Characterization of Variable Region Structures and Antigen-Binding Properties of OxLDL-Specific Human Monoclonal Antibody Isolated from PBMC and Atherotic Plaques of Atherosclerosis Patients

Ⅰ

Ⅰ

Ⅰ

Ⅰ.... 서

서

서 론

서

론

론

론

동맥경화증(atherosclerosis)은 우리나라를 포함한 선진국에서 현재 사망원인

1위를 차지하고 있는 질병인 심혈관질환의 주된 발병 원인이며, 그 발병빈도가

지속적으로 증가하고 있는 실정이다. 동맥경화증 발생에는 고지혈증, 고혈압, 비

만, 당뇨병 등이 위험 인자이고 산화된 저밀도 지질단백질 (oxLDL: oxidized low

density lipoprotein)이 손상된 내피로 이전하여 경화반 (plaque)이 형성되어 혈전

증, plaque rupture 등의 과정에 의해 임상적인 증세가 나타나는 것으로 알려져

있다 (Steinberg 등, 1999). 경화반의 형성 및 파열 등이 진행되는 병변 부위에서

관찰되는 여러 현상이 염증반응과 매우 유사함이 밝혀져 있다 (Libby 등, 1999;

Ross R, 1999). 예를 들어, 병변부위에 단핵구/대식세포, T 세포, B 세포 등이 침

윤되어 있음이 관찰되며, 이들 T 세포 및 대식세포에서는 주로 TH-1 반응에 관

여하는 IFN-γ 및 IL-12가 발현됨이 확인되었다 (Hansson GK, 1997). 또한 이

부위의 혈관 내피세포에서는 MHC Class II, CD40, CD40L, CD1 등의 항원제공

관련 부착분자들이 발견 된다 (Mach 등, 1997; Melian 등, 1999). 따라서, 이러한

염증을 유발하고 지속시키는 면역반응이 동맥경화 유발과 진행에 중요하다는 것

은 이미 인식되어 왔다. 이러한 염증을 유발하고 지속시키는 면역반응이 어떠한

항원에 대한 반응인가를 확인하기 위한 많은 연구가 수행되었으며, 중요한 항원

으로 제시된 항원중의 하나가 산화 저밀도 지질단백질이다. 이들의 역할로서는

단핵구의

활성화에

의한

chemoattractant,

M-CSF

(macrophage

colony-stimulating factor) 의 분비촉진 및 동맥 혈관 벽에의 부착 촉진 등에 의

한 염증반응의 활성화가 일차적으로 제기되고 있다 (Berliner 등, 1990; Cushing

SD 등, 1990; Rajavashisth 등, 1990). 또한 산화 저밀도 지질단백질은 scavenger

수용체를 통하여 대식세포에 들어가서 foam 세포의 형성을 유도하며, 이러한

foam 세포는 동맥경화반의 주요 구성인자 중의 하나임이 밝혀졌다 (Shih 등,

2000). 생쥐의 동맥경화 모델에서 CD40과 CD40 Ligand의 결합을 방해하면 동맥

경화의 진행이 억제됨이 밝혀져, 동맥경화의 진행에 면역세포끼리의 상호인지 및

신호전달이 중요한 역할을 함이 밝혀졌다 (Schonbeck 등, 2000). 동맥경화 환자

의 경화반에서 많은 양의 산화 저밀도 지질단백질이 발견되었으며, 실제로 인체

동맥경화 환자의 경화반에서 분리된 CD4

_{T 세포의 10% 정도는 산화 저밀도}

지질단백질에 특이적으로 반응함이 밝혀지기도 하였다 (Stemme 등, 1995). 또한

동맥경화 환자와 그 동물 모델에서 산화 저밀도 지질단백질에 대한 자가항체가

다량 존재함이 밝혀짐으로써 산화 저밀도 지질단백질이 동맥경화 환자에 있어서

주요 자가 항원임이 확고히 밝혀지게 되었다 (Palinski 등, 1989; Yla-Herttuala

등, 1994; Palinski 등, 1995). 그러나 항-산화 저밀도 지질단백질 자가항체의 질

병 진행과정에서의 역할에 대해서는 아직 확실히 밝혀지지 않았다.

또한 동맥경화의 경우, 환자의 혈청에서 산화 저밀도 지질단백질 및 이에 대

한 항체가 발견될 뿐 아니라 동맥 경화반 자체에서도 이러한 항체들이 면역 복

합체의 형태로 발견되며, 심지어는 산화 저밀도 지질단백질에 대한 세포 매개성

면역성도 동물 모델에서 일관성 있게 확인 되었다. 그럼에도 불구하고 환자에서

산화 저밀도 지질단백질에 대한 면역반응이 어떠한 경로를 거쳐서 유발되는지.

그리고 이러한 면역반응이 질병의 진행에 어떠한 결과를 미치는지에 대한 연구

가 거의 수행되어 있지 않다.

단클론 항체 (monoclonal antibody)를 생산하는 방법으로는 전통적으로 사용

되는 EBV (Epstein-barr virus) 변형 또는 하이브리도마 기술이 많이 사용되었

으나, 최근에는 분자적 접근 방법인 phage display (phage display cycle, Fig. 1)

가 많이 사용되고 있다. EBV 변형 또는 하이브리도마 기술을 이용한 인간 단클

론 항체 생산은 항체가 매우 낮은 수준으로 또한 불안정하게 생성되어지는 단점

을 가지고 있다 (Abrams 등, 1986; Nicholas 등, 2000). 이에 비해, phage

display는 클로닝된 항체의 중쇄와 경쇄를 무작위적으로 결합시켜 높은 친화력의

항체를 안정되게 생산할 수 있게 해 준다 (David 등, 1999). 이러한

combinatorial phage 라이브러리에서 얻어진 항체들이 하이브리도마를 통하여 실

제로 체내에 존재하는 B 세포에서 생산한 항체에서와 그 중쇄와 경쇄의 조합이

유용한 방법임이 밝혀졌다 (Farrar 등, 1997).

따라서 동맥경화 환자에서 나타나는 산화 저밀도 지질단백질에 대한 자가항

체를 중심으로 산화 저밀도 지질단백질에 대한 항체반응의 다양성 및 그 생성기

원을 combinatorial phage library를 이용하여 분석함으로써 산화 저밀도 지질단

백질에 대한 면역반응, 특히 항체반응이 질병의 진행에 미치는 영향을 규명하는

데에 필요한 기초 자료를 제공하고자 한다.

본 연구에서는 첫째, 동맥경화증 환자와 정상인의 말초혈액 단핵세포

(PBMC)에서 유래한 combinatorial library로부터 본인 소속 연구실에서 이미 클

로닝 된 항-산화 저밀도 지질단백질 단클론 자가항체 (Fab 단편)의 여러 클론으

로부터 용해성 Fab를 생산하고 순수 분리하여 항원결합 특성을 분석하고 또한

단클론 항체의 일차구조와의 연관성을 알아보고자 한다. 둘째, 동맥경화증 환자

의 경화반에서 유래한 combinatorial library로부터 항-산화 저밀도 지질단백질

단클론 자가항체 (Fab 단편)를 클로닝하여 항체 가변부위의 유전자 구조를 밝히

고, 이들의 유전자 구조를 말초혈액으로부터 분리한 항-산화 저밀도 지질단백질

단클론 자가항체 (Fab 단편)의 가변부위 구조 및 특성과 비교 분석하고자 한다.

이러한 연구는 동맥경화 환자에서 나타나는 자가항체의 생성기전 및 동맥경화증

의 발병기전에 대한 이해증진을 도모시킬 수 있을 것이다.

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lllliiiibbbbrrrraaaarrrryyyy.... Library phage are first incubated with antigen immobilized on a solid

surface. Specific phage bind and non-specific phage are washed away. The

antigen-specific phage are eluted and used to re-infect bacteria for further

rounds of selection and screening for antigen-specific phage.

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론

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연구

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1. 항-산화 저밀도 지질단백질 Fab 클론들의 DNA로 TOP10F'세포를 변형

용해성 Fab를 발현시키기 위해 먼저 이미 본인 소속 연구실에서 클로닝 해

낸바 있는 동맥경화증 환자의 항-산화 저밀도 지질단백질 phage Fab 클론 DNA

를 non-suppressor competent TOP10F' 세포 (Invitrogen Co, new Zealand)에

heat shock 방법으로 변형시켰다. TOP10F' 세포는 phagmid 벡터의 amber stop

codon을 인지하여 phage coat 단백질 pⅢ의 발현을 막는다. 50㎕의 TOP10F'

competent 세포에 DNA 10pg을 섞은 후, 얼음에 30분간 방치한 후, 42℃에서 30

초간 방치한 뒤, 250㎕의 SOC (2% tryptone, 0.5% yeast, 0.05% NaCl, 1% 250

mM KCl, pH 7.0, 사용하기 전에 0.5% 2 M MgCl

, 2% glucose를 넣고 사용)

배지를 넣고 37℃에서 225 rpm의 속도로 1시간 동안 배양하였다. 배양액을

ampicillin (50㎕/㎖)이 들어 있는 LB agar plate (1% tryptone, 0.5% yeast, 1%

NaCl, 1.5% agar)에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다.

2. IPTG 예민성 클론 선별

배양된 콜로니들을 1mM의 IPTG (

Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside,

TAKARA)

가 들어있는 LB agar plate (1% tryptone, 0.5% yeast, 1% NaCl,

1.5% agar)와 들어있지 않은 LB agar plate (1% tryptone, 0.5% yeast, 1%

NaCl, 1.5% agar)에 옮겨서 37℃에서 밤새 배양하였다.

3. 용해성 Fab 발현 및 periplasmic soluble extract의 분리

IPTG가 포함된 LB agar plate에는 자라지 않고 IPTG가 포함되지 않은 LB

agar plate에서는 자란 콜로니 3개를 섞어서 10 ㎖의 carbenicillin (50㎕/㎖)이

들어있는 SB (30 % tryptone, 20 % yeast, 10 % MOPS) 액체배지에 접종하고

37℃에서 225rpm의 속도로 밤새 배양하였다. 배양된 세포를 1ℓ의 carbenicillin

(50㎕/㎖)이 들어있는 SB 액체배지에 225rpm의 속도로 A

이 0.5가 될 때까지

배양한 후, 1M IPTG 1㎖ (1mM)과 1.5M sucrose 16.6㎖ (50mM)을 넣고 25℃에

서 밤새 배양하였다. 배양된 배지를 5000 g로 20분간 원심분리 한 뒤, 상층액을

분리하여 보관하고 침전된 세포는 periplasmic extract를 추출하였다. 추출 방법

으로는 냉각된 10㎖의 TES buffer (0.2M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5mM EDTA,

0.5M sucrose)와 200μM PMSF를 넣은 후, 세포를 재부유 시켰다. 여기에 냉각된

12㎖의 증류수와 4㎖의 TES buffer를 넣고 얼음에서 30분간 방치시키고, 15,000

g에서 20분간 원심 분리하여 상층액만을 분리하여 보관하였다.

4. 용해성 Fab의 정제

실험방법 3에서 얻은 상층액과 periplasmic extract를 Ultrafiltration cell

(Amicon)을 사용하여 약 200㎖로 농축시킨 후, 세척 완충액 500㎖을 넣어 섞은

후 다시 200㎖로 농축하였다. 그런 후, 15,000 g에서 20분간 원심 분리한 다음

0.22 ㎛ 여과지를 이용하여 여과하였다.

그리고 Ni-NTA agarose (QIAGEN Inc. Germany) 4㎖을 column에 넣어서

2㎖로 packing 시킨 후, 세척 완충액 (50mM NaH

PO

(pH 8.0), 300mM NaCl,

20mM imidazole)을 약 20㎖로 씻어 주었고, Fab가 포함된 농축된 시료를 통과시

키고 나서 흘러나온 flow-through를 다시 한번 통과시켰다. 그런 후, elution 완

충액 (50mM NaH

PO

(pH 8.0), 300mM NaCl, 250mM imidazole)을 통과시켜

10㎖씩 2개의 fraction을 받고, centriprep (YM-10, Millipore)을 이용하여 약 1.5

㎖로 농축한 후 PBS 30㎖을 넣고 다시 1㎖로 농축시켰다.

5. SDS-PAGE & Immuno blotting

100℃에서 3분간 가열하였다. Size marker (15-120 kDa, Genepia, Korea)와 정제

된 Fab 용액을 12% SDS gel에서 80 V로 10분간, 100℃에서 1시간～1시간 30분

동안 전기영동 한 뒤 Coomassie blue로 염색하거나 Immuno blot에 사용하였다.

Immuno blot을 시행하기 위해 PVDF membrane (Polyvinylidine Fluoride

membrane, Millipore, USA)에 300㎃로 2시간 동안 전기 이동한 후 PVDF

membrane을 blocking 용액 (5% non-fat dried milk in TBST)에 2시간 동안

blocking 하였다. Blocking이 끝나고 항-인간 IgG (Fab specific)-HRP 항체

(Sigma Chemical Co. USA)를 5배 희석된 blocking 용액에 1:2,000으로 희석하여

2시간 동안 반응 시켰다. 또는 항-HA 항체 (Santacruz)에 1시간동안 반응시킨

후 항-토끼 IgG-HRP (Santacruz)로 다시 1시간동안 반응시킨 다음, ECL

(enhanced chemiluminescence, Amersham Pharmacia Biotech Inc.)을 사용하여

형광반응 시킨 다음 X-ray 필름에 감광하였다.

6. 저밀도 지질단백질 (LDL)의 산화화

MDA (malondialdehyde : Sigma)를 이용하여 저밀도 지질단백질을 산화시켰

다. 0.5M MDA 1 ml과 저밀도 지질단백질 (Fitzerald Industries International

Inc.) 100 ㎍을 37℃에서 3시간 반응시켰다. MDA-LDL (MDA로 산화시킨 LDL)

의 반응 후, 저밀도 지질단백질과 반응하지 않는 MDA를 투석을 통해 제거하였

다.

7. BIAcore 2000을 이용한 친화력 측정

산화 저밀도 지질단백질과 저밀도 지질단백질을 sensor 칩 CM5 (Biacore

AB, Sweden)에 고정화시키기 위해서 amine coupling 방법을 사용하였다. CM5

sensor 칩 표면을 활성화하기 위해 0.4M NHS (N-hydroxysuccinimide)와 0.1M

EDC (1-Ethyl-3-(dimethylamino)-propylcarbodiimide)을 1:1로

(80㎕ : 80㎕)

섞고나서 7분 동안 20 ㎕/min의 속도로 주입하였다. 그리고 나서 ligand를 고정

화하기 위하여 산화 저밀도 지질단백질과 저밀도 지질단백질을 10mM sodium

acetate (pH 4.0)에 희석하여 4500 RU가 될 때까지 주입하여 (20 ㎕/min) 고정화

한 후, 1M ethanolamine을 주입하여 CM5 sensor 칩의 고정화가 되지 않은 부분

을 불활성화 시켰다.

고정화가 이루어진 CM5 sensor 칩에 정제해 낸 Fab를 running 완충액

(HBS (10mM Hepes, 150mM NaCl, pH 7.4))에 1:2 serial dilution하여 5개의 서

로 다른 농도로 30 ㎕/min (association 2분, dissociation 2분) 속도로 흘려주었

다. Ligand에 결합한 Fab를 떼어 내기 위하여 1M NaCl/50mM EDTA를 1:10으

로 희석하여 흘려주었고 그 후, 다른 Fab를 흘려주어 위와 같은 실험을 반복하

였다. 친화력을 나타내는 K

치는 BIAevaluation software를 사용하여 계산하였

다.

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서열

열

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분

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분석

석

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1. 동맥경화 환자 경화반로부터 total RNA 분리

동맥경화증 환자가 아주의료원 흉부외과에서 수술을 받을 동안 제거한 경화

반을 RNA

later

_{(Ambion, Inc., U.S.A)에 넣어 -20℃에 보관하였고, 사용 시에}

RNA

later

_{(Ambion, Inc., U.S.A)를 제거한 뒤, 조직 50㎎당 1㎖의 TRIzol}

Reagent (Invitrogen, new Zealand)를 넣고 조직 파쇄기 (Tissue-Tearor

_,,,,

Biospec Product, Inc., USA)로 조직을 완전히 파쇄 하였다. 여기에 동량의

chloroform을 넣은 후 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액만을 새로운

튜브에 넣었다. 그런 후, isopropyl alcohol을 동량 넣고 12,000 rpm에서 10분간

원심분리 하였다. 상층액을 제거하고, 남아있는 침전물을 70 % ethanol로 세척한

후, 0.1 % DEPC 증류수에 풀어준 후 -20 ℃에 보관하였다.

USA)를 이용하였다. Total RNA 5 ㎍에 Oligo(dT)

과 DEPC 증류수를 넣은

후, 70 ℃에서 10분간 반응시켰다. 여기에 반응 혼합물과 reverse transcriptase를

넣고 42 ℃에서 1시간 반응시켰다. 1시간 후, 대장균 RNase H를 넣은 후, 다시

37 ℃에서 20분간 반응시키고 260 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

3. 인간 Fab 라이브러리 생성

(A) First round of PCR

VH, Vκ, Vλ를 만들기 위해 cDNA 0.5 ㎍과 5′primer (100 p㏖) 0.6 ㎕,

3′primer (100 p㏖) 0.6 ㎕, 10×PCR 완충액 10 ㎕, 2.5mM dNTPs 8 ㎕, 그리고

Taq DNA polymerase (TAKARA. Korea) 0.5 ㎕ (5 u/㎕)를 넣은 후, 전체 양이

100 ㎕가 되게 3차 멸균 증류수로 채우고 PCR (94 ℃ 15초 후, 30 cycle : 94 ℃

15초, 56 ℃ 15초, 72 ℃ 90초 반응 후, 72 ℃ 10분) 을 수행하였다. 각각 알려진

VH, Vκ, Vλ의 5′과 3′primers를 이용하여 12개의 VH, 4개의 Vκ, 9개의 Vλ를

만들었다. 또한 CH1, Cκ, Cλ를 만들기 위해 pComb3X-TT 20 ng을 주형으로 하

여, 5′primer (100 p㏖) 0.6 ㎕, 3′primer (100 p㏖) 0.6 ㎕, 10×PCR 완충액 10

㎕, 2.5 mM dNTPs 8 ㎕, 그리고 Taq DNA polymerase (TAKARA. Korea) 0.5

㎕ (5 u/㎕)를 넣은 후, 전체 양이 100 ㎕가 되게 3차 멸균 증류수로 채우고

PCR (94 ℃ 5분 후, 20 cycle : 94 ℃ 15초, 56 ℃ 15초, 72 ℃ 90초 반응 후, 72

℃ 10분)을 수행하였다. 알려진 CH1, Cκ, Cλ primers를 이용하여 각각 1 tube씩

만든다. 증폭된 VH DNA를 정제하기 위해 PCR 생성물의 ethanol 침전을 수행

하였다. 12개의 VH를 모두 혼합하여 3 M sodium acetate (pH 5.2)를 전체 DNA

시료양의 1/10 양을 혼합한 뒤, 여기에 전체의 2배 양의 100 % ethanol을 혼합하

였다. 이 혼합물을 -20 ℃에서 30분간 침전 시켰다. 그리고 나서 12,000 rpm에서

30분간 원심분리 하였다. 상층액은 모두 제거하고, 남아있는 침전물에 70 %

ethanol을 넣고 12,000 rpm에서 5분간 다시 원심분리 하였다. 역시 상층액을 제

거하고 침전물을 말린 후 TE 완충액 50 ㎕를 재부유 하였다. Vκ, Vλ, CH1, Cκ,

Cλ도 위와 같은 방법을 수행하였다. Ethanol 침전을 통해 얻어진 VH, Vκ, Vλ와

CH1, Cκ, Cλ를 2 % agarose gel에 전기영동을 한 후, 약 400 bp 크기의 band를

잘라낸 뒤, QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc. Germany)를 이용하여

정제하였다. 정제한 DNA를 260 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하고 전기영동을

하여 정제가 잘 되었는지를 확인하였다.

(B) Second round of PCR (overlap extension PCR)

실험방법 (A)에서 만들어진 VH, Vκ, Vλ, CH1, Cκ와 Cλ를 주형으로 사용

하여, Fd, κ/L, λ/L을 만들었다. V 생산물 100 ng과 C 생산물 100 ng, 5′primer

(100 p㏖) 0.6 ㎕, 3′primer (100 p㏖) 0.6㎕, 10×PCR 완충액 10 ㎕, 2.5 mM

dNTPs 8 ㎕, 그리고 Taq DNA polymerase (TAKARA. Korea) 0.5 ㎕ (5 u/㎕)

를 넣은 후, 전체 양이 100 ㎕가 되게 3차 멸균 증류수로 채우고 PCR (94 ℃ 5

분 후, 15 cycle : 94 ℃ 15초, 56 ℃ 15초, 72 ℃ 2분 반응 후, 72 ℃ 10분)을 수

행하였다. 각각의 알려진 Fd, κ/L, λ/L primer를 사용하였다. 증폭된 Fd, κ/L, λ

/L을 정제하기 위해 2 % agarose gel에 전기영동을 한 후, 약 800 bp 크기의

band를 잘라낸 뒤 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc. Germany)를 이

용하여 정제하였다. 정제한 DNA를 260 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하고 전기

영동을 하여 정제가 잘 되었는지를 확인하였다.

(C) Third round of PCR (overlap extension PCR)

실험방법 (B)에서 만들어진 Fd, κ/L, λ/L을 주형으로 하여 H/κ, H/λ Fab

를 만들었다. 중쇄 생성물 100 ng과 경쇄 생성물 100 ng, sense primer (100 p

㏖) 0.6 ㎕, reverse primer (100 p㏖) 0.6 ㎕, 10×PCR 완충액 10 ㎕, 2.5 mM

dNTPs 8 ㎕, Expand HF polymerase mix (3.5 u/㎕, Roche, Germany) 0.75 ㎕

를 넣은 후, 전체 양이 100 ㎕가 되게 3차 멸균 증류수로 채우고 PCR (10 cycle

: 94 ℃ 15초, 56 ℃ 30초, 72 ℃ 3분 반응 후, 72 ℃ 10분)을 수행하였다. 증폭된

Fab DNA를 1 % agarose gel에서 전기영동 시켜 1500 bp의 band를 QIAquick

DNA를 260 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하고 전기영동을 하여 정제가 잘 되었

는지를 확인하였다.

4. Fab/phagemid pComb3X-ss의 ligation

Fab를 phagemid 벡터 pComb3X-ss에 연결하기 위해 Fab 유전자에 제한효

소 처리를 시행하였다. 우선 약 10 ㎍의 Fab DNA와

Sfi I

160U (Roche,

Germany)과 10×buffer M 20 ㎕를 넣고, 총량이 200 ㎕가 되도록 증류수를 넣었

다. 이 두 가지 혼합한 용액을 50 ℃에서 5시간 반응시켰다. 반응이 끝난 Fab와

pComb3X-ss, T4 ligase 10U (GibcoBRL, Life Technologies, USA), 5× T4

ligase 완충액 30 ㎕를 넣어 총량이 150 ㎕가 되도록 3차 멸균 증류수를 넣어주

었다. 혼합한 용액을 25 ℃에서 4시간 동안 ligation하였다.

5. Electroporation을 위한 competent 세포의 준비

대장균 XL1-Blue 세포의 glycerol stock을 LB plate에 도말하였다. 이 배지

에서 자란 집락을 5 ㎖의 SB 배지에 접종한 뒤 37 ℃에서 250 rpm의 속도로 흔

들어 주면서 하루 동안 배양하였다. 배양된 세포의 2.5 ㎖을 250 ㎖의 SB 배지에

섞어주어 같은 방식으로 600 ㎚의 파장에서 흡광도가 0.5～0.7이 될 때까지 배양

하였다. 배양된 플라스크를 15분간 얼음에 방치한 후 4 ℃에서 7000 rpm으로 15

분간 원심분리하여 침전물만을 남기고 상층액은 제거하고, 1 ℓ의 냉각된 멸균

증류수로 재부유 시켰다. 이것을 다시 같은 방식으로 50 ㎖로 세척을 반복하여

원심분리한 후, 마지막으로 10 % glycerol 용액 2 ㎖을 재부유 시킨 후, 100 ㎕

씩 나누어 액체질소에 급속히 냉동시킨 뒤, -70 ℃에 보관하였다.

6. Electroporation

실험방법

4에서

만들어진

phagemid

벡터를

XL1-Blue

대장균주에

electroporation하였다. Ligation 된 Fab/pComb3X-ss 150 ㎕를 5개로 나누어

electroporation하였다. 실험방법 5에서 만들어진 competent 세포 150 ㎕와

Fab/pComb3X-ss 30 ㎕를 혼합한 후, 냉각하여 준비된 0.2 ㎝ 큐벳에 넣은 뒤 1

분간 얼음 위에 둔다. Cell-Porator (Gibco-BRL Inc. USA)를 낮은 voltage (1.5

kV)로 setting하고 준비된 각각의 큐벳의 물기를 제거하고 Cell-Porator에 위치

시킨 뒤 pulse를 가하였다. Pulse 후 즉시 0.5 ㎖의 SOC 배지 (2 % tryptone,

0.5 % yeast, 0.05 % NaCl, 1 % 250 mM KCl, pH 7.0, 사용하기 전에 0.5 % 2

M MgCl

, 2 % glucose를 넣고 사용)를 넣고 마이크로피펫을 이용하여 재부유

시켰다. 이것을 다시 SOC 배지 2.5 ㎖이 준비된 시험관에 옮긴 후, 한 시간 동안

37 ℃에서 250 rpm의 속도로 흔들면서 배양하고 다시 37 ℃로 준비된 SB (30

% tryptone, 20 % yeast, 10 % MOPS) 5 ㎖을 넣어준 뒤, 1 ㎕, 10 ㎕, 100 ㎕

씩 LB plate (1 % tryptone, 0.5 % yeast, 1 % NaCl, 1.5 % agar)에 깔아 고르

게 분포시키고 37 ℃에서 하루 동안 배양하였다. 나머지의 배양액에서 phage 항

체를 생산하였다.

7. Phage 항체 생산과 PEG 침전

실험방법 6에서 준비된 배양액 (10 ㎖)에 carbenicillin (50 ㎎/㎖, Sigma

Chemical Co. USA) 4 ㎕와 tetracycline (20 ㎎/㎖, Sigma Chemical Co.) 100 ㎕

를 넣고 37 ℃에서 250 rpm의 속도로 1시간 동안 배양하였다. 배양된 배지에

carbenicillin (50 ㎎/㎖, Sigma Chemical Co. USA) 6 ㎕ 넣어주고 여기에

VCSM13 (10

_～10

_{pfu) helper phage를 300 ㎕와 SB 90 ㎖을 넣고 다시 37 ℃}

에서 300 rpm에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 후에 kanamycin (50 ㎎/㎖,

Sigma Chemical Co. USA) 100 ㎕ 넣고, 37 ℃에서 300 rpm으로 하룻밤 동안

배양하였다. 다음날 4000 rpm, 4 ℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 새로운

튜브에 담고 여기에 PEG-8000을 4 g (4 %), sodium chloride 3 g (3 %)을 넣고

37 ℃에서 250 rpm으로 5분간 배양하고 난 뒤, 얼음에 30분간 방치시켰다. 4 ℃,

10,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 침전물을 2

㎖의 1 % BSA/TBS에 재부유 시켰다. 이것을 1.5 ㎖ 튜브에 나누어 담고, 다시

용하여 여과한 후, 0.02 % sodium azide를 넣고 4 ℃에 보관하였다. 여기서 모아

진 상층액은 panning에 쓰였다.

8. Panning

산화 저밀도 지질단백질 (20μM BHT, 0.27mM EDTA in PBS)을 100 ㎕씩

ELISA plate (Costar, Coring Inc. NY)의 각각의 well에 넣은 후, 4 ℃에서 하룻

밤 coating 한다. 다음날 5 % BSA/PBS로 4 ℃에서 하룻밤 동안 blocking 한

뒤, 용액을 모두 버리고 PBS로 1회 세척하였다. 여기에 PEG로 침전된 phage 포

함 용액 40 ㎕, 10×PBS 5 ㎕와 10 % BSA 5 ㎕를 잘 혼합하여 각각의 well에

넣고 37 ℃에서 한 시간 반응시켰다. 각각의 well의 용액을 모두 제거하고 0.5 %

PBST로 10분씩 상온에 두었다가 버리는 반복을 6번 하였다. 세척 후, 각 well에

0.1 M glycine/HCl (pH 2.3) 50 ㎕씩 넣고 상온에서 5분간 정치한 후 phage를

elution시키고 elution된 phage를 1 M Tris (pH 8.0)을 15 ㎕ 넣어 용액을 중화

시켰다. 이 과정을 네 번 반복하는데 반복횟수가 늘어날수록 세척횟수도 늘려주

었다. Elution phage efficiency를 보기 위해 배양액을 1 ㎕, 10 ㎕, 100 ㎕를 따

서 LB plate에 도말하였다. Panning을 반복하기 위해 carbenicillin (50 ㎎/㎖)과

tetracycline (5 ㎎/㎖)를 넣고 37 ℃에서 250 rpm의 속도로 2시간 배양하였다.

여기에 VCSM13 helper phage (10

_～10

_{pfu)를 3 ㎖ 추가하고 전체 양을 SB로}

100 ㎖ 맞춘 후 37 ℃에서 300 rpm으로 2시간 배양하였다. 여기에 kanamycin

(50 ㎎/㎖)를 추가하고 같은 속도와 온도로 하룻밤 배양하였다. 다음날 4 ℃,

4000 rpm에서 15분간 원심분리 하고 분리된 상층액을 새로운 튜브에 조심스럽게

옮겼다. PEG-8000 (4 %), sodium chloride (3 %)를 넣고 37 ℃, 250 rpm으로 5

분간 배양한 뒤, 얼음에 30분 동안 방치하였다. 다시 4 ℃에서 10,000 rpm으로

15분간 원심분리 하고 상층액을 제거한 뒤 2 ㎖의 1 % BSA/TBS에 재부유 시

켰다. 이것을 1.5 ㎖ 튜브에 나누어 담고, 다시 4 ℃에서 5분간 14,000 rpm으로

원심분리 하여 상층액을 0.22 ㎛ 여과지를 이용하여 여과하였다. 여과한 것을

0.02 % sodium azide를 넣고 4 ℃에 보관하였다. 위와 같은 방법으로 4번의

panning을 수행하였다.

9. 선별을 위한 phage 발현

1.5 ㎖ 튜브 47개에 SB 1 ㎖, carbenicillin (50 ㎍/㎖), tetracycline (20 ㎍/㎖)

을 넣고 panning이 끝난 후의 out-put phage efficiency를 보기 위해 만든 plate

에서 47개의 콜로니를 각각 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 3～4 liter 플라스크에 모두 담아

37 ℃, 250 rpm의 속도로 6시간 배양시켰다. 여기서 VCSM13 helper phage (10

1

_～10

_{pfu)를 30 ㎕씩 각각의 튜브에 넣고 37 ℃에서 300 rpm의 속도로 2시간}

동안 배양한 후 kanamycin (50 ㎍/㎖)을 넣고 위와 같은 속도와 온도로 하룻밤

동안 배양시켜 Fab를 지닌 phage를 생산하였다. 생산된 phage를 14,000 rpm으로

5분간 원심분리하여 phage를 포함한 상층액을 이용하여 ELISA를 시행하였다.

10. Phage ELISA

산화 저밀도 지질단백질 (20μM BHT, 0.27mM EDTA in PBS)을 100 ㎕씩

ELISA plate의 각각의 well에 넣은 후, 4 ℃에서 하룻밤 coating 하였다. 다음날

PBS로 2회 세척하고 5 % BSA/PBS로 4 ℃에서 하룻밤 동안 blocking 한 뒤,

용액을 모두 버리고 PBS로 1회 세척하였다. 실험방법 9에서 발현된 phage를 포

함한 용액 50 ㎕와 6 % BSA/PBS 50 ㎕를 잘 혼합하여 각각의 well에 넣고 37

℃에서 2시간 동안 반응시키고, 0.5 % PBST로 6회 세척하였다. 세척을 할 때에

는 각각의 회마다 10분간 상온에서 정치하였다. 여기에 blocking 용액으로

1:40,000으로 희석된 100 ㎕의 항-인간 IgG-biotin (Biomeda. USA)을 넣어 37

℃에서 1시간 반응시키고 위와 같은 방법으로 6회 세척한 후 blocking 용액으로

1:40,000으로 희석된 100 ㎕의 avidin-HRP (Sigma Chemical Co. USA)를 넣어

상온에서 1시간 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 6회 세척한 후 각 well에 HRP

의 기질인 TMB (Zymed Laboratories Inc. USA)를 100 ㎕씩 넣어 반응시킨 후,

1 N HCl을 100 ㎕씩 넣어 반응을 정지시킨 후, 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측

11. 항-산화 저밀도 지질단백질 Fab 중쇄 및 경쇄 가변부위의 염기서열화

Phagemid ELISA에서 산화 저밀도 지질단백질 항원에 특이적으로 반응하는

phage Fab를 생산하는 콜로니로부터 SV miniprep kit (Promega Co.)를 이용하

여 DNA를 분리해냈다. 자동 염기서열화 방법을 이용하여 염기서열화 하였다.

VH와 VL의 염기서열화를 위하여 사용한 primers는 다음과 같다.

VH (pelseq) : 5′- ACCTATTGCCTACGGCAGCCG - 3′

VL (ompseq) : 5′- AAGACAGCTATCGCGATTGCAG - 3′

12. 염기서열의 분석

중쇄 및 경쇄의 VH, DH, JH 및 Vκ(Vλ), Jκ(Jλ)의 사용, 유사성 search 등을

Immunoglobulin GenBank Data Base와 V-Base, DNA plot등을 이용하여 확인

하였다.

13. AID (Activation-induced cytidine deaminase) 전사물의 RT-PCR

AID mRNA 전사물을 증폭하기 위하여, 동맥경화증 환자 경화반 cDNA 2㎍,

forward primer AID1P (0.1 pmole/㎕) 2㎕, reverse primer AID2P (0.1 pmole/

㎕) 2㎕, 10×PCR 완충액 2.5㎕, 2.5mM dNTPs 2㎕, Taq DNA polymerase

(TAKARA, Korea) 0.25㎕ (5 unit/㎕)을 넣은 후 전체 양이 25㎕가 되도록 3차

멸균 증류수로 채우고 PCR (94 ℃ 5분 후, 30 cycle : 94 ℃ 1분, 56 ℃ 1분, 72

℃ 2분 반응 후, 72 ℃ 5분) 을 수행하였다. 이렇게 하여 만들어진 첫 번째 PCR

생성물로 두 번째 PCR을 수행하였다. 첫 번째 PCR 생성물 5㎕, inner forward

primer AID3P (0.1 pmole/㎕) 2㎕, inner reverse primer AID4P (0.1 pmole/㎕)

2㎕, 10×PCR 완충액 2.5㎕, 2.5mM dNTPs 2㎕, Taq DNA polymerase

(TAKARA, Korea) 0.25㎕ (5 unit/㎕)를 넣은 후 전체 양이 25㎕가 되도록 3차

멸균 증류수로 채우고 PCR (94 ℃ 5분 후, 30 cycle : 94 ℃ 1분, 60 ℃ 1분, 72

℃ 2분 반응 후, 72 ℃ 5분)을 수행하였다. 만들어진 PCR 생성물을 1.5%

agarose gel에 전기영동하여 band를 확인하였다. AID mRNA 전사물을 발현하기

위하여 사용된 primers는 다음과 같다 (Coker HA 등, 2003).

AID1P - 5'-GAG GCA AGA AGA CAC TCT GG-3'

AID2P - 5'-GTG ACA TTC CTG GAA GTT GC-3'

AID3P - 5'-TAG ACC CTG GCC GCT GCT ACC-3'

Ⅲ

Ⅲ

Ⅲ

Ⅲ.... 결

결

결 과

결

과

과

과

A

A

A

A.... 동

동

동맥

동

맥

맥

맥경

경화

경

경

화

화

화 환

환

환자

환

자

자

자의

의 말

의

의

말

말

말초

초

초

초혈

혈

혈

혈액

액 단

액

액

단

단핵

단

핵

핵

핵세

세

세포

세

포에

포

포

에

에서

에

서

서

서 분

분

분리

분

리한

리

리

한

한 항

한

항

항

항----산

산

산

산화

화 저

화

화

저

저밀

저

밀

밀

밀도

도

도 지

도

지질

지

지

질

질단

질

단

단

단백

백

백

백

질

질

질

질 단

단

단

단클

클

클론

클

론

론

론 항

항

항

항체

체

체

체 F

FF

Faaaabbbb의

의

의

의 특

특

특

특성

성

성 연

성

연

연

연구

구

구

구

1. 순수 분리된 항-산화 저밀도 지질단백질 Fab의 SDS-PAGE & Immuno blot

본인 소속 연구실에서 이미 환자의 말초혈액 단핵세포로부터 클로닝 해낸 바

있는 클론들 (P2-8, P2-114, P2-147, P3-116, P3-132, P3-155, P3-175, P3-190)

(유은선, 2003)을 가지고 non-suppressor 균주인 TOP10F' competent 세포를 변

형시킨 후, SB 액체배지에 용해성 Fab로 발현시켰고, 이것을 Ni-NTA agarose

column을 이용하여 순수 정제해냈다. 정제해 낸 Fab를 12% SDS-PAGE를 이용

하여 denaturing and reducing 조건에서 분리한 후, Coomassie blue staining으

로

약 25～30 kDa의 용해성 Fab band를 확인하였다 (Fig. 2, P2-114 and

P3-175).

또한,

항-인간

IgG

(Fab-specific)-HRP

항체로

탐지한

immuno-blotting에서 denaturing and non-reducing 조건에서는 약 47 kDa,

denaturing and reducing 조건에서는 약 25～30 kDa의 특정한 band를 확인할 수

있었다 (Fig. 3.).

2. SPR을 이용한 항-산화 저밀도 지질단백질 Fab의 친화력 측정

Surface plasmon resonance (SPR) 분석을 통하여 각 항체의 친화력을 측정

하기 위하여 BIAcore 2000을 사용하였다. P2-8, P2-114, P2-147, P3-116,

P3-132, P3-155, P3-175, P3-190의 산화 저밀도 지질단백질과 저밀도 지질단백

질에 대한 친화력을 순수정제 해 낸 Fab 또는 산화 저밀도 지질단백질과 저밀도

지질단백질의 농도를 서로 다르게 하여 측정하였다 (Fig. 4). 클론 P2-8은 산화

저밀도 지질단백질에 대한 친화력이 6.23 × 10

_{으로 저밀도 지질단백질에 대한}

친화력 1.43 × 10

_{보다 약 100배, 클론 P2-114의 경우 산화 저밀도 지질단백질}

에 대한 친화력이 3.64 × 10

_{으로 저밀도 지질단백질에 대한 친화력 2.03 × 10}

보다 약 1000배, 클론 P2-147의 경우 산화 저밀도 지질단백질에 대한 친화력이

3.31 × 10

_{으로 저밀도 지질단백질에 대한 친화력 1.34 × 10}

_{보다 약 100배, 클}

론 P3-116의 경우 산화 저밀도 지질단백질에 대한 친화력이 9.28 × 10

_{으로 저}

밀도 지질단백질에 대한 친화력 1.443 × 10

_{보다 약 100배, 클론 P3-132의 경우}

산화 저밀도 지질단백질에 대한 친화력이 3.98 × 10

_{으로 저밀도 지질단백질에}

대한 친화력 2.96 × 10

_{보다 약 100배, 클론 P3-155의 경우 산화 저밀도 지질단}

백질에 대한 친화력이 1.77 × 10

_{로 저밀도 지질단백질에 대한 친화력 2.59 ×}

10

_{보다 약 100배, 클론 P3-175의 경우 산화 저밀도 지질단백질에 대한 친화력}

이 9.27 × 10

_{로 저밀도 지질단백질에 대한 친화력 1.07 × 10}

_{보다 약 10배, 그}

리고 클론 P3-190은 산화 저밀도 지질단백질에 대한 친화력이 1.98 × 10

_{로 저}

밀도 지질단백질에 대한 친화력 6.87 × 10

_{보다 약 100배 정도 높게 측정되었다}

(Table 1). 가장 높은 친화력을 지닌 P3-175의 VH와 VL의 CDRs 부위에 위치

한 아미노산을 살펴본 결과 양전하의 아미노산 (Lys, Arg, His)이 10개, 음전하

의 아미노산 (Asp, Glu)이 5개로 양전하의 아미노산이 훨씬 많은 반면, 가장 낮

은 친화력을 지닌 P3-155의 VH에는 양전하의 아미노산이 1개, 음전하의 아미노

산이 4개로 음전하의 아미노산이 더욱 많이 존재했다. P3-155의 VL은 중간에

stop codon이 존재하여 일차구조가 분석되지 않은 클론이어서 VH 만으로 분석

하였다. 나머지 클론들은 양전하의 아미노산과 음전하의 아미노산의 분포가 현저

히 다르지 않았다 (Table 1).

c

lo

n

e

P

2

-

1

1

4

c

lo

n

e

P

3

-

1

7

5

H

u

m

a

n

F

a

b

45

70

30

15

20

120

(kDa)

Fab

c

lo

n

e

P

2

-

1

1

4

c

lo

n

e

P

3

-

1

7

5

H

u

m

a

n

F

a

b

45

70

30

15

20

120

(kDa)

45

45

70

70

30

30

15

15

20

20

120

120

(kDa)

Fab

F

FF

Fiiiigggg.... 2222.... S

SD

SS

D

D

DS

SS

S----PPPPA

AG

A

A

G

G

GE

E

E

E ooooffff ppppuuuurrrriiiiffffiiiieeeedddd F

FF

Faaaabbbb.... Purified Fab (clone P2-114 and

P3-175) in the persence of β

-mercaptoethanol was subjected to 12%

SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The protein bands in the gel were

stained with Coommasie brilliant blue G-250. Fab bands with a relative

molecular weight of about 25～30 kDa under the reduced condition were

represented.

clo ne P2 -1 14 45 70 30 15 20 120 (kDa) A. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P2 -1 47 B. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 16 C. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 90 D. 45 70 30 15 20 120 (kDa) _clo ne P3 -1 75 Hu ma n F ab E. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 55 F. clo ne P2 -1 14 45 70 30 15 20 120 (kDa) A. clo ne P2 -1 14 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P2 -1 14 45 70 30 15 20 120 (kDa) A. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P2 -1 47 B. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P2 -1 47 B. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 16 C. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 16 C. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 90 D. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 90 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 90 D. 45 70 30 15 20 120 (kDa) _clo ne P3 -1 75 Hu ma n F ab E. 45 70 30 15 20 120 (kDa) _clo ne P3 -1 75 Hu ma n F ab 45 70 30 15 20 120 (kDa) _clo ne P3 -1 75 Hu ma n F ab E. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 55 F. 45 70 30 15 20 120 (kDa) clo ne P3 -1 55 F.

F

FF

Fiiiigggg.... 3333.... IIIIm

m

m

mm

m

m

muuuunnnnoooo bbbblllloooottttttttiiiinnnngggg aaaannnnaaaallllyyyyssssiiiissss ooooffff ppppuuuurrrriiiiffffiiiieeeedddd F

FF

Faaaabbbbssss oooorrrriiiiggggiiiinnnnaaaatttteeeedddd ffffrrrroooom

m

m

m

PPPPB

B

B

BM

M

MC

M

C

C

C.... Specific bands of Fab with a relative molecular weight of about 47

kDa under the non-reduced condition (A～E) or about 25～30 kDa under the

reduced condition (F) were detected by anti-human IgG (Fab specific)

antibody. Normal human Fab was used as postive control (lane 3 in E).

F

FF

Fiiiigggg.... 4444.... B

B

B

BIIIIA

A

A

Accccoooorrrreeee aaaannnnaaaallllyyyyssssiiiissss ooooffff tttthhhheeee aaaannnnttttiiii----ooooxxxxL

LL

LD

D

D

DL

LL

L F

FF

Faaaabbbb,,,, PPPP2222----111111114444.... OxLDL or LDL

was immobilized on a sensor chip CM5 by amine coupling. The surface

plasmon resonance of the purified Fab at different concentration from 31.25 to

500 nM was detected by BIAcore 2000. The affinity constants were calculated

using the BIAevaluation software.

T

T

T

Taaaabbbblllleeee 1111.... A

A

Affffffffiiiinnnniiiittttyyyy ooooffff aaaannnnttttiiiibbbbooooddddyyyy////aaaannnnttttiiiiggggeeeennnn ccccoooom

A

m

m

mpppplllleeeexxxx ffffoooorrrrm

meeeedddd bbbbyyyy aaaannnnttttiiii----ooooxxxxL

m

m

LL

LD

D

D

DL

LL

L

F

FF

Faaaabbbb oooorrrriiiiggggiiiinnnnaaaatttteeeedddd ffffrrrroooom

m

m

m PPPPB

B

BM

B

M

M

MC

C

C

C....

K

K

K

K

vvvvaaaalllluuuueeee ((((M

M

M

M))))

clone

LDL

OxLDL

a.a (+)charged a.a

(-)charged

a.a (+)charged a.a

(-)charged a.a P2- 8 1.43 × 10-6_{6.23 × 10}-8 4 (K:3 R:1 H:0) 4 (D:2 E:2) 1 (K:0 R:1 H:0) 0 (D:0 E:0) 5 (K:3 R:2 H:0) 4 (D:2 E:2) P2-114 2.03 × 10-5_{3.64 × 10}-8 3 (K:1 R:1 H:1) 3 (D:3 E:0) 1 (K:0 R:1 H:0) 3 (D:2 E:1) 4 (K:1 R:2 H:1) 6 (D:5 E:1) P3-116 1.44 × 10-5_{9.28 × 10}-7 6 (K:1 R:4 H:1) 4 (D:4 E:0) 4 (K:3 R:1 H:0) 4 (D:4 E:0) 10 (K:4 R:5 H:1) 8 (D:8 E:0) P3-132 2.96 × 10-6_{3.98 × 10}-8 2 (K:2 R:0 H:0) 4 ((D:3 E:1) 4 (K:2 R:0 H:2) 3 (D:3 E:0) 6 (K:4 R:0 H:2) 7 (D:6 E:1) P2-147 1.34 × 10-6_{3.31 × 10}-8 3 (K:2 R:0 H:1) 5 (D:4 E:1) 2 (K:1 R:1 H:0) 2 (D:2 E:0) 5 (K:3 R:1 H:1) 7 (D:6 E:1) P3-155 2.59 × 10-4_{1.77 × 10}-6 1 (K:1 R:0 H:0) 4 (D:4 E:0) - -1 (K:1 R:0 H:0) 4 (D:4 E:0) P3-175 1.07 × 10-7_{9.27 × 10}-8 6 (K:2 R:2 H:2) 3 (D:2 E:1) 4 (K:0 R:4 H:0) 2 (D:2 E:0) 10 (K:2 R:6 H:2) 5 (D:4 E:1) P3-190 6.87 × 10-5_{1.98 × 10}-7 2 (K:1 R:1 H:0) 4 (D:2 E:2) 2 (K:1 R:1 H:0) 3 (D:3 E:0) 4 (K:2 R:2 H:0) 7 (D:5 E:2)

The K

value was measured by surface plasmon resonance using BIAcore 2000. The

sequence information was obtained from the degree thesis of Yu, 2003

B

B

B

B.... 동

동맥

동

동

맥

맥경

맥

경

경

경화

화증

화

화

증

증

증 환

환

환

환자

자의

자

자

의

의 동

의

동

동

동맥

맥

맥 경

맥

경화

경

경

화

화

화반

반

반으

반

으로

으

으

로

로부

로

부

부

부터

터 인

터

터

인

인

인간

간

간

간 F

FF

Faaaabbbb 라

라이

라

라

이

이

이브

브

브

브러

러

러

러리

리 제

리

리

제

제작

제

작

작

작,,,, 항

항

항

항----산

산

산

산화

화

화

화 저

저

저밀

저

밀

밀

밀도

도

도 지

도

지질

지

지

질

질

질단

단

단

단백

백

백질

백

질

질

질 F

FF

Faaaabbbb 분

분

분리

분

리

리

리 및

및

및

및 염

염

염기

염

기서

기

기

서

서열

서

열

열

열 분

분

분석

분

석

석

석

1. 동맥경화증 환자 경화반으로부터 RNA 추출

아홉 명의 동맥경화증 환자 경화반, 1, 3, 4, 6, 10, 13, 14, 15, 16으로부터

total RNA를 추출하였다 (Fig. 5). RNA의 추출량이 적은 경우는 2명 혹은 그 이

상의 경화반에서 얻은 total RNA와 합쳐 Fab 라이브러리를 구축하였다. 이때,

혼합한 시료의 번호를 병행 기재하였다 (예, plaque 3과 plaque 4의 혼합시,

plaque 3.4로 표시함).

2. 인간 Fab 라이브러리 구축

Plaque 3.4, plaque 13.14, plaque 15.16의 total RNA로부터 cDNA를 만든 뒤,

12개의 VH, 4개의 Vκ, 9개의 Vλ 인간 Fab primers를 이용하여 가변부위의

DNA를 PCR로 증폭하였다. 또한 알려진 불변부위 primers를 이용하여 불변부위

의 DNA도 PCR로 증폭하였다. 이들의 산물은 약 400bp의 위치에 band를 나타내

었다 (Fig. 6).

400bp의 가변부위와 불변부위의 DNA를 overlap extension PCR을 통하여 중

쇄 Fd (VH/CH1), κ 경쇄 (Vκ/Cκ), λ 경쇄 (Vλ/Cλ)를 만들었다. 이들의 산물은

약 800bp의 위치에 band를 나타내었다 (Fig. 7, A). 800bp의 산물을 주형으로 이

용하여 완전한 길이의 Fab를 두 종류 만들었다. 하나는 Fd/κ 경쇄 Fab이고, 또

하나는 Fd/λ 경쇄 Fab이다. 이들은 약 1500bp의 위치에 band를 나타내었다

(Fig. 7, B).

만들어진 Fab PCR 생성물과 pComb3X-ss phage 벡터를 제한효소

Sfi I

으로

효소분해를 수행하였다. 제한효소로 자른 후 stuffer 조각을 제거해 낸

pComb3X-ss와 Fab PCR 생성물을 ligation하여 인간 Fab 라이브러리를 구축하

였다.

28s

18s

5.8s

28s

18s

5.8s

F

FF

Fiiiigggg.... 5555.... T

T

T

Toooottttaaaallll R

R

RN

R

N

N

NA

A

A

A ooooffff aaaatttthhhheeeerrrroooosssscccclllleeeerrrroooossssiiiissss ppppaaaattttiiiieeeennnntttt''''ssss ppppllllaaaaqqqquuuueeee.... Isolated Total

RNA from the plaque of atherosclerosis patients were subjected to

eletrophoresis on a 2% agarose gel.

V

C

1 Cκ

Vκ

Vλ

V

C

1 Cκ

V

C

1 Cκ

Vκ

Vλ

Vκ

Vλ

F

FF

Fiiiigggg.... 6666.... E

E

E

Elllleeeeccccttttrrrroooopppphhhhoooorrrreeeessssiiiissss ooooffff V

V

VH

V

H

H,,,, V

H

V

V

VL

LL

L,,,, C

C

CH

C

H

H

H,,,, C

C

CL

C

LL

L oooonnnn aaaaggggaaaarrrroooosssseeee ggggeeeellll.... mRNA was

isolated from plaque of artherosclerosis patients and used for synthesis of

cDNA. Using known human Fab primers, antibody variable regions and

constant regions were amplified by PCR. (A) Variable regions of heavy chain

and

constant region of heavy chain and kappa light chain were amplified.

(B) Variable regions of kappa light chains and lamda light chains were

amplified. Expected size is 400bp.

700bp 600bp 500bp 800bp

Fd κ/L λ/L

A.

A.

A.

A.

3Kb

2Kb

1.5Kb

H/κ H/λ

B.

B.

B.

B.

Fd κ/L λ/L

A.

A.

A.

A.

3Kb

2Kb

1.5Kb

H/κ H/λ

B.

B.

B.

B.

Fd κ/L λ/L

Fd κ/L λ/L

A.

A.

A.

A.

3Kb

2Kb

1.5Kb

H/κ H/λ

3Kb

3Kb

2Kb

2Kb

1.5Kb

1.5Kb

H/κ H/λ

B.

B.

B.

B.

F

FF

Fiiiigggg.... 7777.... A

Asssssssseeeem

A

A

m

m

mbbbblllleeeedddd F

FF

Faaaabbbb D

DN

D

D

N

N

NA

A

A.... A. Second round of PCR (overlap extension

A

PCR). Fd, κ/L and λ/L amplified using human Fab primer by PCR. Expected

size is 800bp. B. Third round of PCR (second overlap extension PCR). The

products of heavy- and light-chain PCR were overlapped by second round of

PCR with human Fab primers. Two Fab libraries (H/κ Fab, H/λ Fab library)

products. Expected size is 1500bp.

3. XL1-Blue 세포 변형

Ligation된 재조합 Fab DNA를 가지고 XL1-Blue competent 세포를

electroporation으로 변형시켰다. 변형된 대장균 세포를 LB agar plate에 배양하

였다.

4. Panning ELISA

Electroporation을 한 후에 모아진 세포들을 이용하여 산화 저밀도 지질단백

질에 특이적으로 반응하는 phage Fab의 상층액을 모았다. 4번의 panning을 시행

한 결과 처음의 panning 때에 비하여 efficiency의 증가하는 것으로 나타났다.

(Table 2). Panning 하기전의 Fab 라이브러리, unpanning 으로부터와 각 round

의 panning 후의 phage pool을 가지고 항원에 대한 phage의 결합력을 ELISA로

측정한 결과, 4번의 panning 후에 산화 저밀도 지질단백질에 가장 강한 결합력을

가진 phage pool을 얻었다 (Fig. 8).

5. 산화 저밀도 지질단백질에 대한 phage ELISA

4번의 panning으로 얻어진 콜로니들에서 산화 저밀도 지질단백질에 특이적

인 phage Fab를 발현하는 클론을 선별하기 위한 ELISA를 수행하였다 (Fig. 9).

Plaque 3.4, plaque 13.14, plaque 15.16에서 여러 클론들이 산화 저밀도 지질단백

질에 결합력을 나타내는 것으로 보였고, 이들 중 결합력이 높은 클론들에서

DNA를 추출하여 DNA를

Sfi I

분해해 본 결과 모두 1500 bp의 삽입물이 들어

있는 것으로 확인 되었다 (Fig. 10).

6. 선별된 Fab의 염기서열 분석

동맥경화 환자의 경화반에 존재하는 산화 저밀도 지질단백질과 특이적으로

결합하는 phage Fab 클론들을 얻었다. 이 중 plaque 13.14-58, -62, -68, -77,

-78, -87등 5개 클론의 VH와 VL은 모두 염기서열이 일치하는 것으로 나타났으

며, 또한, 환자 말초혈액 단핵세포에서 분리된 P2-114의 VH와 VL (유은선,

2003)과 동일한 염기서열을 가진다. 6개의 클론들 중 plaque 13.14-58의 서열을

대표적으로 Fig. 11, 12에 나타내었다. 서로 다른 염기 서열을 가진 phage Fab

클론들을 총 20개 (plaque 3.4-7, -15, -26, -30, -39, -46, -112, -128, -136,

-145, -146, plaque 15.16-13, -20, -45, -46, -109, -112, -143, -144, -146) 얻었

으며 이들을 Fig. 13에서 Fig. 50에 걸쳐 나타내었다. 아미노산 서열을 Fig. 51과

Fig. 52에 나타내었으며, 가장 높은 유사성을 갖는 germline 유전자 염기서열과

alignment하였다. 이 클론들의 유전자의 특성 분석 결과는 (Table 3, 4) 다음과

같다. 첫째, 21개 중 14개의 클론들(plaque 3.4-7, -15, -30, -46, -112, -128,

-145, -146, plaque 15.16-13, -45, -46, -112, -144, -146)이 VH3 유전자 family

를 사용하였고, 5개의 클론들(plaque 13.14-58, plaque 3.4-39, plaque 15.16-20,

-109, -143)은 VH1 유전자 family를, 나머지 2개의 클론들(plaque 3.4-26, plaque

3.4-136)은 각각 VH2와 VH4 유전자 family를 사용하였다. 그리고 D 유전자

segment는 DH5-5, DH2-8, DH1-26, DH3-9, DH4-4, DH6-13, DH6-25,

DH4-23, DH2-15, DH3-22, DH3-10등으로 다양하게 쓰였고, J 유전자 segment

는 JH4가 가장 많이 사용되었고 JH5, JH1, JH3는 고루 사용되었다. VL은 21개

중 11개의 클론들 (plaque 3.4-7, -26, -39, -46, -112, -136, plque 15.16-20, -45,

-109, -143, -146)이 Vκ1 유전자를 사용하였고, 4개의 클론들(plaque 3.4-15,

plaque 15.16-13, -46, -112)이 Vκ3 유전자를, 4개의 클론들(plaque 13.14-58,

plaque 3.4-30, -128, plaque 15.16-144)이 VL1 유전자를, 2개의 클론들이 (plaque

plaque 3.4-145, -146)이 VL2 유전자를 사용하였다, J 유전자 segment는 Jκ1을

많이 사용하고 있었고, Jκ3, Jκ4, JL3는 고루 사용되었다. 그러므로, 산화 저밀도

지질단백질에 대한 자가 항체는 VH3 유전자 family와 JH4 유전자 segment를

많이 사용하며, VH1 유전자 family도 함께 자주 쓰이는 것으로 나타났다. DH

segment는 명백한 경향이 없이 다양하게 사용되는 것으로 나타났다. VL의 경우

는 Vκ1 유전자를 주로 많이 사용하고 Vκ3 유전자, VL1 유전자, VL2 유전자도

고루 사용되었으며, JL 유전자 segment는 다양하게 사용되는 것으로 나타났다.

의 유전자를 germline 염기서열 중 가장 높은 유사성을 가진 염기서열과 비교하

였을 때 VH에 있어서는 84～98 %의 유사성과 VL에 있어서는 86～98 %의 유사

성을 보임으로써 모두 심한 돌연변이 양상을 보였다 (Table 3). CDRs과 FRs 모

두에서 돌연변이가 높은 비율로 일어났는데, antigen-driven 선별 및 친화력 성

숙의 지표가 되는 replacement 돌연변이/silence 돌연변이 (R/S) 비율을 분석한

결과, 거의 모든 염기서열의의 VH와 VL에서 CDR 부위의 R/S 비율이 FR 부위

의 비율에 비하여 높게 나타났으며, CDRs에서의 R/S 비율수치가 무작위 돌연변

이인지 혹은 돌연변이가 selective pressure 하에 있었는지를 구별할 수 있는 수

치인 2.9를 훨씬 초과한 클론이 많았다. 이 CDR3-VH의 길이 분석과 R/S 비율

분석 결과는 항-산화 저밀도 지질단백질 자가항체 생산을 하는 B 세포를 선별하

는 과정에서 다양한 B세포 클론들이 antigen-driven 과정을 거쳤을 가능성을 시

사한다. 또한 이중 많은수의 클론들의 염기서열이 본인 소속 그룹에서 말초혈액

단핵세포로부터 분리해낸 항-산화 저밀도 지질단백질 자가항체의 염기서열 (유

은선, 2003)과 상당히 높은 유사성을 보였다; plaque 3.4-7의 VH는 P3-116와

72%의 유사성을 가지고 있었고, plaque 15.16-109의 VH는 P3-175와 99%,

plaque 3.4-128의 VL은 P2-114와 99%, plaque 15.16-13의 VL과 plaque

15.16-112의 VL은 P2-32와 각각 95%와 96%, plaque 15.16-46의 VL은 H2-38과

96%, plaque 15.16-144의 VL은 P2-147과 92%, plaque 15.16-146의 VH는

P3-132와 99%의 유사성을 가지고 있었다. 또한, plaque 3.4-112, -136, plaque

15.16-20, -45, -109, -143, -146의 VL과 plaque 15.16-46의 VH의 염기서열이 본

인 소속 그룹에서 분리해낸 바 있는 cardiolipin에 대한 자가항체인 P6-CL-25

(강은영, 2004)와 66～99%의 유사성을 가지고 있었고, plaque 3.4-30의 VH는 항

-DNA 항체 WRI 176 beta (Blancon F, 1994)와 97%의 유사성를 가지고 있었다.

아미노산의 서열특징을 비교한 결과 환자의 혈액에서 분리한 자가항체와 비슷하

게 CDR1, CDR2 혹은 CDR3 근접 부위에 수소결합 공여자 (donor) 혹은 수여자

(acceptor)의 역할을 할수 있는 아미노산인 Asn, Gln, Thr, Tyr, Ser 돌연변이가

많이 나타났다. 또한 돌연변이가 일어난 후의 아미노산과 돌연변이가 일어나지

않은 아미노산 모두에서 양전하를 띤 아미노산 (Arg, Lys, His)이 많이 분포하는

것으로 나타났다.

7. AID (Activation-induced cytidine deaminase) mRNA 전사물의 RT-PCR

아홉 명의 동맥경화증 환자 경화반 시료를 단독 혹은 혼합한 6개 total RNA

로부터 cDNA를 만든 뒤, 알려져 있는 AID primers (Coker HA 등, 2003)를 이

용하여 AID mRNA 전사물의 발현 유무를 RT-PCR로 확인하였다. 6개의 시료

모두 AID 유전자 크기인 335 bp위치에 특정한 band를 확인할 수 있었다 (Fig.

53).

T

T

T

Taaaabbbblllleeee 2222.... O

O

Ouuuutttt----ppppuuuutttt eeeeffffffffiiiicccciiiieeeennnnccccyyyy aaaafffftttteeeerrrr eeeeaaaacccchhhh rrrroooouuuunnnndddd ooooffff ppppaaaannnnnnnniiiinnnngggg....

O

panning round

H/κ

1st panning

1.6 × 10

_/3㎖

2nd panning

2.7 × 10

_/3㎖

3rd panning

2.25 × 10

_/3㎖

P laque 1 3 .1 4 panning ELIS A

P laque 1 3 .1 4 panning ELIS A

P laque 1 3 .1 4 panning ELIS A

P laque 1 3 .1 4 panning ELIS A

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 no phage

unpan 1s t pan 2nd pan 3rd pan 4th pan

4

5

0

n

m

F

FF

Fiiiigggg.... 8888.... PPPPaaaannnnnnnniiiinnnngggg E

E

E

EL

LL

LIIIIS

SS

SA

A

A

A.... Increase of phage specific for oxLDL antigens

after each round of panning. ELISA plate was coated with oxLDL or

BSA, and amplified phage supernatant after each round of panning were

added into each well.

P la q u e 13.14 p h a g e E L IS A P la q u e 13.14 p h a g e E L IS A P la q u e 13.14 p h a g e E L IS A P la q u e 13.14 p h a g e E L IS A 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 hum an F ab c l o n e n u mb e r c l o n e n u mb e rc l o n e n u mb e r c l o n e n u mb e r 4 5 0 n m 4 5 0 n m 4 5 0 n m 4 5 0 n m No phag e su p P la q u e 13.14 p h a g e E L IS A P la q u e 13.14 p h a g e E L IS A P la q u e 13.14 p h a g e E L IS A P la q u e 13.14 p h a g e E L IS A 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 hum an F ab c l o n e n u mb e r c l o n e n u mb e rc l o n e n u mb e r c l o n e n u mb e r 4 5 0 n m 4 5 0 n m 4 5 0 n m 4 5 0 n m No phag e su p

F

FF

Fiiiigggg.... 9999.... PPPPhhhhaaaaggggeeee E

E

E

EL

LL

LIIIIS

SS

SA

A ffffoooorrrr ooooxxxxL

A

A

LL

LD

D

D

DL

LL

L F

FF

Faaaabbbb lllliiiibbbbrrrraaaarrrryyyy ooooffff ppppaaaattttiiiieeeennnnttttssss.... Phage clones

obtained after panning. Anti-hunam IgG antibody conjugated with HRP and

avidin conjugated with HRP and TMB were used as a secondary antibody

and a substrate, respectively. Absorbance at 450nm was measured by ELISA

reader.

4kb

3kb

2kb

1.5kb

vector

insert

4kb

3kb

2kb

1.5kb

vector

insert

1

2

3

4

5

6

7

F

FF

Fiiiigggg.... 11110000....

SSSSffffiiii IIII

ddddiiiiggggeeeessssttttiiiioooonnnn aaaannnnaaaallllyyyyssssiiiissss ooooffff cccclllloooonnnneeeessss ffffrrrroooom

m

m

m ppppllllaaaaqqqquuuueeee 11113333....11114444....

Sfi I

digestion products were subjected to elecrophoresis on a 1% agarose gel.

Lane 1, 1-kb DNA ladder marker; lane 2, clone 58; lane 3, clone 62; lane 4,

clone 68; lane lane 5, clone 77; lane 6, clone 78; lane 7, clone 87.

E EE

E V Q L V EEEE S G A E V K K P G A S

plaque 13.14-58 GAGGAGGAGGAG GTG CAG CTG GTG GAGGAGGAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC TCAGAG VH1-2 C-- C--

---CDR1 V EEEE V S C K A S G Y T F T G Y Y M plaque 13.14-58 GTG GAGGAGGAGGAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACC GGC TAC TAT ATG

VH1-2 A--

---H W V R Q A P G Q G L E W M G W I

plaque 13.14-58 CAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATC VH1-2

---CDR2

N P N S G G T N Y A Q K F Q G R V

plaque 13.14-58 AAC CCT AAC AGT GGT GGC ACA AAC TAT GCA CAG AAG TTT CAG GGC AGG GTC VH1-2

---T M T R D T S I S T A Y M E L S R

plaque 13.14-58 ACC ATG ACC AGG GAC ACG TCC ATC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGG VH1-2

---L R S D D T A V Y Y C A SSSS W D T A plaque 13.14-58 CTG AGA TCT GAC GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGCAGCAGCAGCTGG GAT ACA GCT

VH1-2 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --A GA CDR3

M D R F D Y W G Q G T L V T V S S

plaque 13.14-58 ATG GAC AGG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA VH1-2

F

FF

Fiiiigggg.... 11111111.... C

C

C

Coooom

m

m

mppppaaaarrrriiiissssoooonnnn ooooffff V

V

V

VH

H

H sssseeeeqqqquuuueeeennnncccceeee ooooffff ppppllllaaaaqqqquuuueeee cccclllloooonnnneeee 11113333....11114444----55558888.... Heavy

H

chain used VH1-2 gene family, DH5-5, JH4 gene segments. Silent mutation

is in italics and replacement mutation is in bold letters

E EE

E LLLL V L T Q P P S A S G T P G Q R

plaque 13.14-58 GAGGAGGAGGAG CTCCTCCTCCTC GTG CTG ACT CAG CCA CCC TCA GCG TCT GGG ACC CCC GGG CAG AGG VL1-44 C-- TCT

---CDR1

V T I S C S G S S S SSSS I G S N T V plaque 13.14-58 GTC ACC ATC TCT TGT TCT GGA AGC AGC TCC AGCAGCAGCAGC ATC GGA AGT AAT ACT GTA

VL1-44 -A-

---N W Y Q HHHH L P G T A P K L L I Y S plaque 13.14-58 AAC TGG TAC CAG CACCACCACCAC CTC CCA GGA ACG GCC CCC AAA CTC CTC ATC TAT AGT

VL1-44 --G ---CDR2

N N EEEE R P S G V P D R F S G S K S plaque 13.14-58 AAT AAT GAGGAGGAGGAG CGG CCC TCA GGG GTC CCT GAC CGA TTC TCT GGC TCC AAG TCT

VL1-44 C--

---G T S A S L A I S G L Q S E D E A

plaque 13.14-58 GGC ACC TCA GCC TCC CTG GCC ATC AGTGGC CTC CAG TCT GAG GAT GAG GCT VL1-44 --- --- --- --- --- --- --- --- ---G

---CDR3

D Y Y C A SSSS W D D S L N G P V F D plaque 13.14-58 GAT TAT TAC TGT GCA TCATCATCA TGG GAT GAC AGC CTG AAT GGT CCG GTT TTC GACTCA

VL1-44 - - - G - - -

--G G T K L T V L G

plaque 13.14-58 GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT VL1-44

F

FF

Fiiiigggg.... 11112222.... C

C

C

Coooom

m

m

mppppaaaarrrriiiissssoooonnnn ooooffff V

V

V

VL

LL

L sssseeeeqqqquuuueeeennnncccceeee ooooffff ppppllllaaaaqqqquuuueeee cccclllloooonnnneeee 11113333....11114444----55558888.... Light

chain used VL1-44 and JL3 gene segments. Silent mutation is in italics and

replacement mutation is in bold letters.

E V Q L V E S G G DDDD L V Q P G G S plaque 3.4-7 GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GACGACGACGAC TTA GTT CAG CCT GGG GGG TCC

VH3-74 -G- ---CDR1 L R L S C A A S G F T F AAAA RRRR FFFF W M plaque 3.4-7 CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC GCT AGA TTCGCT AGA TTCGCT AGA TTCGCT AGA TTC TGG ATG

VH3-74 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- AG- --C -A-

---H W V R Q A P G K G L V W V S HHHH I plaque 3.4-7 CAC TGG GTC CGC CAA GCT CCA GGG AAG GGG CTG GTG TGG GTC TCA CATCATCATCAT ATT

VH3-74 -G- ---CDR2 T N T N T N T N D G S TTTT T TTTT Y A D S V K G R F plaque 3.4-7 ACT AATACT AATACT AATACT AAT GAT GGG AGT ACCACCACCACC ACA ACCACCACCACC TAC GCG GAC TCC GTG AAGGGT CGA TTC

VH3-74 -A- -G- -G- -G- --C

---T VVVV S R D N A K DDDD T L FFFF L HHHH M KKKK S plaque 3.4-7 ACC GTCGTCGTC TCC AGA GAC AAC GCC AAG GACGTC GACGACGAC ACGCTC TTTTTT CTG CACTTTTTT CACCAC ATG AAGCAC AAGAAGAAG AGT

VH3-74 A-- A-- --G -A- --A --C ---CDR3 L R VVVV E D T A V Y Y C A R L G V G plaque 3.4-7 CTG AGA GTCGTCGTCGTC GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCA AGA CTG GGT GTC GGT

VH3-74 -C-

---L D V W G H G T L V T V S S

plaque 3.4-7 TTG GAC GTC TGG GGC CAC GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA VH3-74

F

FF

Fiiiigggg.... 11113333.... C

C

Coooom

C

m

mppppaaaarrrriiiissssoooonnnn ooooffff V

m

V

V

VH

H

H sssseeeeqqqquuuueeeennnncccceeee ooooffff ppppllllaaaaqqqquuuueeee cccclllloooonnnneeee 3333....4444----7777.... Heavy chain

H

used VH3-74 gene family, DH2-8, JH4 gene segments. Silent mutation is in

italics and replacement mutation is in bold letters

S S L S A S VVVV G D R V T I SSSS C RRRR A plaque 3.4-7 TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTGGTGGTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC AGTGTG AGTAGTAGT TGC CGGCGGCGGCGGGCA

V 1D-33κ --- --- --- --- --- --- --A --- --- --- --- --- --- -C- --- -A- --G CDR1

S Q D I S TTTT Y L N W CCCC Q Q K P G K plaque 3.4-7 AGT CAG GAC ATT AGC ACCACCACCACC TAT TTA AAT TGG TGTTGTTGTTGTCAA CAG AAA CCA GGG AAA

V 1D-33κ -A- -A- --G ---CDR2

A P K L L I Y D GGGG S YYYY L E T G V P plaque 3.4-7 GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAC GAT GGCGGCGGCGGC TCC TATTATTATTAT TTG GAA ACA GGG GTC CCA

V 1D-33κ -CA A--

---S R F S G TTTT G S G T D F T F T I S plaque 3.4-7 TCA AGG TTC AGT GGA ACTACTACT GGA TCT GGG ACA GAT TTT ACT TTC ACC ATC AGCACT

V 1D-33κ -G- ---CDR3

S L Q P E D I A T Y Y C Q Q Y D N

plaque 3.4-7 AGC CTG CAG CCT GAA GAT ATT GCA ACA TAT TAC TGT CAA CAG TAT GAT AAT V 1D-33κ

---L P P T F S P G T K V D I K R

plaque 3.4-7 CTCCCC CCC ACT TTC AGC CCT GGG ACC AAA GTG GAT ATC AAA CGA V 1D-33κ - T

--F

FF

Fiiiigggg.... 11114444.... C

C

Coooom

C

m

mppppaaaarrrriiiissssoooonnnn ooooffff V

m

V

V

VL

LL

L sssseeeeqqqquuuueeeennnncccceeee ooooffff ppppllllaaaaqqqquuuueeee cccclllloooonnnneeee 3333....4444----7777.... Light chain

used Vκ1D-33 and Jκ3 gene segments. Silent mutation is in italics and

replacement mutation is in bold letters.