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이학 석사학위 논문
신경세포의 지질 래프트에 위치하는
UCH-L1
아 주 대 학 교
대 학 원
의생명과학과/
신경과학전공
신경세포의 지질 래프트에 위치하는
UCH-L1
지도교수
박 상 면
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.
2014년
6월
아 주 대 학 교
대 학 원
의생명과학과/
신경과학전공
김진수의 이학 석사학위 논문을 인준함.
아 주 대 학 교
대 학 원
2014년 6월 19일
국문요약
-신경세포의 지질 래프트에 위치하는 UCH-L1(
Ubi
qui
t
i
n
C-t
er
mi
nalHydr
ol
ase-L1)
파킨슨병은 운동신경의 퇴화를 야기하고 흑질 (Substantianigra)에 도파민 신
경세포의 손실과 루이소체 (Lewy's bodies)를 보이는 퇴행성 뇌질환이다.파킨슨병
환자의 증상으로는 평상시의 떨림,수면장애,경련,불안정한 자세,느린 움직임을 보 이고 비정상적인 단백질의 응집,미토콘드리아의 장애,산화 스트레스의 특징을 보인
다.지질 래프트는 콜레스테롤,글라이코스핑고지질,GPI-닻형 단백질이 많이 존재하
는 특화된 세포막 마이크로도메인으로 조절 수용체를 매개하는 신호 전달,세포막 단 백질의 수송,세포외 유출 (Exocytosis)또는 세포내 섭취 (Endocytosis)과정에서 역할
을 한다.강글리오시드 (Ganglioside)와 콜레스테롤의 변화로부터 유도되는 지질 래프
트의 변화는 알쯔하이머병,파킨슨병,헌팅톤병,프라이온병과 같은 많은 퇴행성 뇌질
환에서 나타난다.알쯔하이머병에 주요 역할을 하는 아밀로이드-베타 (Amyloid-β)단
백질,프라이온병의 프라이온 단백질,헌팅톤병의 돌연변이 헌팅틴 단백질들이 지질 래프트에 존재하며 단백질 응집에 중요한 역할을 하는 부위로 알려져 있다.뿐 만 아 니라 파킨슨병과 관련된 단백질인 α-synuclein,LRRK2,PINK1,Parkin,DJ-1단백질 들이 공통적으로 지질 래프트에 존재하는 것이 보고되었으며,지질 래프트에 존재하는 단백질의 기능적 변화 또는 지질 래프트의 변화는 파킨슨병의 공통 발병 메카니즘이
될 수 있을 것이라는 점을 생각해 볼 수 있다.UCH-L1단백질은 223개의 아미노산으
로 구성되어 있고,뇌에 존재하는 전체 Soluble단백질의 1-2%로 신경 세포에 특화
되어 발현하며 가수분해 활성과 리가아제 활성의 기능을 갖는다.UCH-L1 단백질의 활성이 낮아지면 α-synuclein 단백질의 양이 증가하여 독성의 응집체 α-synuclein이
만들어 지고,신경세포의 퇴화를 유발한다고 보고되었다.원형질막에서 신호전달에 중 요 역할을 담당하고 있는 지질 래프트에 위치하는 세포부착복합체와 UCH-L1단백질 이 결합한다는 보고와 파르네실화 반응을 통해 UCH-L1단백질이 원형질막에 위치한 다고 보고되었다.따라서,본 연구에서는 파킨슨병과 연관된 UCH-L1단백질이 지질 래프트에 존재하는지 그리고 어떠한 기전으로 존재하게 되는지를 알아보았다.본 연구 에서 UCH-L1 단백질이 많이 발현 하고 있는 신경 세포에서 차가운 1 % Triton
X-100버퍼를 이용한 Soluble/Insoluble분리 실험과 수크로스 밀도 기울기 원심분리 법을 통해 지질 래프트를 분리 하였고 UCH-L1단백질 또한 지질 래프트에 위치하고 있음을 관찰하였다.세포내 이동과 관련되어 있다고 보고된 전사 후 변형과정인 인산 화 반응,파르네실화 반응,글리코실화 반응,이합체화 반응,세린/트레오닌-인산화 반 응,타이로신-인산화 반응이 지질 래프트로 UCH-L1 단백질의 이동에 관련이 되어 있는지 확인하였다.그 결과,UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 타이로신-인산화 반응이 관련 되어 있다는 것을 관찰하였다.그러나 UCH-L1단백질이 직접적 으로 타이로신-인산화되어 이동하는 것은 아닌 것 같다.타이로신-인산화 반응을 통 해 UCH-L1단백질이 지질 래프트로의 이동은 지질 래프트의 신호전달 변화를 야기 할 수 있을 것이라 추측된다. UCH-L1단백질의 지질 래프트에 존재한다는 점을 본 연구는 다른 파킨슨병 연관단 백질과 더불어 지질 래프트에서의 기능변화가 파킨슨병의 공통된 병리기전이 될 수 있음을 암시할 수 있는 점을 밝힌 것에 의의가 있다고 하겠다.
핵심어:파킨슨병,UCH-L1(Ubiquitin C-terminalHydrolase-L1),지질 래프트, 타이로신-인산화 반응
차
례
국문요약 ···ⅰ 차례 ···ⅲ 그림 차례 ···ⅴ 표 차례 ···ⅶ Ⅰ.서론 ···1 A.파킨슨병 ···1B.UCH-L1(UbiquitinC-terminalHydrolase-L1)···3
C.지질 래프트 ···4 D.실험 목적 ···6 Ⅱ.재료 및 방법(혹은 연구대상 및 방법)···7 A.시약 및 항체 ···7 B.세포배양 및 형질주입 ···7 C.벡터 ···8 D.세제 저항성 막 분리 ···8 E.Westernblot···9 F.공초점 형광 현미경 ···10 G.면역 침강법 ···10 H.통계 분석 ···11 Ⅲ.결과 ···12 A.UCH-L1단백질은 신경세포의 지질 래프트에 존재함 ···12 B.산화 스트레스,혈청,파킨슨병 관련 돌연변이 형태(I93M,S18Y)는
UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영향을 미치지 않음 ···17 C.UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 팔미토일화 반응, 파르네실화 반응,이합체화 반응,글리코실화 반응,세린/트레오닌 인산화 반응의 전사 후 변형과정에 영향을 미치지 않음 ···21 D.타이로신-인산화 반응은 UCH-L1단백질이 지질래프트로 이동하는데 관련됨 ···29 E.UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동할 때 타이로신-인산화 반응이 관련되어 있지만 직접적으로 인산화 되어 영향을 미치지 않음 ···31 Ⅳ.고찰 ···33 Ⅴ.결론 ···39 참고문헌 ···40 ABSTRACT ···49
그림 차례
그림.1.UCH-L1단백질은 세제 저항성 막에 존재함 ···14 그림.2.UCH-L1 단백질과 지질 래프트 마커는 원형질막에서 같은 위치에 존재함 ···15 그림.3.신경세포에서 UCH-L1단백질은 지질 래프트에 존재함 ···16 그림.4.UCH-L1단백질이 지질래프트에 위치하는데 혈청과 산화적 스트레 스는 영향을 미치지 않음 ···19 그림.5.UCH-L1단백질이 지질래프트에 위치하는데 파킨슨병 관련 돌연변 이 (I93M,S18Y)는 영향을 미치지 않음 ···20 그림.6.팔미토일화 반응은 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영 향을 미치지 않음 ···24 그림.7.파르네실화 반응은 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영 향을 미치지 않음 ···25 그림.8.이합체화 반응은 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영향 을 미치지 않음 ···26그림.9.O-글리코실화 반응은 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영향을 미치지 않음 ···27 그림.10.세린-트레오닌 인산화 반응은 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이 동하는데 영향을 미치지 않음 ···28 그림.11.타이로신-인산화 반응은 UCH-L1단백질이 지질래프트로 이동하는 데 관련되어 있음 ···30 그림.12.타이로신-인산화된 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동할 때 직 접적으로 관여하지는 않음 ···32
표 차례
I
.서
론
A.파킨슨병
파킨슨병은 퇴행성 신경질환 중 대표적인 질환으로 운동신경의 퇴화를 야기하 고 흑질 (Substantianigra)에 도파민 신경세포의 손실과 루이소체 (Lewy'sbodies)를
보인다 (Stocchi,2005;Lang 등,1998).흑질의 도파민 신경세포의 손실은 시상하핵
(Subthalamic nucleus)과 담창구 (Globus pallidus)내측부의 흥분을 증가시키고,그로 인해 복외측 시상 (Ventrolateralthalamus)을 과억제한 뒤,최종적으로 피질 (Cortex)
운동 시스템의 활성을 감소시켜 파킨슨병 환자의 특징적인 모습을 보인다.60세 이상의
사람들에게서 약 100명 당 한 사람 꼴로 발병 한다고 보고되었다 (Elbaz등,2003).파
킨슨병 환자의 증상으로는 평상시의 떨림,경련,불안정한 자세,느린 움직임을 보인다 (Wirdefeldt등,2011;Tofarisand Spillantini,2007).현재의 치료는 도파민의 유도체 인 L-DOPA를 복용하는 것인데 소실된 신경세포에서의 도파민 분비를 대체하여 증상 완화 기능회복을 목적으로 하지만 발병원인에 대한 근본적인 치료는 되지 않고 있다. 파킨슨병은 산발적으로 발생되는 파킨슨병 (90%)과 유전적 요인으로 발생되는 파킨슨 병 (10%)을 보인다.현재 발병원인은 유전적 요인이나 특정혈류의 차단,장기간의 특 정약물에 대한 노출 등의 환경적인 요인으로 발병한다고 추정하고 있다.유전적 원인에 의해 발병되는 파킨슨병에 대한 연구를 통해 산발적으로 일어나는 파킨슨병의 원인을 찾고자 하는 연구가 많이 진행 되고 있다 (Dawson 등,2010).한편,여러 연구에서 파
킨슨병은 α-synuclein,parkin,PINK1,LRRK2,DJ-1,UCH-L1등 (표.1)많은 단백질 들이 유전적 요인에 의한 파킨슨병 발병에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있고,현 재까지 연구가 많이 진행 되었지만 정확한 기능은 밝혀지지 않았다.파킨슨병의 병리기 전으로는 미토콘드리아 장애,단백질 응집,산화 스트레스의 특징을 보인다.파킨슨병
환자의 신경세포 내에 단백질이 응집되어 발생하는 루이소체가 보이는데,이 루이소체
를 이루는 주요 단백질이 α-synuclein이라고 보고되었다 (Opazo 등, 2008). α
-synuclein 단백질의 응집체는 독성을 일으켜 신경퇴화를 유도한다고 보고되었다
(Uversky,2007).또한,DJ-1,Parkin,PINK1또는 LRRK2기능이 약화되거나 MPTP, 로테논과 같은 약물로 인해 미토콘드리아 장애가 일어난다.미토콘드리아 기능의 저하 는 활성산소 (ROS)를 야기하게 되고 단백질 수송,ATP생성이 억제된다.야기된 활성 산소는 α-synuclein 단백질과 결합하여 집합체 단백질을 형성하여 리소좀 시스템을 손 상시킨다고 보고되었지만 (Parnetti등,2013)여전히 정확한 병태생리는 잘 모른다. 표 1.유전적 요인으로 발병되는 파킨슨병 관련 단백질 PARK locus Gene Map
Position Clinicalphenotype Protein Function PARK1/4 SNCA 4q21 parkinsonism withcommon
dementia Synapticprotein PARK2 parkin 6q25-q27 early-onset,slowly
progressing parkinsonism Ubiquitin-proteinliagse PARK5 UCH-L1 4p14 Late-onsetparkinsonism HydrolyzesmallC-terminal
adductsofubiquitin
PARK6 PINK1 1p35-p36 early-onset,slowly
progressing parkinsonism MitochondrialKinase
PARK7 DJ-1 1p36 early-onset,slowly
progressing parkinsonism Oxidativestressprotection PARK8 LRRK2 12q12 Late-onsetparkinsonism Multiplefunctionsbyseveral
domain PARK9 ATP13A2 1p36
early-onsetparkinsonism withKufor-Rakeb syndrome
B.Ubi
qui
t
i
n C-t
er
mi
nalhydr
ol
ase-L1(
UCH-L1)
Ubiquitin C-terminalhydrolase-L1(UCH-L1)은 UCH-L1~5를 포함하는 탈유 비퀴틴 (Deubiquitin)효소들 그룹에 속해있는 탈유비퀴틴 효소이다 (Wilkinson 등,
1989,McNaught등,2001).UCH-L1단백질은 223개의 아미노산으로 구성되어 있고,
뇌에 존재하는 전체 Soluble단백질의 1-2%로 신경 세포에 특화되어 발현하며 가수
분해 활성 (Hydrolase activity)과 리가아제 활성 (Ligase activity) 기능을 갖는다
(Liu등,2002).파킨슨병 관련된 발병 돌연변이 형태로는 I93M,S18Y인 두 개의 돌연
변이가 보고되었고 I93M 돌연변이 형태는 파킨슨병의 유발에 관련되어 있다고 보고
되었다 (Setsuie등,1998).반면 S18Y 돌연변이 형태는 파킨슨병 발병에 있어 보호하
는 역할을 하는 서로 상반되는 성질을 갖고 있다고 보고되었다 (Maraganore 등,
1999;Toda등,2003;CarmineBelin등,2007).UCH-L1단백질에서 파르네실화 반응 (Farnesylation),글리코실화 반응 (Glycosylation),산화 작용 (Oxidation),유비퀴틴화 반응 (Ubiquitination),니트로실화 반응 (Nitrosylation),아세틸화 반응 (Acetylation) 등 많은 전사 후 변형과정이 일어난다고 보고되었다 (Cole and Hart,2001;Meray andLansbury,2007;Liu등,2009).파르네실화된 UCH-L1단백질은 소포체막이나 세
포막에 위치하는데 중요한 역할을 한다고 보고되었고 (Liu등,2009),UCH-L1의 산화
작용은 가수분해 활성을 감소시킨다고 보고되었다 (Nishikawa등,2003).UCH-L1단
백질의 단량체 유비퀴틴화 반응은 유비퀴틴을 안정화시키고 조절하는 역할을 한다고 보고 되었고 (Meray and Lansbury,2007),UCH-L1단백질이 글리코실화 반응이 일
어난다는 보고는 있지만 아직 기능은 알려지지 않았다 (Cole and Hart,2001).또한,
UCH-L1 단백질은 많은 신호전달에 관여하는데,NF-κB 신호경로를 통해 UCH-L1 단백질의 활성이 낮아지면 리소좀 시스템으로부터 BACE1단백질의 제거가 억제되어 독성의 아밀로이드-베타를 형성을 증가 시킨다고 보고되었다 (Guqlielmotto등,2012). 그리고,UCH-L1 단백질은 Hsc70 (Heat shock cognate 70),Hsp90 (Heat shock
protein 90)그리고 샤페론 관련 오토파지 (Chaperon-mediatedautophagy)리소좀 수 용체인 LAMP-2A와 결합하여 샤페론 관련 오토파지 신호경로의 구성성분으로 기능
한다고 보고되었다 (Kabuta등,2008).또한,타입2당뇨병에서 UCH-L1단백질의 감
소는 프로테아좀 시스템의 기능장애를 일으키고 이를 통해 아폽토시스 (Apoptosis)를 일으키는 소포체 스트레스를 유발한다고 보고 되었다 (Costes등,2011).마지막으로, UCH-L1단백질로부터 TrkB 신호가 활성되면 PKC 신호를 통해 세포부착과 이동에 관여하고 Akt신호를 통해 세포생존에 관여한다고 보고 되었다 (Poon등,2013).이와 같이,UCH-L1단백질은 리소좀 시스템,오토파지 시스템,프로테아좀 시스템,뉴로트 로핀 시스템 등 많은 신호전달에 관여한다.파킨슨병 관련 보고로는,UCH-L1단백질 의 활성이 낮아지면 α-synuclein 단백질의 양이 증가하여 독성의 응집체 α-synuclein 이 만들어지고,신경세포의 퇴화를 유발한다고 보고되었다 (Cartier등,2012).그리고, UCH-L1 단백질의 I93M 돌연변이를 과발현시키면 흑질에 있는 도파민 신경세포의
퇴화를 야기한다고 보고 되었다 (Setsuie등,2007).
C.지질 래프트
지질 래프트는 콜레스테롤,글라이코스핑고지질,GPI-닻형 단백질이 많이 존재
하는 특화된 세포막 마이크로도메인이다 (Simons and Ikonen,1997; Brown and
London,1998).지질 래프트는 조절 수용제를 매개하는 신호 전달,세포막 단백질의 수
송,세포외 유출과정 또는 세포내 섭취과정에 역할을 한다 (Korade등,2008;Simons
and Ikonen,1997).이전 보고에서,지질 래프트에 위치하는 강글리오시드와 콜레스테
롤의 증가로 인하여 신호전달 장애와 세포죽음을 유도하는 지질 래프트의 변화는 알 쯔하이머병,파킨슨병,헌팅톤병,프라이온병과 같은 많은 퇴행성 뇌질환에서 나타난다 고 보고되었다 (Rushworth 등, 2010; Naslavsky 등, 1997; Valencia 등, 2010;
Schengrund,2010).알쯔하이머병의 경우 위험인자로 알려진 ApoE4가 있는 경우 다른
인자인 ApoE3에 비해 세포막에 지질 래프트의 구성성분인 콜레스테롤이 증가 한다고
보고되었으며,또한 환자의 경우 지질 래프트의 성분으로 알려진 강글리오시드가 정상인 보다 높게 분포되어 독성 아밀로이드-베타의 응집을 촉진 시키고 지질 래프트의 혼란을 야기한다고 보고되었다 (Hayashi등,2002;Igbvboa 등,2005; Molander-Melin 등,
2005).또한,알쯔하이머병의 주원인으로 알려진 아밀로이드-베타가 지질 래프트에서 생 산과 응집이 일어나고 독성을 나타내는 부분 또한 지질 래프트에 위치한다고 보고되었 다 (Matsuzaki등,2010).이와 같은 응집체 현상을 갖는 헌팅톤병에서도 지질 래프트와 의 연관성이 밝혀지고 있다 (Li등,2009).프라이온병의 주원인 단백질인 프라이온 (prion)의 경우 GPI-닻형 단백질로 이 또한 지질 래프트에 위치하고 단백질의 응집이 일어난다고 보고되었다 (TaylorandHooper,2007).또한 파킨슨병의 주원인으로 알려진 α-synuclein단백질이 강글리오시드와 결합하여 지질 래프트에 위치하는데,결합을 통해 지질 래프트의 변화와 α-synuclein 단백질의 기능변화를 야기할 가능성이 높다고 보고 되었다 (Fortin 등,2004).이러한 연구결과가 알려지면서 퇴행성 신경질환 연구에서의 지질 래프트에 대한 관심이 높아지고 있다.알쯔하이머병에 주요 역할을하는 아밀로이 드-베타 단백질,프라이온병의 프라이온 단백질,헌팅톤병의 돌연변이 헌팅틴 단백질 뿐만 아니라 파킨슨병과 관련된 단백질인 α-synuclein (Fortin 등,2004),LRRK2 (Hatano 등,2007),PINK1(Silvestri등,2005),Parkin (Fallon 등,2002),DJ-1(Kim 등,2013)단백질들이 공통적으로 지질 래프트에 관련이 있고 중요 역할을 할 것이라
보고 되었다. Parkin은 시냅스의 지질 래프트에 존재하며 N-메틸-D-아스파테이트
(N-methyl-D-aspartate)수송 (Trafficking)과 관련되어 있다고 알려져 있다 (Kitada등,
1998).LRRK2의 경우 인산화 활성의 변화로 신경독성에 관여하는 G2019S 돌연변이 형
태의 단백질이 지질 래프트에 존재하여 파킨슨병의 원인인 흑질의 퇴화를 가져온다고 추측 하고 있다 (HatanoT 등.,2007).또한,DJ-1은 팔미토일화 반응을 통해 지질 래프
2013).이처럼 파킨슨병과 지질 래프트와의 연관성이 보고되고 있지만 지질 래프트와 파 킨슨병 관련 단백질과의 상호작용에 대하여는 여전히 잘 알려져 있지 않은 실정이다.최 근 보고에서,원형질막에서 신호전달에 중요 역할을 담당하는 지질 래프트에 위치하는 세포 부착 복합체 (Focaladhesioncomplex)와 UCH-L1단백질이 결합한다고 보고되
었기 때문에 (Frisan 등,2012)지질 래프트에 위치하여 신호전달에 관여 할 가능성이 높을 것이다.다른 보고에서는 파르네실화 반응을 통해 UCH-L1단백질이 지질 래프 트가 아닌부분의 원형질막에 위치한 다고 보고되었다 (Liu등,2009).이 같은 지질 래 프트는 세제 저항성 막으로 되어있고 콜레스테롤과 스핑고지질이 부유하게 존재하기 때문에 밀도가 낮다.그래서 지질 래프트를 관찰할 때 1 % tritonX-100을 이용하여 수크로스 밀도 기울기 원심분리법을 통하여 지질 래프트 부분을 나누게 되면 다른 단 백질에 비해 밀도가 낮아 위쪽 부분에 존재하게 되어 지질 래프트 부분을 나눌수 있 다.이전 보고에서,미토콘드리아에 지질 래프트가 존재하지 않음에도 불구하고 미토 콘드리아 단백질이 섞여나온다는 보고가 있기 때문에 (Zheng 등,2009),수크로스 밀 도 기울기 원심분리법을 통해 지질 래프트 분리시에 미토콘드리아에 위치한 단백질이 혼합되어 분리 되는 것을 배제해야 한다.이를 위해,콜레스테롤을 억제하여 지질 래 프트를 혼란시키는 약물인 MβCD,Filipin을 처리하여 지질 래프트에 존재하는 단백 질의 감소를 통해서,미토콘드리아에 존재하는 단백질이 혼합된 것이 아님을 배제하고 지질 래프트에 존재하는 단백질을 명확히 확인 할 수 있다.
D.실험 목적
따라서 본 연구에서는,UCH-L1단백질이 많이 발현하고 있는 신경 세포에서 UCH-L1단백질이 지질 래프트에 위치하는지 확인하고 어떤 전사 후 변형과정을 통 하여 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동 하는지 알아보았다.Ⅱ.재료 및 방법
A.시약 및 항체
Caveolin-1과 Flotillin-1항체는 BD Biosicence(FrankinLakes,NJ,USA)에서 구입했다.UCH-L1항체는 LifeTechnologies(Grand Island,NY,USA)에서 구입했다. CD71 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)에서 구입했다.myc 항체와 2-Bromopalmitate, FTI-277 trifluoroacetate salt, MβCD (metyl-β -Cyclodextrin), Okadaic acid, Sodium orthovanadate, OGT inhibitor (Benzyl 2-acetamido-2-deoxy-α-D-galactopyranoside)는 Sigma-Aldrich(StLouis,MO,USA)
에서 구입했다. P-타이로신 항체는 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입했다.
Thy-1항체는 CellSignalingTechnology(Danvers,MA,USA)에서 구입했다.
B.세포배양 및 형질주입
쥐에서 분리한 대뇌피질의 신경세포는 임신 18일된 SpragueDawley rat의 배
아에서 얻었고 L-glutamine과 B-27supplement가 첨가된 neurobasal배지를 이용하여
배양 하였다.신경세포 배양 1주일 후 3일에 한번 neurobasal배지를 첨가하여 키워
DIV 14일된 신경세포를 사용 하였다.SH-SY5Y 세포,COS7세포 그리고 Hela세포는
10 % 혈청 (Fetalbovine serum)이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)배지를 이용하여 배양 하였다.Hela 세포는 lipofectamine 2000 (Invitrogen,
70~80 % 세포를 배양 후 혈청이 들어 있지 않은 배지를 이용하여 DNA 1ug에 lipofectamine 2000 2ul를 각각 다른 튜브에 넣어 5분간 인큐베이션 하였다.100 mm dish에는 DNA 2ug에 lipofectamine2004ul를 사용 하였다.각각의 튜브를 합쳐 20분
동안 인큐베이션 하여 잘 섞은 후 세포 배양된 60mm dish에 넣어 24시간 동안 형질
주입 하여 발현 시켰다.
C.벡터
pcDNA3.1(+)-UCH-L1-myc·His 벡터는 이화여자대학교 이공주 교수님 연구 실에서 얻었다.UCH-L1돌연변이 벡터 (I93M,S18Y)는 site-directedmutagenesis방 법으로 제작 하였다.모든 벡터들은 DNA 서열분석을 통해 확인하였고,균 내 독소의 오염을 제거하기 위해 Endo-Free plasmid Maxiprep Kit (Qiagen,Valencia,CA,
USA)를 사용하여 얻었다.
D.세제 저항성 막 분리
세포는 PBS로 2번 세척 한 후 1% triton-X100과 단백질 분해효소 억제제가
첨가된 차가운 PBS를 이용해 세포를 긁어 모았다.4℃에서 15분 동안 용해 (Lysis)한
후 4℃에서 13,000RPM으로 15분 동안 원심분리 하였다.상층액은 Soluble부분이고
밑에 침전물은 다시 PBS로 2번 세척 한 후 1x 샘플 버퍼로 녹여 Insoluble부분으로
수크로스 밀도 기울기 원심분리 실험을 위해,세포는 단백질 분해 억제제가 포함된 용 해 (Lysis)버퍼 (25mM MES,pH 6.5,50mM NaCl,1mM Na₃VO₄,1% triton
X-100)를 이용하여 4℃에서 20분 동안 용해 (Lysis)하였다.용해액은 1.5ml을 맞추 고 85% sucrose1.5ml과 섞어 3ml로 맞추었다.원심분리 튜브 밑에 85% 수크로스 와 섞은 용액을 넣고 위에 35% 수크로스 4ml과 5% 수크로스 4ml을 차례대로 넣 었다.11ml의 용해액 (Lysate)는 4℃에서 36,000RPM으로 20시간 원심분리 하여 E-튜브에 각각 1ml씩 천천히 얻어 각 부분을 나누었다.각 부분은 TCA를 이용하여 2시 간 동안 단백질을 침전시킨 후 아세톤을 이용하여 2번 세척 하였다.침전된 단백질은 1x 샘플 버퍼로 녹여 SDS-PAGE와 Western blot실험을 이용하여 수행 하였다.콜레 스테롤을 억제하기 위해,쥐에서 분리한 신경세포와 SH-SY5Y 세포는 37℃에서 1시 간 동안 5mM MβCD를 처리하여 실험 하였다.
E.West
er
n bl
ot
세제 저항성 막분리 실험을 통해 얻은 단백질은 sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로부터 분리 하였다. nitrocellulose (NC)멤브레인으로 단백질을 이동시킨 후 5 % Skim milk를 이용하여 블록킹 하였다.멤브레인은 UCH-L1,CD71,Flot-1,Cav-1,Thy-1,C-myc
,RL-2,p-타이로신 각 1차 항체를 1:1000으로 TBS에 희석하여 한밤동안 반응 하였다.다음날
0.1 % Tween20이 첨가된 TBS로 15분씩 3번 세척한 후 peroxidase-conjugated 2차
항체를 상온에서 1시간동안 반응 하였다.다시 0.1% Tween20이 첨가된 TBS로 15분
F.공초점 형광 현미경
Poly-D-lysine으로 코팅된 커버슬립에 배양된 세포는 PBS로 2번 세척 한 후
상온에서 4% paraformaldehyde로 20분 동안 고정 시켰다.고정된 세포는 PBS로 2번 세척 한 뒤 0.1% triton-X 100이 포함된 PBS로 상온에서 3분 동안 permeabilization 시켰다.PBS로 2번 세척 후 2% BSA가 포함한 PBS로 상온에서 1시간 동안 블록킹 한 후 1차 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 붙였다.다음날 PBS로 5분씩 3번 세척 한 후 2차 항체를 1:200비율로 상온에서 2시간 동안 염색 하여 LSM510공초점 형광 현미경 을 이용하여 관찰 하였다.
G.면역 침강법
Hela세포는 단백질 분해 억제제와 탈인산화 억제제가 포함되어 있는 수정된RIPA 버퍼 (50mM Tris-HCl,pH 7.4,0.25% sodium deoxycholate,300mM NaCl, 1% tritonX-100)로 용해 (Lysis)한 후 4℃ 상태의 궤도 혼합기에서 1시간 동안 아 가로스 비드를 이용하여 무분별하게 아가로스 비드에 붙는 단백질을 제거 하였다.무분 별하게 붙은 단백질을 제거한 용해액은 정량을 한 후 12시간 동안 1차 항체를 붙인 뒤 4 ℃에서 아가로스 비드를 3시간 동안 붙였다.비드를 다운시켜 수정된 RIPA 버퍼로 세척 3번 한 후 2x 샘플 버퍼를 넣어 100 ℃에 10분 동안 끓인 후 SDS-PAGE와 Westernblot실험을 이용하여 수행 하였다.
H.통계 분석
모든 값은 ±SEM 값으로 나타냈다.유의성은 짝이 없는군은 T-test 또는
One-way ANOVA를 사용하여 평가하였다.(Graphpad software,San Diego,CA, USA)
Ⅲ.결과
A.UCH-L1단백질은 신경세포의 지질 래프트에 존재함.
UCH-L1단백질이 파킨슨병과 관련된 다른 단백질과 같이 지질 래프트에 존
재하는지 확인하기 위하여, 쥐에서 분리한 신경세포, Human dopaminergic
Neuroblastoma cellline인 SH-SY5Y 세포 그리고 UCH-L1 단백질을 과발현 시킨 Human cervicalcancercellline인 Hela 세포에서 PBS에 녹인 차가운 1 % Triton X-100을 이용해 세제 저항성 막을 분리 (Zlatkine등,1997)한 후 Western blot실험을
수행하였다 (그림.1A-C).세제 저항성 막 부분이 잘 나누어 졌는지 확인하기 위해 지
질 래프트의 마커인 Thy-1과 Flotillin-1 (Flot-1)을 사용하였다 (Madore 등,1999;
Bickel등,1997).그림 1A에서 보이는 것과 같이,전체 UCH-L1단백질의 15~20%정
도가 차가운 Triton X-100Insoluble부분에서 관찰되었다.그 후,세포막에 존재하는
콜레스테롤을 감소시키는 methylbeta cyclodextrin (MβCD)각 농도별로 1시간 동안
처리하여 Insoluble부분에 존재하는 UCH-L1단백질이 변화가 있는지 확인하였다 (그
림.1D-E).그 결과,Insoluble부분에 존재하는 UCH-L1단백질이 MβCD를 처리 했을
때 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.추가적으로 공초점 형광 현미경을 이용하여 확인 해 본 결과,SH-SY5Y 세포 (그림.2A),monkey kidney fibroblastcellline인 COS7
세포 (그림.2B)그리고 UCH-L1 단백질을 과발현 시킨 Hela 세포 (그림.2C)에서
UCH-L1단백질이 지질 래프트의 마커인 Caveolin-1(Cav-1)또는 Flot-1과 원형질막 에서 같이 위치되는 것을 확인 할 수 있었다.이 결과로,UCH-L1단백질이 지질 래프 트에 존재 할 것이라는 예상을 할 수 있었다.UCH-L1단백질이 지질 래프트에 존재하 는지를 명확히 확인하기 위해서,지질 래프트 부분을 분리 할 수 있는 수크로스 밀도 기울기 원심분리법 (Sucrosedensity gradientcentrifugation fractionation analysis)을
이용하여 실험을 수행 하였다. 쥐에서 분리한 신경세포, SH-SY5Y 세포를 용해 (Lysis)시킨 후 4℃에서 36,000RPM으로 20시간 원심분리 하여 위에서부터 각 1ml 씩 얻어 1-11 부분으로 나누었다.그 후,Western blot실험을 이용하여 확인해본 결 과,UCH-L1 단백질과 지질 래프트 마커인 Flot-1이 지질 래프트 부분에서 확인되는 반면,5mM MβCD를 1시간 동안 처리한 상황에서는 UCH-L1단백질과 Flot-1이 상 당히 감소해 있는 것을 확인 할 수 있었다.이 결과로 인하여,UCH-L1단백질이 지질 래프트에 존재 하는 것을 확인 할 수 있었다.
그림.1.UCH-L1단백질은 세제 저항성 막에 존재함.
(A)쥐에서 분리한 신경세포,(B)SH-SY5Y 세포는 차가운 1% Triton X-100버퍼
로 용해 (lysis) 시킨 후 부분을 나누었다.(C) Hela 세포는 pcDNA3.1(+) 벡터와
UCH-L1-myc-his벡터를 이용해 24시간 동안 형질주입 한 후 과발현 시켜 용해 시켰
다.각각 세포들은 4 ℃를 유지하면서 Soluble과 Insoluble 부분을 나눈 후 Western
blot실험을 이용하여 UCH-L1 단백질을 확인하였다.Thy-1과 Flot-1은 지질 래프트
의 마커로 사용하였다.Transferrin 수용체 (CD71)는 지질 래프트가 아닌 부분의 마커
로 사용 하였다.(D)SH-SY5Y 세포는 5mM MβCD를 1시간 동안 처리,(E)Hela세
포는 UCH-L1단백질을 과발현 한 후 5mM,10mM MβCD를 1시간 동안 처리하여,
각각 세포를 용해 (Lysis)후 부분을 나누었다.각 그래프는 imageJ프로그램을 이용
그림.2.UCH-L1 단백질과 지질 래프트 마커는 원형질막에서 같은 위치에 존재 함.
(A)SH-SY5Y 세포,(B)COS7 세포는 anti-UCH-L1 (빨강)과 anti-Flot-1 (초록) 또는 anti-cav-1(초록)을 같이 염색 하였다.(C)Hela세포는 UCH-L1-myc-his벡터 를 형질주입 하여 UCH-L1단백질을 과발현 한 후 anti-myc(빨강)과 anti-Cav-1(초
록)을 같이 염색하였다.파랑색은 DAPI염색을 나타낸다.Flot-1과 Cav-1은 지질 래
그림.3.신경세포에서 UCH-L1단백질은 지질 래프트에 존재함. (A)쥐에서 분리한 신경세포와 (B)SH-SY5Y 세포는 5mM MβCD를 1시간 동안 처 리한 후에 수크로스(sucrose)밀도 기울기 버퍼를 이용하여 용해 하였다.용해액은 수 크로스 밀도 기울기 원심분리 실험을 이용하여 4℃에서 36,000RPM으로 20시간 원심 분리 후 각각 1ml씩 얻어 1-11개의 부분을 나누었다.4-6 부분은 지질 래프트 부분 그리고 7-11 부분은 지질 래프트가 아닌 부분으로 나누었다. 각각 나뉜 부분은 Western blot실험을 통하여 확인하였다.그래프는 image J를 이용하여 각각 밴드의 강도를 측정하여 지질 래프트와 지질 래프트가 아닌 부분을 나누어 그래프로 나타내었 다.
B. 산화적 스트레스, 혈청, 파킨슨병 관련 돌연변이 형태(I93M, S18Y)는 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영향을 미치지 않음.
그 다음으로,UCH-L1 단백질이 지질 래프트에 위치하는데 세포배양 하면서 사용되는 혈청과 산화 스트레스 같은 외부자극이 어떤 영향을 미치는지 확인하였다.
SH-SY5Y 세포와 UCH-L1단백질을 과발현 시킨 Hela세포는 혈청이 없는 상태로 한
밤 동안 배양 하였다.다음날 10% 혈청이 들어있는 배지를 1시간 동안 세포에 처리한 후 UCH-L1 단백질이 지질 래프트에 위치하는데 영향을 미치는지 확인하였다.그 결
과,혈청을 처리하지 않은 대조군과 비교 했을때 Insoluble부분의 UCH-L1단백질은
혈청에 의한 변화가 없음을 확인하였다 (그림.4A,4B).다음으로,에너지 생성과정 등 에서 종종 발생 할 수 있는 산화적 스트레스 상황에서 UCH-L1단백질이 지질 래프트 로에 위치하는데 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여,SH-SY5Y 세포와 UCH-L1 단백질을 과발현 시킨 Hela세포에 산화적 스트레스를 유도하였다.200uM H2O2를 30 분 동안 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 후 UCH-L1단백질이 지질 래프트에 위 치하는데 영향을 미치는지 확인해 보았다.그 결과,H2O2를 처리하지 않은 대조군과 비 교 했을때 Insoluble에 존재하는 UCH-L1단백질은 산화적 스트레스에 의한 변화가 없 는 것을 확인하였다 (그림.4C,4D).이 실험의 결과로,세포배양에 사용되는 혈청과 산 화적 스트레스는 UCH-L1단백질이 지질 래프트에 위치하는데 영향을 미치지 않는 것 을 확인 할 수 있었다. 다음으로,UCH-L1단백질의 파킨슨병 관련 돌연변이 형태로는 I93M,S18Y인 두 개 의 돌연변이 형태가 보고되었다 (Setsuie등,2007).UCH-L1단백질의 돌연변이 형태 가 지질 래프트에 위치하는데 변화가 있는지 확인하기 위해,Hela세포에 각각의 돌연
변이 형태를 형질주입 하여 과발현 시킨 후 Insoluble부분을 나누어서 확인해 보았다.
그 결과,UCH-L1WT,UCH-L1I93M,UCH-L1S18Y 각각에서 Insoluble에 존재하는 UCH-L1단백질의 양적 변화가 없는 것을 확인 할 수 있었다.이 결과로 UCH-L1단
백질의 병리학적 돌연변이 형태인 I93M,S18Y는 지질 래프트에 위치하는데 영향을 미
그림.4.UCH-L1 단백질이 지질 래프트에 위치하는데 혈청과 산화적 스트레스는 영향을 미치지 않는다
(A)SH-SY5Y 세포,pcDNA3.1(+)벡터와 UCH-L1-myc-his벡터를 과발현 시킨 (B)
Hela세포는 혈청이 없는 배지에 하루 동안 배양한 상태에서 혈청을 1시간 처리 하였
다.(C)SH-SY5Y 세포는 200uM H2O2를 30분 동안 처리 하였고,pcDNA3.1(+)벡터
와 UCH-L1-myc-his벡터를 과발현 시킨 (D)Hela세포는 각 농도별로 30분 동안 처
리 하였다.각각 세포들은 4 ℃를 유지하면서 Soluble과 Insoluble 부분을 나눈 후
Western blot실험을 이용하여 UCH-L1단백질을 확인하였다.각 그래프는 imageJ를
그림. 5.UCH-L1 단백질이 지질래프트에 위치하는데 파킨슨병 관련 돌연변이
(I93M,S18Y)는 영향을 미치지 않는다.
Hela세포는 pcDNA3.1(+)벡터,UCH-L1-myc-his벡터,파킨슨병 관련 돌연변이 형 태의 벡터를 형질주입 시킨 후 24시간 동안 발현시켰다.각각 세포들은 4℃를 유지하 면서 Soluble과 Insoluble부분을 나눈 후 Western blot실험을 이용하여 UCH-L1단
백질을 확인하였다.각 그래프는 imageJ를 이용하여 각각의 UCH-L1단백질의 양을
C.UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하는데 팔미토일화 반응,파르네실화 반 응,이합체화 반응,글리코실화 반응,세린/트레오닌-인산화 반응의 전사 후 변형과 정에 영향을 미치지 않음. 지질 래프트에 존재하는 UCH-L1단백질이 어떤 전사 후 변형과정을 통해 위 치하는지 알아보았다.이전 보고에 의하면 파킨슨병 관련 단백질인 DJ-1단백질이 지 질 래프트로 이동하는데 팔미토일화 반응이 관련되어 있다는 보고가 있었고 (Kim 등, 2013),UCH-L1단백질이 팔미토일화 반응이 일어나는지 프로그램 (CSS-Palm)을 통해 염기서열을 분석해본 결과 90번째,220번째 시스테인 서열에서 UCH-L1단백질의 팔미 토일화 반응이 높은 확률로 발생한다고 확인했다.그러므로,UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하는데 팔미토일화 반응이 관여하지 않을까 예상 하였다.SH-SY5Y 세
포,COS7세포,UCH-L1단백질을 과발현 시킨 Hela세포에서 UCH-L1단백질의 팔
미토일화 반응이 지질 래프트로 이동하는데 관련이 있는지 확인하였다.팔미토일화 반 응 억제제인 100uM 2-Bromopalmitate를 12시간 동안 처리하여 지질 래프트에 존재하
는 UCH-L1단백질의 변화를 확인한 결과,Insoluble에 위치하는 UCH-L1단백질의 양
적 변화가 없는 것을 확인하였다.그러므로 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는 데 팔미토일화 반응은 관련 되어 있지 않다는 것을 확인 할 수 있었다 (그림.6A-C) UCH-L1 단백질의 C-말단에 존재하는 220번째 아미노산인 CKAA에서 파르네실화 반응이 일어나고 이 전사 후 변형과정을 통해 소포체 또는 세포막에 위치한다고 보고 되었다 (Liu 등,2009).그리하여,UCH-L1단백질의 파르네실화 반응이 지질 래프트에 위치하는데 관련이 있는지 확인하기 위해서,UCH-L1단백질을 과발현 시킨 Hela세포 에서 파르네실화 반응 억제제인 1uM FTI-277를 24시간 동안 처리하여 지질 래프트 에 존재하는 UCH-L1단백질의 변화를 확인하였다.그 결과,파르네실화 반응 억제제
를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Insoluble부분에 존재하는 UCH-L1단백질의 양
반응은 관련되어 있지 않다는 것을 확인 할 수 있었다 (그림.7).
또한,UCH-L1단백질은 단량체 상태에서 가수분해 활성를 갖고 이합체 상태에서 리
가아제 활성를 갖는다는 보고 (Setsuie등,2007)와 아밀로이드-베타 단백질을 분해하
는 효소인 Neprilysin (NEP)이 이합체화 반응을 통해 지질 래프트에 위치한다고 보고
되었다 (Sato등,2012).앞선 보고들을 종합해본 결과,UCH-L1단백질은 이합체화 반
응이 일어나고 지질 래프트에 위치하는데 중요 역할을 할 것이라 예상하였다.UCH-L1 단백질의 이합체화 반응이 지질 래프트로 이동하는데 관련이 있는지 확인하기 위해서,
UCH-L1 단백질을 과발현 시킨 Hela 세포에서 이합체화 반응을 유도하는 100 uM
disuccinimidyl suberate (DSS)를 30분 동안 처리한 후 지질 래프트에 존재하는
UCH-L1단백질의 변화를 확인하였다.그 결과,Insoluble에 존재하는 UCH-L1단백질
의 변화가 없는 것으로 보아 UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하는데 이합체화
반응은 관련 되어 있지 않다는 것을 확인 할 수 있었다 (그림.8).
이전 보고에서,글리코실화 된 NSP4단백질 (Rotavirusnonstructuralprotein4)이 골
지체에서 카베올레좀 (Caveolaesome)을 통해 원형질막의 지질 래프트에 위치한다는 보
고 (Storey 등,2007)와 UT-A1 (Vasopressin-regulated urea transporter)이 글리코실 화되어 지질 래프트로 이동하여 UT-A1 수송 (Trafficking)을 활성화시킨다고 보고되
었다 (Chen 등,2011).또한,UCH-L1 단백질이 O-글리코실화 반응이 된다는 보고
(ColeandHart,2001)가 있었기 때문에,UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데
O-글리코실화 반응이 관여하지 않을까 예상하였다.SH-SY5Y 세포,UCH-L1 단백질
을 과발현 시킨 Hela 세포에서 UCH-L1단백질의 O-글리코실화 반응이 지질 래프트
로 이동하는데 관련이 있는지 확인하기 위해서,O-글리코실화 반응을 억제하는 1mM O-GlcNActransferase(OGT)억제제를 12시간 동안 처리하여 지질 래프트에 존재하는 UCH-L1단백질의 변화를 확인하였다.그 결과,OGT 억제제를 처리하지 않은 대조군
과 비교하여 Insoluble에 존재하는 UCH-L1단백질의 양적변화가 없었다.뿐만 아니라
UCH-L1 단백질을 확인해본 결과 양적 변화가 없음을 확인하였다. 이 결과로, UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 O-글리코실화 반응은 관련되어 있지 않 다는 것을 확인 할 수 있었다 (그림.9A,9B,9C). UCH-L1단백질의 서열분석을 통해 예상되는 세린-인산화 잔기인 125번,188번,189 번 서열과 트레오닌-인산화 잔기인 192번 서열이 존재하므로,UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 세린/트레오닌 인산화 반응이 관여하는지를 확인하였다.
SH-SY5Y 세포에서 세린-트레오닌 탈인산화 효소 억제제인 Okadaicacid각각의 농도
를 30분 동안 처리 하였고 또한,UCH-L1단백질을 과발현 시킨 Hela세포는 세린-트
레오닌 탈인산화 효소 억제제인 Okadaicacid 각각의 농도를 1시간 동안 처리하였다.
다음으로 지질 래프트에 존재하는 UCH-L1단백질의 양적 변화를 확인하였다.탈인산
화 효소 억제제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 나누어진 Insoluble부분에 존재하
는 UCH-L1단백질의 양적 변화가 없었다.이 결과로,UCH-L1단백질이 지질 래프트 로 이동하는데 세린-트레오닌 인산화 반응은 관련되어있지 않다는 것을 확인 할 수 있 었다 (그림.10A,10B).
그림.6.팔미토일화 반응은 UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영향을 미치지 않음.
(A)SH-SY5Y 세포,(B)COS7 세포 그리고 UCH-L1 단백질을 과발현 시킨 (B)
Hela 세포는 팔미토일화 반응 억제제인 100 uM 2-Bromopalmitate를 12시간 동안 처
리한 후 차가운 1% Triton X-100버퍼로 용해시켰다.각각 세포들은 4℃를 유지하
면서 Soluble과 Insoluble부분을 나눈 후 Western blot실험을 이용하여 UCH-L1단백
질을 확인하였다.Flot-1 또는 Cav-1은 지질 래프트의 마커로 CD71은 지질 래프트가
아닌 부분의 마커로 사용하였다.각 그래프는 image J 프로그램을 이용하여 각각의
그림.7.파르네실화 반응은 UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영향을 미치지 않음.
Hela 세포는 pcDNA3.1(+)벡터와 UCH-L1-myc-his 벡터를 형질주입 후 24시간 동
안 배양하여 과발현시켰다.파르네실화 반응 억제제인 1 uM FTI-277를 24시간 동안
처리한 후 차가운 1% Triton X-100버퍼로 용해시켰다.각각 세포들은 4℃를 유지
하면서 Soluble과 Insoluble fraction을 나눈 후 Western blot 실험을 이용하여
UCH-L1단백질을 확인하였다.Flot-1또는 cav-1은 지질 래프트의 마커로 CD71은 지
질 래프트가 아닌 부분의 마커로 사용하였다.각 그래프는 imageJ프로그램을 이용하
그림.8.이합체화 반응은 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영향을 미 치지 않음.
Hela 세포는 pcDNA3.1(+)벡터와 UCH-L1-myc-his 벡터를 형질주입 후 24시간 배
양하여 과발현시켰다. 이합체화 반응을 유도하는 100 uM disuccinimidyl
suberate(DSS)를 30분 동안 처리한 후 차가운 1% Triton X-100버퍼로 용해시켰다. 각각 세포들은 4 ℃를 유지하면서 Soluble과 Insoluble 부분을 나눈 후 Western blot
실험을 이용하여 UCH-L1 단백질을 확인하였다.Flot-1 또는 cav-1은 지질 래프트의
마커로 CD71은 지질 래프트가 아닌 부분의 마커로 사용하였다. 각 그래프는 imageJ
그림.9.O-글리코실화 반은은 UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하는데 영향 을 미치지 않음.
(A)SH-SY5Y 세포는 O-글리코실화 반응을 억제하는 1mM O-GlcNActransferase
(OGT)억제제를 12시간 동안 처리하고,UCH-L1단백질을 과발현 시킨 (B)Hela세포
는 O-글리코실화 반응을 억제하는 O-GlcNAc transferase (OGT)억제제 각각의 농도
를 24시간 동안 처리 또는 (C)O-GlcNAcase(OGA)억제제 각각의 농도와 시간 동안
처리 하여 차가운 1% Triton X-100버퍼로 용해시켰다.각각 세포들은 4℃를 유지
하면서 Soluble과 Insoluble 부분을 나눈 후 Western blot실험을 이용하여 UCH-L1
단백질을 확인하였다.Flot-1은 지질 래프트의 마커로 CD71은 지질 래프트가 아닌 부
분의 마커로 사용하였다.각 그래프는 imageJ프로그램을 이용하여 각각의 UCH-L1
그림.10.세린-트레오닌 인산화 반응은 UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하 는데 영향을 미치지 않음.
(A)SH-SY5Y 세포는 세린-트레오닌 탈인산화 억제제인 Okadaicacid 각각의 농도
를 30분 동안 처리,UCH-L1-myc-his벡터를 과발현 시킨 (B)Hela세포는 세린-트레
오닌 탈인산화 억제제인 Okadaicacid 각각의 농도를 1시간 동안 처리 하여 차가운 1
% Triton X-100 버퍼로 용해시켰다.각각 세포들은 4 ℃를 유지하면서 Soluble과
Insoluble부분으로 나눈 후 Western blot실험을 이용하여 UCH-L1단백질을 확인하
였다.Flot-1은 지질 래프트의 마커,CD71은 지질 래프트가 아닌 부분의 마커로 사용
하였다.각 그래프는 imageJ프로그램을 이용하여 각각의 UCH-L1단백질의 양을 측
D.타이로신-인산화 반응은 UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하는데 관련되 어 있음. 앞서 실험한 팔미토일화 반응,파르네실화 반응,이합체화 반응,O-글리코실화 반응,세린-트레오닌 인산화 반응의 전사 후 변형과정은 UCH-L1단백질이 지질 래프 트로 이동하는데 관여하지 않는 것을 확인하였다.타이로신-인산화 반응을 예측하는 프로그램 (GPS 2.1.2)을 통해 확인해본 결과 80번째와 173번째 타이로신 서열에서 타 이로신-인산화 반응이 일어날 확률이 높은 것을 확인했다.그리하여,SH-SY5Y 세포에 서 UCH-L1단백질이 타이로신-인산화 반응을 통하여 지질 래프트로 이동하는데 관련 이 있는지 확인하기 위해서,SH-SY5Y 세포는 타이로신 탈인산화 억제제인 sodium
orthovanadate각각의 농도를 1시간 동안 처리하여 지질 래프트에 존재하는 UCH-L1
단백질의 변화를 확인하였다.그 결과,타이로신 탈인산화 억제제를 처리하지 않은 대
조군과 비교하여,Insoluble부분에 존재하는 UCH-L1단백질의 양이 농도에 의존하여
증가하는 것을 확인하였다 (그림.11A).앞선 실험에서 적절한 농도를 확인한 후 반복
실험을 수행하였다.그 결과,타이로신 탈인산화 억제제인 1mM sodium orthovanadate
를 1시간 동안 처리 하였을 경우 Insoluble부분에 존재하는 UCH-L1 단백질의 양이
그림.11.타이로신-인산화 반응은 UCH-L1단백질이 지질래프트로 이동하는데 관 련되어 있음.
(A)SH-SY5Y 세포는 타이로신 탈인산화 억제제인 sodium orthovanadate각각의 농 도를 1시간 동안 처리,(B)SH-SY5Y 세포는 1 mM sodium orthovanadate를 1시간
동안 처리하여 차가운 1% Triton X-100버퍼로 용해시킨 후 부분을 나누었다.각각
세포들은 4℃를 유지하면서 Soluble과 Insoluble부분을 나눈 후 Western blot실험을
이용하여 UCH-L1 단백질을 확인하였다.Flot-1은 지질 래프트의 마커,CD71은 지질
래프트가 아닌 부분의 마커로 사용하였다.그래프는 imageJ프로그램을 이용하여 각
E.UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동할 때 타이로신-인산화 반응이 관련되어 있지만 직접적으로 인산화 되어 영향을 미치지 않음.
이전 실험에서,sodium orthovanadate에 의해 UCH-L1단백질이 지질 래프트 로 이동을 통해 타이로신-인산화 반응이 관련 되었다는 것을 확인하였다.따라서, UCH-L1 단백질이 직접적으로 타이로신-인산화가 일어나는 것인지 알아보기 위해, UCH-L1단백질을 과발현 시킨 Hela세포에서 sodium orthovanadate1mM 농도를 1 시간 동안 처리하여 면역 침강법을 수행 후 phospho-타이로신 항체를 이용하여 웨스 턴 블롯 실험을 통해 확인하였다.그 결과,UCH-L1단백질이 인산화 됨을 확인 하였 지만,sodium orthovanadate를 처리한 것과 비교 했을 때 인산화의 변화가 없는 것을 확인하였다.그러므로,앞선 그림.11.결과의 타이로신 인산화 반응을 통해 UCH-L1 단백질의 지질 래프트로의 이동하는데 있어 직접적인 UCH-L1 단백질의 타이로신-인 산화 반응에 의존적이지 않음을 확인하였다 (그림.12).
그림.12.타이로신-인산화된 UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동할 때 직접적 으로 관여하지는 않음.
Hela 세포는 UCH-L1-myc-his 벡터를 형질주입 후 24시간 동안 배양하여 과발현
하였다.1mM sodium orthovanadate를 1시간 동안 처리한 후 면역침강 버퍼로 용해시
켜 1차 myc 항체를 한밤동안 붙혔다.다음날 bead를 3시간 동안 처리 후 Western
Ⅳ.고찰
이전 보고들을 종합해보면,파킨슨병 관련 돌연변이 단백질로부터 발병되는 신
경퇴화의 공통적인 경로는 파킨슨병 발병에 중요 역할을 할 것이다.α-synuclein,
parkin,PINK1,LRRK2,DJ-1같은 파킨슨병 관련 단백질들은 세포막의 지질 래프트
에 위치하고,parkin과 PINK1 단백질은 미토콘드리아 기능조절 (Narendra 등,2008; Zhou 등,2008),DJ-1단백질은 세포내 섭취 (Endocytosis)과 같은 중요한 기능을 담 당한다.이 같이 공통적인 경로를 통해 지질 래프트에 관련되어 있는지를 확인하는 것 은 매우 흥미롭다.지질 래프트에 존재하는 단백질의 기능적 변화 또는 지질 래프트의 변화는 파킨슨병의 공통 발병 메카니즘일 것이라 암시 할 수 있다.지질 래프트에 위 치한다고 보고된 파킨슨병 관련 단백질인 α-synuclein,Parkin,PINK1,LRRK2,DJ-1 단백질 뿐만 아니라 UCH-L1단백질도 지질 래프트에 존재 하는지 조사하였다.
현재 연구에서,파킨슨병 관련 단백질인 UCH-L1이 공초점 형광 현미경과 수크로스 밀도 기울기 원심분리법을 통하여 신경세포의 지질 래프트에 위치하는 것을 확인하였
다.세제 저항성 막분리 실험을 통해 UCH-L1단백질의 15~20%정도가 Insoluble부
분에서 존재함을 확인한 후,MβCD를 처리하여 Insoluble부분에 존재하는 UCH-L1
단백질이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다 (그림.1).공초점 형광 현미경 분석에서 UCH-L1 단백질이 지질 래프트 마커인 Cav-1 또는 Flot-1과 같은 위치에 존재하는 것을 확인하였다 (그림.2).또한,수크로스 밀도 기울기 원심분리법에서 UCH-L1단 백질이 지질 래프트 부분인 4-6부분에 존재하고 콜레스테롤을 억제시키는 MβCD를 처리 하였을때 지질 래프트에 존재하는 UCH-L1단백질이 감소 하는 것을 확인함으 로 UCH-L1단백질이 지질 래프트에 위치하는 것을 명확히 확인하였다 (그림.3).그 러나,수크로스 밀도 기울기 원심분리법에서 MβCD를 처리 하였을때 지질 래프트에 위치하는 UCH-L1단백질이 완벽히 감소하였으나 Soluble/Insoluble실험결과에서 M
βCD를 처리 하였을 때 유의성 있게 감소는 하였지만 Insoluble부분에 적게 남아있는 것을 확인하였다.이전 보고에서,미토콘드리아에 지질 래프트가 존재하지 않음에도 불구하고 미토콘드리아 단백질이 지질 래프트 분리시 오염되어 나온다고 보고되었다 (Zheng 등,2009).이와 같이,Soluble/Insoluble분리 실험시 핵 또는 미토콘드리아에
존재하는 UCH-L1단백질이 Insoluble부분에 존재하는 것으로 생각된다.또한,이전
보고에서 MβCD은 오직 마이크로도메인에 위치한 콜레스테롤 주변이나 GPI-닻형 단
백질 바깥쪽에만 영향을 미친다고 보고 하였고 (Ilangumaran과 Hoessli,1998),반면 Friedrichson and Kurzchalia(1998)의 보고에는 GPI-닻형 단백질도 MβCD의 효과에 영향을 미친다는 상반된 보고가 있었다.이러한 MβCD의 효과의 다른점은 세포 배양 컨디션 그리고 세포종류에 따라 다르다고 보고되었다 (Abrami등,1999).이전보고를 통해 세포 종류에 따라 MβCD의 효과가 다를 수 있을 것이라고 생각된다. UCH-L1단백질에서 일어난다고 보고된 전사 후 변형과정 뿐만 아니라 염기서열을 분석하여 발생할 수 있을 것이라 예상되는 전사 후 변형과정인 팔미토일화 반응,파르 네실화 반응,이합체화 반응,O-글리코실화 반응,세린-트레오닌화 반응,타이로신-인 산화 반응을 확인하였다.이전 보고에서,단백질의 팔미토일화 반응은 지질 래프트에 위치하는 역할을 한다고 보고되었다 (Neumann-Giesen등,2004,Kim 등,2013).또한 팔미토일화 반응이 일어나는 서열을 예측하는 프로그램을 통해서 90번,220번째 시스 테인에서 UCH-L1단백질의 팔미토일화 반응이 일어날 가능성이 높은 것을 확인하였 다.지질 래프트에 존재하는 UCH-L1단백질도 팔미토일화 반응을 통해 지질 래프트 에 위치하는지 확인해본 결과,우리 실험에서는 팔미토일화 반응은 지질 래프트로 UCH-L1단백질의 이동에는 관련이 없음을 확인하였다 (그림.6).그림.6에서 보이는 것과 같이 지질 래프트에 위치한 UCH-L1단백질은 변화가 없었지만 팔미토일화 반 응 억제제를 처리한 곳에서 Insoluble에 위치한 Flot-1 단백질의 감소를 확인하였다. 이것은 Flot-1이 팔미토일화 반응을 통해 지질 래프트에 위치하기 때문에 팔미토일화 반응 억제제를 처리 하였을 때 Insoluble에 위치한 Flot-1단백질이 감소하는 것이다.
이 Flot-1단백질로 인해 팔미토일화 억제제 약물이 반응했다는 것을 확인 할 수 있 었다.UCH-L1단백질의 C-말단에 220번째 시스테인 잔기에서 일어나는 파르네실화 반응은 소포체 막을 포함한 세포막에 위치하는데 관련이 있고,이를 통해 파킨슨병 관 련 단백질인 α-synuclein양의 증가로 인한 독성을 보인다는 보고가 있다 (Liu 등, 2008).파킨슨병 관련 단백질인 UCH-L1단백질이 파르네실화 반응을 통해 지질 래프 트에 위치 하는지 확인해본 결과,우리 실험에서는 파르네실화 반응은 UCH-L1단백 질이 지질 래프트로 이동하는데 관련이 없음을 확인하였다 (그림.7).글리코실화 된
NSP4 단백질 (Rotavirus nonstructural protein 4)이 골지체에서 카바올레좀 (Caveolaesome)을 통해 원형질막의 지질 래프트에 위치한다는 보고 (Storey등,2007) 와 UT-A1(Vasopressin-regulatedureatransporter)의 글리코실화 반응은 지질 래프 트로 이동하여 UT-A1 수송 (trafficking)을 촉진시킨다는 보고가 있다 (Chen 등,
2011).또한,UCH-L1 단백질이 O-글리코실화 반응이 된다는 보고가 있었다 (Cole
and Hart,2001).O-글리코실화 억제제를 이용하여 실험해 본 결과,우리 실험에서는
O-글리코실화 반응은 UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하는데 관련이 없음을 확인하였다 (그림.9).또한,OGT (O-GlcNActransferase)억제제 뿐만 아니라 OGA
(O-GlcNAcase) 억제제를 이용하여 실험해 본 결과에서도 지질 래프트에 위치한
UCH-L1 단백질의 변화가 없음을 재확인하였다.최근 보고에서,세린/트레오닌 인산
화 반응이 지질 래프트와 밀접한 관련이 있다는 보고가 나오고있다.β1인테그린 부
착은 ezrin의 567번째 트레오닌 서열에서 일어나는 인산화 반응이 일어나고 지질 래프
트에 위치 한다고 보고되었다 (Antelmi 등,2013). 그리고,Lypd6 (LY6/PLAUR domain-containing 6)이 원형질막의 지질 래프트에서 Lrp6 (Low density lipoprotein receptor-related protein 6)인산화 반응을 촉진하여 Wnt/β-카테닌 신호를 강화한다
는 보고 (Ozhan등,2013)모두가 지질 래프트와 연관이 있다고 보고되었다.UCH-L1
단백질의 서열분석을 통해 예상되는 세린-인산화 잔기인 125번,188번,189번 서열과
이동하는데 세린/트레오닌 인산화 반응이 관여하는지를 확인하였다.그러나,우리 실 험에서는 세린/트레오닌 인산화 반응은 지질래프트로 UCH-L1단백질의 이동에는 관 련이 없음을 확인하였다 (그림.10).마지막으로,타이로신-인산화 반응과 지질 래프트 와의 관련성을 확인하였다.지질 래프트에 위치하고 중요 마커로 사용되는 Cav-1단 백질이 Src를 매개하여 타이로신-인산화 반응된다는 보고가 있다 (Rathor등,2014). 또한,증가된 칼슘을 통해 Annexin 단백질의 23번째 타이로신 서열에서 인산화 반응 이 일어나 지질 래프트에 존재하게 되고 카베올레 (Caveolae)-의존적인 세포내 섭취 (Endocytosis)에 관여하는 등 타이로신-인산화 반응과 지질 래프트가 관련되어 보고 되었다 (Valapala 등, 2011). 타이로신-인산화 반응을 예측하는 프로그램을 통해 UCH-L1단백질의 서열분석을 확인해본 결과 80번째와 173번째 타이로신 서열이 존 재 함으로 UCH-L1단백질이 지질 래프트로 이동하는데 타이로신-인산화 반응이 관 여 하는지 확인해보았다.본 연구에서,지질 래프트에 존재하는 UCH-L1단백질이 타 이로신-인산화 반응의 영향을 받아 지질 래프트로 이동함을 증명하였다 (그림.11). 그러나,면역 침강법을 통해 UCH-L1 단백질이 인산화 됨을 확인 하였지만,sodium orthovanadate를 처리한 것과 비교 했을 때 타이로신-인산화의 변화가 없음을 확인하 였다.이 결과로 보아,UCH-L1 단백질이 지질 래프트로 이동하는데 있어 직접적인 UCH-L1 단백질의 타이로신-인산화 반응에 의존적이지 않음을 확인하였다 (그림. 12).이것은,UCH-L1단백질의 직접적으로 인산화 반응이 아니라 UCH-L1과 결합하 는 다른 단백질의 인산화 반응을 통해 UCH-L1과 결합된 복합체가 같이 지질 래프트 로 이동하여 지질 래프트에 위치하는 것이라 추측된다.예를 들어,Cav-2 단백질의 19번째 타이로신 서열에서 Src를 매개한 인산화반응이 일어나 인산화된 Cav-2 단백 질이 지질 래프트에서 세포부착관련 단백질인 활성화된 FAK과 결합한다는 보고가있
다 (Lee등,2002).또한,UCH-L1단백질도 FAK과 결합하여 세포 부착,이동,생존
을 촉진한다는 보고가있다.그러므로 UCH-L1 단백질이 FAK과 같은 다른 단백질과 결합하여 인산화 반응이 활성화된 후 지질 래프트로 이동할 때 FAK과 같은 다른 단
백질과 결합된 UCH-L1단백질이 같이 지질 래프트로 이동하는 것이라 추측된다.하 지만 아직까지 명확히 확인하지 못하였다.다른 관점으로는,단백질이 전사 후 변형과 정을 통해 지질 래프트에 위치하는 방법 뿐만 아니라 단백질의 콜레스테롤이나 스핑 고지질등에 결합하는 성질을 통해 지질 래프트에 위치 할 수 있을 것이라 생각된다. 그 중 하나로 콜레스테롤 결합 모티프(CRAC)라고 불리는 발린(V)/류신(L)X(1-5)타 이로신 X(1-5)아르기닌(R)/라이신(K)이라는 모티프가 알려져 있고,파킨슨병 관련 단백질인 α-synuclein이 콜레스테롤 결합 모티프를 통해 결합한다는 보고가 있었다
(Fantini등.,2011).그러므로,UCH-L1단백질도 콜레스테롤 결합 모티프가 존재하는
지 염기서열을 확인해본 결과,VSPKVYFMK (75번째-류신,80번째-타이로신,83번째 -라이신)과 VDGHLYELDGR (168번째-발린,172번째-류신,173번째-타이로신,178번 째-아르기닌)이라는 콜레스테롤 결합 모티프를 갖고 있기 때문에 직접적으로 콜레스 테롤 결합을 통하여 지질 래프트에 위치 할수 있다고 생각된다.또한,이 콜레스테롤 결합 모티프가 타이로신 잔기를 포함하고 있어 타이로신-인산화 반응과 콜레스테롤 결합 모두 영향을 미칠수 있을 것이라 추측된다.본 연구의 제한점으로는,UCH-L1 단백질의 파르네실화,글리코실화 반응이 일어난다고 보고되었지만,팔미토일화,세린 -트레오닌 인산화,타이로신-인산화 반응은 프로그램을 통해 전사 후 변형과정이 일 어난다고 예측한 후 실험한 것이다.또한,모든 실험은 각각의 전사 후 변형과정을 일 으키는 염기서열을 돌연변이화 하여 직접실험한 것이 아니라 억제제를 처리하여 간접 적인 방법을 사용하여 실험을 수행하였다.또한,UCH-L1의 직접적인 타이로신-인산 화 반응되는 것인지 또는 직접적으로 콜레스테롤에 결합하는것인지 확인하지 못하였 다. 내용을 정리해 보면,파킨슨병 관련 UCH-L1 단백질은 지질 래프트와 관련이 되어 있다.혈청,산화 스트레스,보고된 돌연변이 형태 (I93M,S18Y)에 따른 영향에는 UCH-L1단백질의 지질 래프트에 위치 하는데 영향을 미치지 않는다.또한,UCH-L1 단백질과 관련 되어있는 전사 후 변형과정인 팔미토일화 반응,파르네실화 반응,이합
체화 반응,O-글리코실화 반응,세린/트레오닌-인산화 반응은 지질 래프트로 UCH-L1 단백질의 이동에는 관련이 없음을 확인하였다.결국,UCH-L1 단백질이 지질 래프트 로 이동하는데 타이로신-인산화 반응의 영향을 받아 지질 래프트로 이동하지만,직접 적으로 UCH-L1단백질의 타이로신-인산화를 통해 이동하는 것은 아니다.이것으로, UCH-L1 단백질의 간접적인 타이로신-인산화 반응에 의한 지질 래프트로의 이동은 지질 래프트의 신호전달 변화를 야기 할 수 있을 것이라 추측된다. 따라서,UCH-L1단백질의 지질 래프트에 존재한다는 점을 본 연구는 다른 파킨슨병 연관단백질과 더불어 지질 래프트에서의 기능변화가 파킨슨병의 공통된 병리기전이 될수 있음을 암시할수 있는 점을 밝힌 것에 의의가 있다.
Ⅴ.결론
지질 래프트에 존재하는 UCH-L1 단백질은 타이로신-인산화 반응의 영향을 받아 지질 래프트로 이동하는데 관련이 되어 있다는 것을 확인 했지만 UCH-L1단백 질이 직접적으로 타이로신-인산화 되어 발생하는 것은 아니다.타이로신-인산화 반응 의 영향을 받아 지질 래프트로 이동한 UCH-L1 단백질은 지질 래프트의 신호변화를 야기할 것이라 추측된다.참고문헌
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