572:33-41,1992.
Gentschev T,Sortelo C,"Degenerative patterns in the ventralcochlear nucleus of the rat after primary deafferentation.An ultrastructureal study.BrainRes62:37-70,1973.
German DC,Ng MC,Liang CL,Mcmahon A,IacopinoAM,"Calbindin-D 28kinnervecellnuclei."Neuroscience81:735-743,1997.
Ibata Y,Pappas GD,"The fine structure ofsynapsis in relation to the largesphericalneuronsin theanteriorventralcochlearnucleusofthe cat.Jneurocytology5:395-406,1976.
Kashiba H,Ueda Y,Senba E,"Coexpression ofpreprotachykinin-A, α -calcitonin gene-related peptide,somatostatin,and neurotophin receptor family messenger RNAs in rat dorsal root ganglion neurons."
Neuroscience70:179-189,1996.
KubotaY,JonesEG,"Co-localization oftwocalcium binding proteinsin GABA cellsofratpiriform cortex."BrainRes600:339-344,1993.
Kurobe N,Inaguma Y,Shinohara H,Semba R,Inagaki T,Kato K,
"Developmentaland age-dependentchanges of28-kDa calbindin-D in the centralnervous tissue determined with a selective immunoassay method."JNeurochem 58:128-134,1992.
Magnusson A, Dahlfors G, Bomqvist A, "Differential distribution of calcium-binding preteins in the dorsal column nuclei of rats : a combined immunohistochemical and retrograde tract tracing study."
Neuroscience73:497-508,1996.
MikiK,Fukuoka T,Tokunaga A,NoguchiK,"Calcitonin gene-related peptideincreaseintheratspinaldorsalhornanddorsalcolumnnucleus following peripheralnerveinjury:up-regulationinasub-populationof primaryafferentsensoryneuron."Neuronscience82:1243-1252,1997.
Morest DA, Hutson KA, Kwok S, " Cytoarchitectonic altlas of the cochlearnucleus ofthe chinchilla,chinchilla laniger." J Comp Neurol 300:230-248,1990.
Nag TC,WadhwaS,"Cabindin and Parvalbumin immunoreactivity in the developingandadulthumanretina."DevBrainRes93:23-32,1996.
Rhodes CH, Morrell JI, Pfaff DW, "Immunohistochemical analysis of magnocellarelementsin rathypothalamus:distribution andnumbersof cellscontaining nerophysin,oxytocin and vasopressin."JComp Neurol 198:45-64,1981.
Schmidt-KastnerR,MellerD,EyselUT,"Immunohistochemicalchanges ofneuronalcalcium-binding proteinsparvalbumin and calbindin-D-28K following unilateral deafferentation in the rat visual system." Exp Neurol117:230-246,1992.
Seress L, Gulyas AI, Ferrer I, Tunon T, Soriano E, Freund TF,
"Distribution, morphological features, and synaptic connections of parvalbumin-andcalbindinD28k-immunoreactiveneuronsinthehuman
hippocampalformation."JCompNeurons337:208-230,1993.
SoteloC,PalaySL,"Thefinestructureofthelatralvestibularnucleusin theratI.neuronsandneuroglialcells." JCellBiology36:151-179,1968.
Tortosa A,Ferrer I,"Poor correlation between delayed neuronaldeath induced by transient forebrain ischemia, and immunoreactivity for parvalbumin an dcalbindin D-28k in developing gerbilhippocampus."
ActaNeuropathol88:67-74,1994.
TunonT,InsaustiR,FerrerI,SobrevielaT,SorianoE,"Parvalbuminand calbindin D-28k in the human entorhinal cortex. An immunohistochemicalstudy."BrainRes589:24-32,1992.
Villa A,PodiniP,PanzeriMC,RacchettiG,MeldolesiJ:CytosolicCa2+
binding protein during ratbrain aging:lossofcalbindin and calretinin in thehippocampus,with nochangein thecerebellum.EurJNeurosci 6:1491-1499,1994.
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Fig.1.A 30㎛ transversesection oftheDCN andVCN immunostained for Calbindin D-28ka immunoreactive neurons in the cochlear nucleus of chinchilla.Right:X 200(R),Middle:X 50(M),Left:X 100(L).
Fig.2.Theschematicofthecochlearnucleus(rightandleft).
Continuous lines indicate major division, dashed line indicate subdivision,dotted lines indicate parts or sectors of subdivisions.
CalbindinD-28kaimmunoreactiveneurons.
I.Dorsalcochlearnucleus(DCN)
1.Molecularlayer(ML) 2.Fusiform celllayer(FCL) 3.Polymorphiclayer(PL)
II.Ventralcochlearnucleus(VCN)
1.Posteriorpart(P) 2.Ventralpart(V) 3.Centralpart(C) 4.Dorsalpart(D) 5.Lateralpart(L) 6.Anteriorpart(A) 7.Anterodorsalpart(AD)
8.Nucleusofintermediateacoustictria(IAS) 9.Dorsalacousticstria(DAS)
III.Granularregion(GR)
1.Plexiform layer(PX)2.Granulecelllayer(E)3.Smallcellcap(S) 4.Taeniachoroidea(TC)5.Restiform body(RS)
FIg.3.A 30㎛ transverse section ofthe superior olivary nucleus of the chinchilla immunostained for calbindin D-28ka.Left: X 100, Right:X 200.
Fig.4.Electronmicrographofthecochlearnucleus.
Note conspicuous cytoplasmic density resulting from intracytoplsmic organelles. T1, Large, spherical vesicles, asymmetric. Originated from cochlear nerve root; T2, Small spherical vesicles; T3, Phleomorphic vesicles; A, Myelinated axon;D,Dendrite;M,Mitochondria;S,Somata;U,Unmyelinated axon.X 10,000.Barindicates1㎛.
Fig.5.Electron micrograph ofthe cochlearnucleus.Notethe positive immunoreactive calbindin D-28ka particle(CP) and non labled immunoreactive calbindin D-28ka particle(NCP).G,Golgicomplex;
M,Mitochondria;S,Somatosomatic ynapse.X 10,000.Barindicates 1㎛.
Fig. 6. Electron micrograph of the cochlear nucleus. A, Typical myelinated axon; N,Nucleus; C,Capillary vessel.X 26,000.Bar indicates1㎛.
Fig.7.Electron micrograph ofthe DCN immunostained with antibody to calbindin D-28ka. Arrow, Neurofilament; N, Nucleus; S, Schwanncells.X 26,000.Barindicates1㎛.
Fig.8.Electron micrograph ofthemyelinatedaxonalprocess(A)ofthe VCN immunostained with antibody to calbindin D-28ka.X 26,000.
Barindicates1㎛.
저 저 저작 작 작물 물 물 이 이 이용 용 용 허 허 허락 락 락서 서 서
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논문제 목
한 한
한글글글 :::CCChhhiiinnnccchhhiiillllllaaa 달달달팽팽팽이이이핵핵핵에에에서서서 CCCaaalllbbbiiinnndddiiinnn DDD---222888kkkaaa 면면면역역역반반반응응응세세세포포포 의의의 미미미세세세구구구조조조에에에 관관관한한한 연연연구구구
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영문문문:::UUUllltttrrraaassstttrrruuuccctttuuurrraaalll LLLooocccaaallliiizzzaaatttiiiooonnn ooofff ttthhheee IIImmmmmmuuunnnooorrreeeaaaccctttiiivvveee CCCaaalllbbbiiinnndddiiinnn D
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동의여부 :동의(O ) 반대( ) 2007 년 8월
저작자: 문 영 민 (인)
