Genome-wide Association Study of TDI-Induced Asthma in a Korean Population : Signofocant Association of a T-catenin(CTNNA3) and TRP channel gene-gene interaction

(1)

이학

이학 석사학위

석사학위

석사학위 논문

논문

한국인에서

한국인에서 TDI

TDI

TDI 천식의

천식의

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-

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wide 연관성

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연관성 분석

연관성

분석

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분석

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2009

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2008

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일

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i -국문요약-

한국인에서

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TDI

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TDI

천식

천식의

의

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genome

g

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-

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wide 연관성

wide

연관성

연관성 분석

분석

연구목적 연구목적연구목적

연구목적: Affymetrix 500K 유전자칩을 이용하여 TDI 천식환자와 정상인 간의 전체 게놈 연관성 연구 (genome-wide association study)를 진행하여 TDI 천식의 병인기전에 관여하는 유전적 변이를 찾아보고 유의한 의미를 가지는 유전적 변이에 대해 유전자-유전자 (gene-gene) 상호작용 분석을 통하여 유전적 변이간의 관계를 알아보고자 한다. 연구 연구연구 연구방법방법방법방법: 직업성 천식인 TDI 천식 환자 84 명과 건강한 정상인 263 명에 대하여 Affymetrix 500K 유전자칩을 사용하여 대량의 유전적 변이들의 유전자형(genotype) 결과를 얻었다. Quality control 을 통하여 대략 500,000 개의 데이터에서 200,000 개의 유전자변이가 제외가 되어 최종적으로 312,978 개로 연관성 분석(association study)을 진행하였다. 연관성 분석은 모수적

방법(parametric test)인 Chi-square test 와 비모수적 방법(non-parametric test)인

Cochran–Armitage trend test

을 통해 실험군과 대조군의 유전자형의 빈도를 비교하였다. 또한 유전형 빈도 비교에서 성별과 나이의 보정 분석을 하기 위해

logistic regression test 를 이용하였다. 유의한 유전자인 CTNNA3 와 CTNNA1 을

선정한 후 fine-mapping 을 하기 위해 CTNNA3 와 CTNNA1 주변지역의 유전적변이를 찾기 위해 direct sequencing 을 실시하여 추가 분석을 하였다.

(5)

유전자-유전자(gene-gene) 상호작용 분석을 위해 MDR (multifactor dimensionality reduction)을 이용하였다. TRPM8 의 rs10803666 의 연관성 분석이 유의한 것을 바탕으로 TRPM 가족과 TRPV 가족간의 상호작용을 분석한 후 TRP 채널 가족들의 상호작용을 알아보았다. 결과 결과결과

결과: CTNNA3 (alpha-T-catenin) alpha-3의 유전적 변이는 TDI 천식표현형에서 유의한 결과를 보였다 (5.84x10-6

for rs10762058, 1.41 x 10-5 for rs7088181, 2.03 x 10-5 for rs4378283). 두 개의 유전적 변이인(rs10762058 and rs7088181) 의 minor

Haplotype HT2[GG]를 가진 그룹에서 가지지 않은 그룹에 비해 메타콜린 PC20

레벨 (P = 0.041)이 현저히 낮았으며 CTNNA3의 mRNA 발현(P = 0.040)이 낮았다.

DNA direct sequencing에 의해 발견된 3’UTR에 위치하는 유전적 변이인

CTNNA3(rs1786929)는 TDI천식 표현형(P = 0.015 in recessive analysis model) 과

유의한 연관성을 보였다. 또한 MDR을 이용한 유전자-유전자 상호작용은 TRPM 가족간의 분석에서 TRPM3-rs7031089, rs4143737, TRPM5-rs757091, TRPM6-rs6560408, TRPM8- rs10803666 로 구성된 locus4에서 가장 좋은 모델로 선정되었다. 테스트 정확도: 0.6731, 테스트 민감도: 0.7178, sign 테스트는 10(p-value=0.0010)으로 오즈비는 2.7256으로 유의한 결과이다. 그러나 CVC(cross-validation consistency)는 10번 중 5번으로 다소 낮은 결과를 보였다. TRP channel간의 분석결과는 TRPM3-rs7031089 TRPA1-rs6472656 TRPM3-rs1337011 TRPM5-rs757091 TRPM8-rs10803666으로 이루어진 모델이 가장 좋은 결과를 나타내었다. 테스트 정확도: 0.7345, 테스트

(6)

CVC(cross-iii validation consistency)은 10/10의 결과를 보였다 결론 결론결론 결론: 알파 T-카테닌 (α T-catenin)이며 10q21 에 위치하고 있는 CTNNA3 유전자는 TDI 천식 환자에서 기도 과민증 유발에 관여하는 다수의 유전적 변이를 포함한다. 본 연구의 결과로 알파 T-카테닌의 발현의 감소는 TDI 와 같은 환경적 독소물질의 반응에 대한 민감도를 증가시키고 TDI 천식 진행에 관여함을 알 수 있다. MDR 방법을 이용하여 TRP 채널 소가족의 유전자-유전자(gene-gene) 상호작용 결과로 TRPM3-rs7031089 TRPA1-rs6472656 TRPM3-rs1337011 TRPM5-rs757091 TRPM8-rs10803666 의 조합이 TDI 천식환자와 정상인을 판별해 낼 수 있는 진단세트의 가능성을 나타내고 있다. 핵심어 핵심어핵심어 핵심어: CTNNA3, 연관성 분석, MDR, TRP 채널

(7)

차

차 례

례

국문요약 ··· ⅰ 차례 ··· iv 그림차례 ··· vi 표차례 ··· viii 약 어 ··· ⅹ Ⅰ. 서론 ··· 1 Ⅱ. 재료 및 방법 ··· 7 1. 연구대상 ··· 7 2. TDI 와 메타콜린 기도반응 테스트··· 7 3. Cytokeratin 에 대한 특이 항체측정··· 8 4. Affymetrix SNP 칩을 이용한 단일 염기 다형성 분석 ··· 8 5. SNP 칩 데이터 필터링 ··· 10 6.통계적 분석 ··· 11

7. MDR(multifactor dimensionality reduction) 분석 ··· 11

. Ⅲ 결과 ··· 14

A. CTNNA3 와 TDI 천식과의 연관성 ··· 14

1. TDI 환자의 임상적 특성··· 14

2. CTNNA3 의 발견과 TDI 천식 후보 유전자로의 가능성 ··· 15

(8)

v 4. CTNNA1 의 발견과 TDI 천식 후보 유전자로의 가능성 ··· 20 5. CTNNA3 와 CTNNA1 의 실험적 기능 연구··· 23 B. TRP 채널 가족 유전자간의 상호 연관성··· 25 1. TRPM 가족 연관성 분석과 MDR 분석··· 27 2. TRPV 가족 연관성 분석과 MDR 분석··· 31 3. TRPC 가족 연관성 분석··· 35 4. TRP 채널 가족 연관성 분석과 MDR 분석··· 36 Ⅳ. 고찰 ··· 41 Ⅴ. 결론 ··· 47 참고문헌 ··· 48 ABSTRACT ··· 59

(9)

그림

그림 차례

차례

Fig. 1. Sucession of design, experimental and data analysis steps in a genome-wide association study··· 9

Fig. 2. Summary of steps involved in implementation of the MDR method··· 13

Fig. 3. Summary of genome-wide association results and linkage disequilbrium

structure for CTNNA3··· 18

Fig . 4. Degree of bronchoconstriction (initial methacholine PC20) accoding to the

CTNNA3 haplotype··· 19

Fig . 5. Comparison of mRNA expression of CTNNA3 in Epstein-Barr virus (EBV) cells from patients with toluene diisocyanate (TDI)-induced asthma accoding to the CTNNA3 haplotype··· 19

Fig. 6. Summary of genome-wide association results and linkage disequilbrium

structure for CTNNA1··· 24

(10)

vii

Fig. 7. Summary of the main cell types and disease mechanisms involved in asthma··· 26

Fig. 8. Genome-wide association result plot for TRPM family ··· 28

Fig. 9. Interaction dendogram for TRPM family ··· 30

Fig. 10. Genome-wide association result plot for TRPV family ··· 32

Fig. 11. Interaction dendogram for TRPV family ··· 34

Fig. 12. Genome-wide association result plot for TRPC family ··· 35

Fig. 13. Distribution of TDI-induced asthma (left bars) and control(right bars) for each genotype combination of three single nucleotide polymorphisms(SNPs) for TRP channel family ··· 39

(11)

표

표 차례

차례

Table 1. Clinical characteristics of the study subjects ··· 14

Table 2. Genome-wide association results for the single-nucleotide polymorphisms

(SNPs)with P<10-4··· 16 Table 3. Genotype and allele frequencies of CTNNA3 genetic polymorphisms··· 17

Table 4. Association results of sequencing analysis of CTNNA3 and CTNNA1 genes 21

Table 5. Logistic regression analysis of the CTNNA3 SNP (rs1786929) on 3'UTR ···· 22

Table 6. Clinical features of patients with TDI-induced asthma according to CTNNA3 SNP (rs1786929) on 3'UTR ··· 22

Table 7. MDR data list of TRPM family ··· 29

Table 8. Summary of mulifactor dimensionality reduction(MDR) analysis for

TRPM family ··· 30

(12)

ix

TRPV family ··· 34

Table 11. MDR data list of TRP channel family SNP ··· 37

(13)

약

약 어

어

TDI: Toluene diisocyanate GWA: Genome-wide association

CTNNA3: Catenin(cadherin-associated protein), alpha3 CTNNA1: Catenin(cadherin-associated protein), alpha1 MDR: Multifactor dimensionality reduction

TRP: Transient receptor potential

TRPM: transient receptor potential cation channel, subfamily M TRPV: transient receptor potential cation channel, subfamily V TRPC: transient receptor potential cation channel, subfamily C TRPA: transient receptor potential cation channel, subfamily A HWE: Hardy–Weinberg equilibrium

(14)

I.

I. 서

서

서 론

론

인간유전체 전체 염기서열의 공개와 염기서열 분석기술의 발달로 인간 유전체 (human genome) 염기 서열을 바탕으로 한 유방암과 심장혈관계 질환, 우울증, 천식과 같은 다양한 질병의 감수성 (susceptibility)에 영향을 미치는 유전적 요인을 규명하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 천식은 다양한 요인에 의하여 발생하며 가족력, 알레르기, 환경, 영양, 사회경제적 상태, 심리, 직업 등이 위험 요인으로 알려져 있다. 직업성천식은 작업장에서 노출되는 물질에 의해 호흡곤란, 발작성 기침 및 천명 등의 증세를 보이는 질환으로서 산업화된 국가에서 직업과 관련된 호흡기 질환 중에서 가장 흔한 질환으로 보고 되고 있다 (Newman, 1980; Malo, 1990; Stenton 와 Hendrick, 1991). 직업성천식

(occupational asthma)은 작업 환경 중의 분진, 가스, 증기 및 흄 등에 의해 유발

되는 가역적 기도 협착으로 정의되며, 작업관련성 천식은 전형적 직업성 천식뿐만 아니라 직업적 노출에 의해 악화되는 기존의 천식도 포함한다 (Wagner 와 Wegman, 1998). 특정 직업성천식 유발물질에 노출 되거나 직종에 종사하는 근로자를 대상으로 유병률에 관한 연구에 의하면 유발 물질로는 톨루엔디이소시아네이트 (toluene-diisocyanate; TDI) 0.58-21.6% (Park et al, 1992; Kim

et al, 1994; Kim et al, 1995; Choi & Kim, 2000; Kim et al, 2004; Kim et al, 2005),

곡물분진 14% (Kim et al, 1997), 무수프탈산 6.7% (Lim et al, 1998), 반응성염료 5.9%

(Lee et al, 1990) 등이 있다. 이들 중 이소시아네이트 (isocyanate) 같은 매우

반응성이 큰 작은 분자, 기도 반응에 변화를 주는 자극제, 특이 IgE의 생산을 자극하는 동, 식물성 생물학적 부산물 등이 속한다. (Bernstein et al, 2002). 분자량에 따라 고분자 물질은 일반적인 알레르겐과 같은 기전으로 천식을 유발하는데 반해, 저 분자량 물질은 체내 단백질과 결합하여 면역 반응을 일으키는 것으로 추정되며, 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않았지만 특이 IgE 와 IgG 매개반응뿐 아니라 세포 면역기전 등이 다양하게 작용하는 것으로 생각된다

(15)

(Bernstein et al, 2002). 또한 원인 물질에 따라 면역학적 기전 외에도 다양한 비

면역학적 기전이 천식 발생에 관여한다. 대개 노출된 후 수 개월에서 수 년의 잠복기를 가지며 강력한 알레르기성을 지닌 물질은 낮은 농도에 노출되어도 쉽게 감작과 천식을 유발할 수 있는데, 여기에는 이소시아네이트나 백금염

(Merget et al, 2000), 약제 (Cho et al, 1989; Choi et al, 1992; Oh et al, 1997) 등이 있다.

직업성천식은 주로 성인에서 발생하며, 이러한 나이의 성인 천식의 10명중

1명은 직업성 감작물질이 원인일 것으로 추정된다. 이소시아네이트에 의한

천식의 유병률은 국외 연구의 경우 약 5% (Butcher et al, 1977) 국내 연구의 경우

2.1%~13%로 다양하게 보고되었다 (Park et al, 1992). 이들 환자의 50% 이상에서는

회피요법을 시행한 뒤에도 지속적인 천식 증상을 호소하였고, 혈청 특이 IgE와

IgG 항체도 상당기간 높게 남아 있었다 (Park et al, 1999). TDI는 국내에서 직업성

천식원인 중 가장 흔한 물질로 한국에서 노출 환경 근로자의 3~13%의 발병률을 보이는 직업성 천식의 가장 중요한 원인이다 (Park et al, 1992; Kim et al, 1994).

이소시아네이트에 의해 발생하는 직업성 천식은 TDI에 노출된 후에 천식 반응이 진행된 환자의 말초혈액 (peripheral blood) 안에서 CD8+ 세포와 호산구

(eosinophil) 증가가 관찰되었다 (Finotto et al, 1991).

TDI 유발 천식의 병인기전은 비 직업성 천식에 비해 더 복잡하며 많은 연구를 필요로 하고 있다. 천식에 대한 병인기전의 연구 중에서 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 단일염기 다형성은 인간 유전체상에 가장 많이 존재하는 형태의 유전적 다형성으로 유전체 상의 특정 염기서열 하나의 변화를 말한다. 인간 유전체 상의 다형성의 90% 이상을 차지하는 SNP와 같은 인구집단 내에서 약 0.1%의 개인 간의 차이(즉, 약 1000염기 마다 한 개의 SNP)를 나타내고 있다. 현재 최대로 약 1000만개 이상 존재할 것으로 예측되는 SNP중 약 300만 개 이상이 밝혀졌으며 이들 중 약 1%정도는 유전자의 암호화(Coding)부위에 존재한다. 유전자의 코딩 부위에 존재하는 SNP은 단백질의 구조를 변화시켜서 단백질의 기능의 변화를 초래할 수 있으므로 많은 연구의 대상이 되고 있다. 다른 유전적 다형성 연구에 비해 (Collins et al, 2003; Collins et al, 1997) 천식과 같이 복합적인 질병을 단일염기

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다형성을 이용해 연구하면 (Collins et al, 2003; Collins et al, 1997) 여러 장점이 있는데 그 첫번째가 인간의 유전체에서 발견되는 단일염기 다형성이 다른 종류의 다형성 (repeat 염기배열, insertion/ deletion 다형성)에 비해 빈도가 높다는 것이다 (Wang et al, 1998). 두 번째로는 단일염기 다형성 주변이 연관비평형

(linkage disequilibrium)과 haplotype의 다양성을 나타내어 유전자 지도를 만드는데

많은 도움이 될 수 있으며 (Nickerson et al, 1992) 이것이 유전자 재조합의

hot-Spot이 될 수 있다 (Chakravarti et al, 1998). 마지막으로 단일염기 다형성은 다른

다형성에 비해 돌연변이가 발생할 가능성이 적다 (Stallings et al, 1991; Brookes et al,

1999). 이와 관련하여 지금까지 TDI 천식의 병인기전과 연관된 것으로 보고된

유전자는 Glutathione S-tranferase (Mapp et al, 2002), N-acetyl transferases (Wikman et al, 2002), Human leucocyte antigen (HLA) class II alleles (Mapp et al, 2000; Kim et al, 2006), Neurokinin 2 receptor (Ye et al, 2006)등이 있다. GSTP1*Val allele은 TDI 천식과 기도

과민증에 대한 방어역할을 하는 것으로 보고되었으며, NK2R (Neurokinin 2 receptor)

G231E(G>A)의 GG 유전자는 TDI 에 노출된 후 기도 염증의 결과에서 혈청 VEGF 레벨을 증가시키는 역할을 한다고 보고되었다 (Ye et al, 2006). 천식의

병인기전과 관련 있는 후보유전자 (candidate gene)들의 유전자 다형성을 조사하는 접근방법은 직업성 천식의 복잡한 병인기전을 설명하는데 충분하지는 않다. 천식과 같은 복합질병의 유전적 병인기전은 소수의 효과를 가진 다양한 유전자의 상호작용으로부터 도출되기 때문이다. 천식에 관한 단일 후보 유전자에 대한 상관성 연구(candidate gene association study)는 비교적 간편한 연구 설계하에 진행될 수 있는 장점을 지니고 있지만, 대상군 선정에 의한 편기(bias)를 감소시키고 통계적으로 의의 있는 결과를 얻기 위해서는 대규모의 집단을 대상으로 한 연구를 진행해야 한다 (Lon et al, 2001). 후보유전자 상관성 분석에 대한 보안책으로 마이크로어레이 기술이 도입 되어 수 십 만개의 단열 염기 다형성을 초고속으로 스크리닝 할 수 있는 SNP 칩(SNP chip)을 이용하여 전체 게놈 연관성 분석 연구 (Genome-wide association study)가 가능하게 되었다.

SNP 칩이 개발되기 이전에는 질환과 SNP 데이터에 대한 질환 연관성에 관한

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판별분석과 같은 전형적인 통계학적 분석방법을 이용해 왔으나, 최근 데이터의 수가 급격히 증가함에 데이터 마이닝 기술을 이용한 질환예측 및 진단에 대한 연구가 점차 활발히 진행되고 있다. Affymetrix에서 개발한 유전자칩은 염기 서열의 상보성에 의해 교배 (hybridization)가 일어나는지에 따라 genotyping을 할 수 있다. Affymetrix SNP 어레이는 2003년 10,000 SNP 어레이를 시작으로 현재까지 1,000,000 SNP 어레이까지 발전하였다. 이들 SNP을 통하여 질환군과 정상 대조군 간의 연관성 분석 (association study)으로 질환 감수성 유전자를 찾을 수 있다. 연관성 연구는 복합성 질환 (complex disease)에서 유전자 표지의 빈도가 집단 내에서 질병과 관련하여 통계적으로 의미있게 증가하거나 감소하는 현상을 의미 하며 이는 대립유전자 자체가 직접적으로 생물학적 작용을 해서 나타나는 경우 와 부근에 있는 질병 유발 유전자와 linkage disequilibrium(LD)되어서 나타나는 두 가지가 있다 (Lon et al, 2001). 연관성 분석은 통계적인 오류, 집단의 층화

(population stratification), 유전자형 판별의 오류 등이 생기는 경우도 있다 (Lon et al, 2001). 또한 복합질환은 단일 유전자의 작용이 아닌 여러 유전자의 상호작용의 결과로 질병이 유발된다. 하지만 연관성 연구는 단일 유전자의 단일염기 다형성 내의 비교군과 대조군의 빈도의 차이만을 고려한 방법으로 여러 유전자 간의 상호작용을 고려하지 않는다. 이에 대한 보완책으로 MDR (Multifactor dimensionality reduction)을 도입하고 있다. 현재의 유전체연구는 질병과 연관성이 있는 유전자들이 어떤 상호작용으로 인해 질병을 유발하는지에 대한 의문을 시작으로 하여 생물학, 의학의 단일 분야만의 지식만으로는 가설을 확인할 수 없게 되었다. 이런 문제점을 극복하고자 학문간의 융합기술이 발달되어 있다. 시스템생물학은 바로 이러한 관점으로부터 실험에서 발견되는 복잡한 현상을 이해하기 위한 수학적 모델을 수립하고 이를 컴퓨터시뮬레이션을 통해 분석하며 또 검증하기 위해 새로운 실험을 설계하는 순환적 융합 연구를 구현하려는 생명과학, 의학, 수학, 공학, 물리학 등의 신기술 융합 학문 분야이다. 이를

반영하여 수학적 모델을 이용한 MDR (Multifactor dimensionality reduction)을 이용하여 유전자-유전자 간의 상호작용을 분석하고자 하는 시도가 있었다. 유전자-유전자 (gene-gene)와 유전자-환경 (gene-environment)의 상호작용은 전통

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적인 모수적 (parametric) 통계방법인 로지스틱 회귀 (logistic regression)으로는 차원이 높은 데이터 일 경우 분석하기 어렵다 (Hahn et al, 2003). 보통 유전자-유전자 상호작용 연구 자료들은 독립 변수들이 주효과가 없고 상호작용 효과만이 있는 경우가 많은데 회귀분석에서는 독립변수들의 주 효과가 존재하지 않으면 상호작용 효과 역시 무시하게 된다. 또한 유전자-유전자 상호작용 연구에서는 회귀모형에 고차의 상호작용항이 많이 포함되는데 이때 관측치가 없는 다수의 상호작용항이 회귀모형에 존재하게 되어 모형의 회귀 계수와 그에 대한 표준오차를 과대 추정하는 결과를 가져온다 (Ritchie et al, 2001). 이런 문제를 해결하는 한 방법으로 표본수 (sample size)를 증가시키는 것이 있지만 이는 대개 비용적인 면에서 비효율적이므로 실용적이지 않다 (Ritchie et al, 2001). 만약 표본 수가 적절한 모수 추정치를 제공할 만큼 충분할 지라도 임상적으로 관련 된 상호작용을 발견하는 데에 있어서 검정력이 낮아지는 문제가 또한 발생한다 (Coffey et al, 2004). 위와 같이 발생하는 문제를 해결하기 위하여 고 차원 자료를 저 차원으로 축소 시키는 자료축소기법에 대한 여러 가지 새로운 접근 방법이 제시되어 왔다. Nelson et al. (2001)에 의해 제안된 CPM(combinatorial partitioning method), Culverhouse et al.(2004)에 의해 제안된 RPM(restricted partition method) 등이

있는데, 그 중에서 가장 많이 사용되고 있는 자료축소전략기법 중 하나는 Ritchie

et al.(2001)에 의해 제안된 multifactor dimensionality reduction(MDR) 알고리즘이다. MDR 알고리즘은 모수적인 방법을 적용함으로써 발생하는 낮은 검정력과 부정확한 모수 추정치에 대한 문제를 해결하고, 상대적으로 작은 표본수에서 효율적으로 독립변수들의 상호작용을 식별하는 비모수적이고 모형 가정이 없는 방법이다 (Hahn et al, 2003). MDR 알고리즘의 가장 큰 장점은 어떤 요인의 주효과가 존재하지 않더라도 요인 들의 상호 작용 효과를 확인할 수 있다는 것이다 (Ritchie et al, 2003). 또한 MDR 알고리즘은 고차원 자료의 차원축소를 보다 쉽게 가능하게 한다. 유전자-유전자 상호작용에서 사용되는 유전적 및 환경적 요인들은 범주형 자료이기 때문에 분할표 (contingency table)를 사용하여 나타낼 수 있는데, 요인이 N개 있을 경우 N차원의 분할표가 존재하게 된다. 분할표의 각 셀은 각 요인의 다좌위

(19)

유전자형 조합 (multilocus genotype)을 나타내는데 MDR 알고리즘은 이러한 조합을 기준비 (threshold ratio)에 의해 상대적으로 질병에 높은 위험을 가지는 조합 (high-risk group) 과 질병에 낮은 위험을 가지는 조합(low-risk group)으로 구분함으로써 유전자형 예측변수(genotype predictor)의 차원을 N차원에서 1차원으로 효율적으로 감소시킨다. 차원감소의 효율로 얻어진 상호작용 결과를

토대로 비교군 (case)과 대조군 (control)을 구분할 수 있는 단일염기 다형성들의 군집을 알아낼 수 있다.

이에 본 연구에서는 TDI 천식 발생에 기여하는 유전적 다형성(SNP)을 관찰하기 위해 Affymetrix 500K Genechip 마이크로어레이를 이용하여 한국인 TDI 천식환자와 대조군에서 전체 게놈 연관성 분석 연구 (genome-wide association study)를 진행하였다. 또한 유의한 유전적 다형성 간의 상호작용을 알아보기 위해 MDR(multifactor dimensionality reduction) 을 이용하여 분석하였다.

(20)

Ⅱ

Ⅱ....

재료

재료 및

및

및 방법

및

방법

1. 연구대상

연구대상

본 연구에서는 TDI에 쉽게 노출되는 직업인 가구나 악기 만드는 회사에서 스프레이 페인팅을 하거나 윤을 내는 부서에 종사하여 TDI 천식이 유발된 환자를 연구 대상으로 하였다. TDI에 의한 직업성 천식환자는 이전에 보고된 방법대로 (park et al, 1999) 뚜렷한 직업력과 노출에 따른 천식 증상 악화 등의 전형적인 병력과 함께 메타콜린 및 TDI를 이용한 기관지유발시험을 통하여 확진하였다. TDI 천식 환자 83명과 일반 대조군 263명에 대한 샘플은 아주대, 순천향대, 인하대, 연세대 병원에서 상호협력에 의해 모은 것을 대상으로 하였다. TDI 천식 환자는 모두 각 병원에서 실시한 TDI 기관지유발시험에서 양성 반응을 보였다. 본 연구에 참가한 사람들은 모두 설문지와 엑스선 촬영, 피부반응 검사, 메타콜린 기관지 유발검사, 원인 항원 유발 검사, 혈청 총 IgE, 특이 IgE 및 IgG ,

CK에 대한 항체 검사, 폐기능 검사를 실시하였다.

2. TDI와

와

와 메타콜린

메타콜린

메타콜린 기관지유발시험

기관지유발시험

TDI 천식환자는 이전에 발표된 논문의 프로토콜에 따라 시행한 메타콜린

기관지유발시험과 TDI 기관지유발시험에서 양성 반응을 확인하였다 (Park et al,

1999, Ye et al, 2006). 메타콜린 기관지유발시험은 Chai등이 기술한 방법을

변형하여 시행하였다 (Chai et al, 1975). 메타콜린을 생리식염수로 희석하여 0.075,

0.15, 0.31, 0.62, 1.25, 2.5, 5, 10, 25, 50 mg/ml 농도로 준비하였다. 흡입방법은

Dosimeter (De Vilbiss, USA)를

이용하여 각 농도를 5회 흡입하고 3분을 관찰한 후 폐기능을 측정하였다. 검사 중 FEV₁ 20% 이상 감소하며 중단하고,

기관지확장제를 투여하여 가역성 여부를 판단하였다. PC20치가 25mg/ml 이하인

경우를 메타콜린 시험 양성으로 판정하였다.

TDI 기관지 유발 시험은 복용했던 약물을 24시간 이상 중단한 후 시행하였다. Devilbiss 646 nebulizer로 생리식염수를 상시 호흡량으로 10회 흡입하고 폐기능

(21)

검사를 시행하여 FEV1을 측정하여 이를 기저치로 하였다. TDI 기관지 유발시험은 작은 밀폐된 방에서 TDI(80:20 =2,4 form:2, 4-form:2, 6-form,

Sigma-Aldrich,St. Louis,MO,USA)를 5분에서 15분까지, 천식증상이 나타날 때까지

흡입하도록 하였으며, 이때 유독가스 측정기인 TLD-1(MDA Scientific, USA)로 측정한 TDI의 농도는 20ppb 이하이었다. 흡입 후 첫 1시간 동안은 10분마다 3회, 30분마다 1회 폐 기능 검사를 시행하였으며, 후기 반응을 관찰하기 이해 7시간까지 매시간 폐 기능검사를 시행하여 FEV1이 기저치 보다 20%이상 감소하는 경우를 양성반응으로 간주하였다.

3. Cytokeratin에

에

에 대한

에

대한

대한 특이

특이 항

특이

항

항체

항

체

체측정

측정

CK18 과 CK19에 대한 혈청 특이 IgG 항체는 이전에 나온 논문을 토대로 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)방법을 통해 측정하였다 (Park et al, 2002; Ye et al, 2006). 환자의 혈청이나 음성대조군 혈청을 1:200으로 희석시킨 50 µl를 PBS에 녹아있는 CK8, CK18, CK19 100ng/well 로 부착된 ELISA plate의 모든 well에 추가 하여 blocking buffer(10% fetal bovine serum이 포함된 PBS) 200 µl으로

차단하였다. 실온에서 1시간 정도 incubation후에 plate를 PBS-T로 세번 세척하였다. 10% FBS-PBS에 1:10000으로 희석한 Alkaline phosphatase-conjugated

antihuman IgG (100 µl; Sigma–Aldrich)를 37°C에서 한 시간 동안 반응시킨 후 PBS-T로 세척한 후 기질용액으로 p-nitro-phenyl phosphate (Sigma–Aldrich)를 추가하였다.

그 후 1 N NaOH를 더하여 반응을 정지시켰다. 용액의 OD(optical density)는 405

nm에서 측정하였다. 최종 흡광도는 음성 blank의 흡광도로 보정하여 계산하였다.

흡광도는 standard curve 판독 범위 내에서 측정하였다.

4. Affymetrix SNP 칩을

칩을

칩을 이용한

이용한

이용한 단일

단일 염기

단일

염기

염기 다형성

다형성

다형성 분석

다형성

분석

Affymetrix GeneChip Human Mapping 500K Array(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)

를 사용하여 347명의 샘플을 genotyping 을 하였다. Mapping assay는 각각 대략

(22)

대략 250 ng의 genomic DNA가 Affymetrix사의 프로토콜에 따라 Nsp I 와 Sty I 에 융합되어 있다. 실험 과정을 간단히 설명하면 genomic DNA를 각각 Nsp I 또는

Sty I 제한효소로 자르고 여기에 linker DNA를 ligation하여 universal PCR이

가능하도록 한다. 이들 시료를 PCR로 증폭하고 다시 fragmentation 한 후에

end-labeling 한다. 이후에 유전자칩(genechip)에 교배 (hybridization) 하여 각 spot에서 signal을 분석한다. BRLMM 알고리즘을 이용하여 유전자형을 불러오게 된다 (Fig. 1.).

Fig. 1. Sucession of design, experimental and data analysis steps in a genome-wide association study

(23)

5. SNP칩

칩

칩 데이터

칩

데이터

데이터 필터링

필터링

SNP CHIP 데이터 50만개를 1차 품질관리(Quality control)를 이용하여 20만개의 SNP를 제외 시켰다. PLINK 프로그램(http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink)을

이용하여 생 데이터(raw data)의 품질관리(Quality control)을 통해 필터링을 진행하였다. QQ plot을 이용하여 call rate가 95% 이상을 기준으로 잡았으며 X-염색체의 이형접합성 (Heterozygosity)은 각 샘플의 성별을 구별한다. SNP들 중

call rate가 95% 이하이거나 minor allele frequency가 5%미만, 정상인에서 Hardy– Weinberg equilibrium(H.W.E.) (p < 0.0001)인 177,316개의 SNP가 제외되었다. 또한

연관성 분석에서 p-value<0.0001 이하의 SNP들을 대상으로 TDI 천식과 정상인의 군집 품질 관리(Cluster quality control)를 진행하였다. 군집 품질 관리는 각각의

SNP가 3가지의 유전자형으로 독립적으로 읽혀졌는지를 파악할 수 있게 유전자형

종류별로 그룹을 이룬 이미지 파일로 분석을 한다. 1차 품질관리를 통과 하였더라도 유전자형의 분포가 군집을 명확하게 이루고 있지 않을 경우 제외가 되었다.

6. 통계적

통계적

통계적 분석

분석

표본집단 안에서 각 유전자의 Hardy–Weinberg Equilibrium (H.W.E.)을 분석하기 위해 순열 검정 테스트 (permutation test)를 실시하였다. 모든 단일염기 다형성과

TDI 천식과의 연관성 분석을 위해 모수적 방법인 chi-square 테스트, 비모수적

방법인 Cochran–Armitage trend 테스트를 사용하였다. 또한 TDI 천식 환자와 정상인 간의 genotype과 haplotype 분석은 세 가지 유전적 모델 (dominant,

recessive, codominant)을 성별과 나이로 보정한 로지스틱 회귀 (logistic regression)

분석을 이용하여 연관성 분석을 실시하였다. 오즈비 (Odds ratio)와 신뢰구간

(confidence interval)은 SAS (version9.1.3: SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)를 이용하여 chi-square 테스트로 구하였다. Haplotype은 Stephens 등 (PHASE version 2.1)에 의해

개발된 알고리즘으로 추론하였다. 유전자형 (genotype)과 표현형 (phenotype)간의 분석은 T-테스트와 Mann-Whiteny 테스트를 이용하였다.

(24)

7. MDR(multifactor dimensionality reduction) 분석

분석

MDR 알고리즘은 질병과 높은 연관성을 갖고 있는 다좌위 유전자형 (multilocus genotype)과 이산형 환경요인들의 조합을 발견하고 조합의 특성을 기술하기 위한 데이터마이닝 접근 방법으로 비모수적이고 유전적 모형을 가정하지 않는 자료 축소 전략 방법이다 (Hahn et al, 2003). MDR 알고리즘은 다양한 조합을 가지는 요인들을 질병에 높은 위험을 가지는 조합 (high-risk)으로 분류함으로써 요인들이 가지고 있는 정보를 통합한 하나의 새로운 변수를 만들어낸다. MDR 알고리즘에서는 모형을 선택하고 평가하는 것에 대한 두 가지 유용한 방법이 사용되고 있는데 하나는 교차 타당성(cross-validation)이고, 하나는 순열 검정(permutation test)이다 (Hahn et al, 2003). 교차 타당성은 MDR 알고리즘에서 선택한 모형의 일반화 능력을 추정하는 한 방법으로 사용되고, 순열 검정은 MDR 알고리즘의 최종 결과에 대한 경험적인 p-value를 계산하는데 사용되고 있다. 교차 타당성의 본래 목적은 분석 결과의 반복가능성을 입증하는 것인데, 분석 결과가 유의하게 반복가능 한지 아니면 단지 랜덤의 문제인지를 발견하는 것이 목표이다. 통계학에서의 교차 타당성은 데이터 셋의 표본을 여러 개의 부표본으로 나누는 기술을 의미하는데, 일반적으로 초기의 분석을 하는데 사용되는 부표본을 훈련 표본 (training set), 초기의 분석을 평가하는데 사용되는 부표본을 시험표본 (test set)이라고 명명한다. 각 모델의 예측 정확도 (prediction

accuracy)는 10-층 교차 타당성(ten-fold cross-validation)의해 측정된다. 10-층 교차

타당성은 데이터 셋의 분할시 전체 데이터 셋을 10개의 부표본으로 나누어 10번의 실험을 실행하는 방법으로 각각의 실험 시 9개의 표본은 훈련표본으로 분석을 실행하는데 사용 되고, 나머지 하나의 표본은 시험표본으로 초기의 분석을 평가하는데 사용된다. 가장 좋은 모델은 교차 타당성 일관성(cross-validation consistency)가 높으며 예측정확도가 높아야 한다. 좋은 모델이 여러 가지가 있다면 loci의 수가 가장 작은 모델이 선택이 된다. 선택된 모델은 민감도(Sensitivity), 특이도(specificity), 오즈비(odds ratio), 싸인 테스트(sign test)를 계산한다. 싸인 테스트 (Sign test)는 예측 정확도가 10번의 교차 타당성 (10-

(25)

cross-validation) 에서 0.5이상이 되는 경우의 수를 나타낸다.

MDR 상위 버전에서는 이전 버전에서는 제공해주지 못했던 information gain을

그래픽으로 제공하고 있다. Interaction information은 Shannon entropy를 사용하여 주어진 loci와 case-control관계로 측정된다. H(X)는 Shannon entropy 이고,

Information gain(IG)은 다음과 같이 정의가 된다. IG(ABC) = I(A;B|C) – I(A;B)

I(A;B|C) = H(A|C) + H(B|C) –H(A;B|C) I(A;B) = H(A) + H(B) – H(A;B)

I(A;B)은 A와B 사이의 연관성(correlation)의 의존성을 정의하며, I(A;B|C) 은 C가 주어졌을 경우에 A와 B의 상호작용을 정의한다. 이 두 가지 매개변수의 차이인 IG(ABC) 가 양수일 경우 협력작용(synergy)이 있거나 개체간의 상호작용의 증거로 볼 수 있다. 반면에 음수일 경우 개체간에 독립성을 나타낸다.

(26)

Fig. 2. Summary of steps involved in implementation of the MDR method: a set of n

genetic and/or discrete environmental factors is selected; the n factors and their possible multifactor classes or cells are represented in dimensional space; each multifactor cell in n-dimensional space is labeled as either “high-risk” or “low-risk”; and the prediction error of each model is estimated. For each multifactor combination, hypothetical distributions of cases (left bars in boxes) and of controls (right bars in boxes) are shown. (Ritchie et. al. 2001)

(27)

.

Ⅲ

Ⅲ 결

결

결 과

과

A. CTNNA3와

와

와 TDI 천식과의

와

천식과의

천식과의 연관성

연관성

1. TDI 환자의

환자의

환자의 임상적

환자의

임상적

임상적 특성

임상적

특성

TDI 천식 환자의 평균나이는 41.21세(±9.56)이고 대조군은 48.2세(±9.86) 이다. (Table 1). 두 그룹에서 남성이 차지하는 비율이 더 높았지만 (TDI 천식환자 67.9%, 대조군 63.87%) 성비는 차이가 없었다. 이전에 발표된 논문(Ye et al., 2006)을 참고로 하면 정상인의 혈청 특이 IgG의 빈도가 보통 3.3% 인데 반해 TDI 천식환자의 경우 CK18에 대한 혈청 특이 IgG의 빈도 가 15.6%, CK19에 대한 특이 IgG의 빈도는 24.4%로 정상인에 비해 높은 수치를 보였다. Table 1. Clinical characteristics of the study subjects TDI-induced asthma NC p-value Age(year) 41.21± 9.56/84 48.4 ±9.86/263 <0.001 Sex (male) 57/84 (67.9%) 168/263(63.87%) NS Atopy (presence/total) 30/62 (48.4%) NA NA Exposure duration (year 6.86±4.85/42 NA NA Baseline FEV1 (%) 87.64±20.84/63 NA NA PC20 methacholine (mg/mL) 5.36±8.02/61 NA NA Serum total IgE (IU/mL) 261.88±334.99/67 NA NA Specific IgG to CK18 (%) 7/45 (15.6%) NA NA Specific IgG to CK19 (%) 11/45 (24.4%) NA NA

Data are expressed as mean ± SD.TDI, toluene diisocyanate; NC, normal controls; NS, not significant; NA, not applicable.

(28)

2. CTNNA3의

의

의 발견과

의

발견과

발견과 TDI 천식

천식 후보

천식

후보

후보 유전자로의

유전자로의

유전자로의 가능성

가능성

Affymetrix 500K 유전자칩 마이크로어레이를 이용하여 TDI 천식환자 84명과 TDI에 노출되지 않은 건강한 대조군 263명을 대상으로 전체 게놈 연관성 분석 (genome-wide association study)를 진행하였다. 서로 관계가 없는 대조군과 비교군

샘플의 초기 분석에 대해, 관찰 p-value 와 기대 p-value 를 비교하여 QQ

(quality-quality) plot을 그려 연관성 분석의 분포를 테스트하였다. 실험군과 대조군 사이의

유전자형과 집단 계층(population structure)의 차이가 보이지 않았다. 생 데이터(raw

data) 에 대해 1차 품질 관리(quality control) 과 필터링을 통해 유전자형의 call rate가 95% 미만이며, minor-allele frequencies가 5% 미만, H.W.E. 테스트의 p-value가 0.001보다 작은 유전적 변이(SNP)들을 제외한 후, 남은 312,978개의 유전적 변이(SNP)로 연관성 분석(association test)을 실시하였다. 연관성 분석 결과가 p-value < 1 × 10–4 인 54개의 SNP(23개 유전자) 정리한 table 2를 보면 CTNNA1과 CTNNA3 두 개의 유전자가 여러 번에 걸쳐 중복되어 나타났다. CTNNA3는 염색체 10q21에 위치하며 알파 T 카테닌 (α T-catenin)의 한 종류이며 CTNNA3 3개의 SNP (rs10762058, rs7088181, and rs4378283) 은 성별, 나이로 보정한 로지스틱 회귀분석에서 recessive 분석에서 유의한 결과가 나왔다(Table 3). 또한 두 개의 SNP (rs10762058 and rs7088181) 에서 강한 LD (D’ > 0.9, Fig. 3C.)를 보였다. 또한 두 개 유전자 변이의 소수의 haplotype을 가진 haplotype HT2 [GG]의 빈도가 TDI 천식 환자에서 0.372, 대조군에서 0.242로 빈도수에서 차이를 보이며 TDI 천식 발생과 연관성이 있는 것으로 보인다 (p = 0.0005, OR = 1.852, 95% CI = 1.273–3.694; Table 3). Haplotype 2를 가진 그룹이 그렇지 않은 그룹보다 메타콜린 PC20 레벨이 유의하게 낮았다(Fig. 2).

(29)

(30)

(31)

Fig. 3. Summary of genome-wide association results and linkage disequilbrium

structure for CTNNA3

. A. Negative log10 (p-value) for the pearson chi-square tests of

an association between CTNNA3 and toluene diisocyanate (TDI)-induced asthma. P-value for association testing were drawn from the genome-wide association study (open triangles) covering CTNNA3 and case-control association analysis (filled triangles) covering exon 12 and untranslated region (UTRs) of CTNNA3. B. Gene map of CTNNA3.Coding exons are indicated by black blocks, and the 5’ and 3’ UTRs by white blocks. C. Linkage disequilibrium plot of CTNNA3. White and black bars represent locations of single-nucleotide polymorphisms (SNPs) from the genome-wide association study and the case-control association analysis, respectively

(32)

Fig. 4. Degree of bronchoconstriction (initial methacholine PC20) accoding to the CTNNA3 haplotype. The PC20 value was calculated by interpolating a 20%

decrease in FEV1 to the log linear dose-response curve for each individual.

Fig. 5. Comparison of the mRNA expression of CTNNA3 in Epstein-Barr virus (EBV) cells from patients with toluene diisocyanate(TDI)-induced asthma accoding to the CTNNA3 haplotype.

(33)

3. CTNNA3의

의

의 fine mapping 과

의

과

과 연관성

과

연관성

연관성 분석

분석

앞선 결과에서 CTNNA3 동일 유전자의 여러 다양한 유전자 변이가 p-value

<0.0001 에서 유의하게 나온 것을 토대로, CTNNA3 의 또 다른 유전적 변이를

찾아보기 위해 CTNNA3 주변 지역인, CTNNA3 의 코딩 서열의

상위지역(upstream) 2kb과 하위지역(downstream) 1kb에 대해 DNA direct

sequencing을 실시하였다(Fig. 2). 이 결과로 기존에 알려진 5개의 SNP (rs35289132, rs10997784, rs1941996, rs2924307, and rs1786929) 과 알려지지 않은 5개의 SNP를 발견하였다 (Table 4). Recessive 분석 모델에서 downstream지역에

있는 rs1786929이 TDI 천식과 유의한 연관성을 보였다 (p = 0.015-성별, 나이로 보정, OR = 1.783, 95% CI = 1.042–3.052;Table5). rs1786929에서 CT 또는 CC 유전자형을 가진 그룹이 TT 유전자형을 가진 그룹에 비해 CK19에 대항하는

(34)

(35)

(36)

4.

CTNNA1의

의

의 발견과

발견과

발견과 TDI 천식

발견과

천식 후보

천식

후보

후보 유전자로의

후보

유전자로의

유전자로의 가능성

가능성

본 연구에서 TDI 천식 표현형과 연관성을 보이는 다수의 유전적 변이를

가지는 (rs1828187, rs10515504, rs10043478, rs9327827, rs288016, rs176382, rs288033,

rs10038162) CTNNA1을 후보 유전자로 선정하였다. CTNNA1 유전자 지역을 coding regions (exons 5–10)과 untranslated regions (UTRs)을 sequencing 을

이용하여 fine-mapping을 실시하였다 (Fig. 6.). 염기서열 (sequencing) 분석 지역은 LD 지도를 기초로 하여 선정하였다. 연관된 SNP간의 LD 블록 안에서 exon SNP 만을 선택하였다. 이 결과 알려진 4개의 유전자 변이 (rs700617, rs6860780, rs6596456, rs2292268 )를 발견하였다. 이들 중 3개의 유전적 변이가 TDI 천식과 유의한 연관성을 보였다. 이 결과는 3개의 SNP이 위치하는 지역의 높은 LD가 나타났다. 그러나 CTNNA1 유전적 변이들과 TDI 천식 지표와 유의한 연관성은 보이지 않았다.

5. CTNNA3와

와

와 CTNNA1의

와

의

의 실험적

실험적

실험적 기능

실험적

기능

기능 연구

기능

연구

본 연구에 참여한 TDI 천식 환자에서 얻은 EBV- transformed lymphoblastoid

cell line 에서 CTNNA3 mRNA 발현의 비교에 의해 TDI 천식에서 CTNNA3

유전적 변이가 기능적 역할을 알아보자 하였다. rs10762058과 rs7088181 두 개의 SNP의 소수의 haplotype HT2를 가진 그룹이 가지지 않은 그룹에 비해 낮은 mRNA 발현을 보였다(p=0.04;Fig. 5.). CTNNA1에서 유전자 변이를 가진 그룹이 그렇지 않은 그룹이 비해 mRNA 발현은 낮았지만, 통계적으로 유의하지는 않았다.

(37)

Fig. 6. Summary of genome-wide association results and linkage disequilbrium structure for CTNNA1.

A. Negative log10 (p-value) for the pearson chi-square tests of

an association between CTNNA1 and toluene diisocyanate( TDI)-induced asthma. P-value for association testing were drawn from the genome-wide association study(open triangles) covering CTNNA1 and case-control association analysis (filled triangles) covering exon 5-10 and untranslated region (UTRs) of CTNNA1. B. Gene map of CTNNA1.Coding exons are indicated by black blocks, and the 5’ and 3’ UTRs by white blocks. C. Linkage disequilibrium plot of CTNNA3. White and black bars represent locations of single-nucleotide polymorphisms (SNPs) from the genome-wide association study and the case-control association analysis, respectively

(38)

B. TRP 채널

채널

채널 가족

가족

가족 유전자

유전자

유전자간의

유전자

간의 상호

간의

상호

상호 연관성

상호

연관성

연관성 분석

연관성

분석

TDI천식 환자와 정상인군의 연관성 분석 결과 (Table 2)에서 p-value <0.0001

유전자 다형성 (SNP) 들 중 TRPM8 (rs10803666-5.22x10-5) 이 유의한 결과를

보이고 있다. TRPM8은 양이온 채널 (cation channel) 인 TRP (transient receptor

potential) 채널 가족에 속하는 유전자이다. TRP 단백질은 TRPC, TRPV, TRPM, TRPA, TRPP, TRPML등을 소가족으로 형성하고 있으며 TRPC, TRPV, TRPM은

폐 조직에서 발현이 된다. 양이온 채널은 기도평활근에서 spasmogens 에

반응하는 기관지수축을 조절하는 기능에서 중요하며, 천식의 병인기전의 중요한 역할을 한다(Martin et al, 2005)(Fig. 6.).

이 결과를 토대로 TDI 천식환자를 대상으로 한 SNP 칩 데이터 결과에서

TRP 채널 소가족에 속해 있는 유전자들이 TDI천식환자와 정상인과의 어떤

차이를 보이고 패턴을 보이는지에 대해서 알아보고자 연관성 분석을 하였다. 또한 TRP 채널 가족 유전자들의 유전적 변이들간의 상호 연관성(gene-gene

(39)

Fig. 7. Summary of the main cell types and disease mechanisms involved in asthma.

The TRP channels expressed in each cell type are also depicted. TRP channels for which there is no published information on their expression in the cell type in the lung but speculated to be present are indicated by the “?” symbol prefix. (Li et al., 2003)

(40)

1. TRPM 가족의

가족의

가족의 연관성

연관성

연관성 분석

연관성

분석

분석과

과

과 MDR 분석

과

분석

TRP 채널 소가족(channel subfamily) 유전자들의 천식환자와 정상인 군의 연관성 분석을 실시하였다. 우선 p-value<10E-4에서 유의한 결과를 보인 TRPM 가족 중의 TRPM8의 rs10803666의 P-value가 5.22x10-5으로 유의한 것에 주목하여 TRPM 가족 (TRPM1, TRPM2, TRPM3, TRPM4, TRPM5, TRPM6, TRPM7, TRPM8)에 대한 결과 정리하였다. TRPM1은 16개의 SNP가 1차 QC(Quality Control)를 통과하였으며, TRPM2는 6개, TRPM3는 114개, TRPM4는 1개, TRPM5: 2개, TRPM6: 13개, TRPM7: 12개,TRPM8: 25개 이다. TRPM 가족의 p-value plot을 보면 TRPM3에서 P-value 0.05이하인 SNP이 16개였으며 TRPM8은 7개의 유의한 SNP가 있었다(Fig. 7). 이 중 TRPM3에서 가장 유의한 SNP는 rs4442205 (p-value=0.008) 이며 TRPM8은 rs10803666 (p-value=5.22x10-5)

이었다. TRPM 가족 8개의 SNP중에서 연관성 분석 결과에서 p-value가 유의한 SNP들을 선정하여 총 18개의 SNP로 MDR (Multifactor dimensionality reduction)

분석을 실시하였다. 그 결과 TRPM3-rs7031089, rs4143737, TRPM5- rs757091, TRPM6- rs6560408, TRPM8- rs10803666로 구성된 locus4에서 가장 좋은 모델로

선정되었다. 테스트 정확도(testing accuracy): 0.6731, 테스트 민감도 (testing

sensitivity): 0.7178, sign 테스트: 10 (p-value=0.0010)으로 오즈비(odds ratio): 2.7256으로 유의한 결과이다. 그러나 CVC(cross-validation consistency)는 10번 중 5번으로 다소 낮은 결과를 보이고 있다(Table 8).

TRPM 가족의 상호작용 덴드로그램 (Fig. 8.)의 결과에서 유의한 유전적

변이인 TRPM8-rs10803666이 TRPM5-rs757091과 linkage가 높았지만 상호작용 효과 (interaction effect)는 작게 나타났다.

(41)

(42)

(43)

(44)

2. TRPV 가족

가족

가족의

의

의 연관성

연관성

연관성 분석과

연관성

분석과

분석과 MDR 분석

분석

TRPV 소가족은 TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV5, TRPV6 이 있다. TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4는 유해성 자극과 따듯한 온도를 감지하는 수용체이다. TRPV 소가족에 해당하는 유전자들의 연관성 분석을 실시하였다 (Fig. 9.). TRPV 소가족 SNP 중에서 p-value< 0.05 로 유의한 SNP을 대상으로 MDR 분석을 실시하였다. TRPV 가족은 TRPM 가족에 비해 유전적 변이(SNP)의 수가 작고 유의한 p-value를 보이는 결과가 상대적으로 적었다. 그리하여 MDR 분석에서 사용할 SNP 선정은 SNP칩 연관성 분석 결과에서 1차 QC (quality control)를 통과한 것을 모두 대상으로 하였다. 결과는

TRPV1-rs222741, TRPV2- rs7223205, TRPV3- rs11653068, rs12453105 4개의 SNP로 구성된

locus4_{가 가장 좋은 모델로 선정되었다.}

_{Testing accuracy 0.629, testing}

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(46)

(47)

(48)

3. TRPC 가족

가족

가족의

의

의 연관성

연관성

연관성 분석

연관성

분석

TRPC 소가족은 TRPC1, TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6, TRPC7 로 구성되어 있다. SNP 칩 연관성 분석 결과에서 1 차 QC (quality control)를 통과한 TRPC 소가족 SNP 은 TRPC1 6 개, TRPC3 4 개, TRPC4 37 개, TRPC5 0 개, TRPC6 39 개, TRPC7 27 개가 있다. 이 SNP 들 중에서 연관성 분석 결과 p-value 가 0.05 이하인 SNP 는 TRPC6 에서 3 개로 TRPC 가족은 TDI 천식환자와 정상인군에서 연관성이 낮은 것으로 나타났다. 그리하여 TRPC 가족에서는 MDR 분석을 실시 하지 않았다.

(49)

4. TRP 채널

채널

채널 가족의

가족의

가족의 연관

가족의

연관성

연관

성

성 분석과

분석과

분석과 MDR분석

분석과

분석

SNP칩 결과에 속한 TRP 채널 가족 SNP들 중에서 연관성 분석 결과가 가장

좋은 SNP를 (Table 11.)들을 p-value 순으로 배열하여 상위18개의 SNP를

선택하여 MDR 분석을 해보았다. 분석 데이터에 포함된 SNP는 TDI 천식

환자의 MAF (minor allele frequency) 와 대조군의 MAF의 빈도차이를 보였으며,

H.W.E.은 TRPM7-rs531366을 제외한 모든 SNP에서 H.W.E 테스트를

통과하였다. 그 결과 TRPM3-rs7031089 TRPA1-rs6472656 TRPM3-rs1337011

TRPM5-rs757091 TRPM8-rs10803666 5개의 locus의 조합이 가장 좋은 모델로

선정되었다. 이 모델은 테스트 정확도(testing accuracy)가 0.7345이며, 테스트 민감도(testing sensitivity)는 0.7115, 테스트 특이도 (testing specificity) 는

0.7414이었다. 고 위험도 그룹과 저 위험도 그룹의 빈도의 비율인 오즈비

(Odds ratio)는 7.0711이며 신뢰구간은 (0.7996, 62.5306)로 매우 높았으며, sign

테스트 결과는 9 (p = 0.0107)를 보였다. CVC 결과는 10/10을 보였다(Table 12). 그림14는 MDR을 사용한 대조군과 비교군에 관한 information gain을 덴드로그램 (dendogram)으로 나타내고 있다. 상호작용이 높을수록 굵은 선으로 표시 하였으며, 점선으로 갈수록 독립적임을 나타낸다. 상호작용 덴드로그램 에서 TRPA1-rs6472656와 TRPM3-rs11142635가 비교적 강한 상호작용을 보였 으며, TDI 천식환자와 정상인 사이에 연관성 분석에서 유의한 유전적 변이인 TRPM8-rs10803666은 TRPM3-rs7036978과 연관성은 높지만 독립성을 보였다.

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(52)

(53)

(54)

Ⅳ

Ⅳ....

고

찰

Affymetrix 500K GeneChip 마이크로어레이를 이용하여 84명의 TDI

천식환자와 263명의 정상인을 대상으로 전체 게놈 연관성 연구를 진행한 결과

TDI(Toluene diisocyante) 천식에 연관된 2개의 CTNNA 유전자인 CTNNA3와 CTNNA1를 발견하였으며 TRP 채널 가족의 하나인 TRPM8도 유의성이 있음이 발견되어 TRP 채널 가족간의 유전자-유전자(gene-gene) 상호작용을 알아보았다. CTNNA3 (rs10762058, rs7088181)의 두 개의 유전적 변이는 TDI 천식 질환에서 염증반응과 기도 과민증의 지표를 나타내는 표현형인 메타콜린(methacholine) PC20이 낮은 결과를 통해 연관성을 보이는 것으로 보인다. 게다가 CTNNA3의 또 다른 유전적 변이 rs1786929는 TDI 천식의 중간형 표현형인 CK19에 대항하는 혈청 특이 IgG와 연관성을 보였다. TDI 천식 환자의 기도 상피세포에서 TDI가 노출됨에 따라 CK19의 발현이 증가하였다. 기도로 들이 마신 이소시아네이트 (isocyante)는 면역반응을 일으키는 상피세포의 사이토케라틴 (cytokeratin)에 결합을 한다. TDI천식에서 TDI의 노출은 기도 염증을 일으키는 자기항원 (autoantigen)으로 역할을 하는 CK19의 발현을 증가시키게 된다 (Choi et al, 2004). CK19에 대항하는 혈청 특이 IgG의 수가 TDI에 노출된 근로자 중 TDI 천식환자에서 더 높게 나타났다. 염증반응에 관여하는 이 결과는 CTNNA3 유전적 변이가 상피세포 손상과 기도 염증을 증가시키는 위험 인자라는 것을 보여준다. CTNNA3의 두 개의(rs10762058 and rs7088181) 유전적 변이의 minor haplotype HT2 [GG] 가 TDI 천식 환자에서 0.372, 대조군에서 0.242로 빈도수에서 차이를 보이며 TDI 천식 발생과 연관성이 있는 것으로 보인다 (p = 0.0005, OR = 1.852, 95% CI = 1.273– 3.694; Table 3). Haplotype2를 가진 그룹이 그렇지 않은 그룹보다 메타콜린 PC20 레벨이 유의하게 낮았다 (Fig. 2). 이 결과는 CTNNA3 유전적 변이가 메타콜린에 의한 기도 과민증을 증가시킴으로 TDI 천식진행에 중요한 인자라고 말할 수 있다.

(55)

또한, CTNNA3 두 개의 SNP (rs10762058, rs7088181)은 세포 안 에서의 기능적 연구 (functional study)에서 낮은 mRNA 발현과 연관성을 보였다. 이 결과는

CTNNA3 유전적 변이의 낮은 발현은 TDI 노출과 같은 스트레스성 환경은 기도상피세포의 방어 시스템을 방해 한다는 것을 알 수 있게 한다. 게다가 CTNNA3 주위를 sequencing을 이용하여 알려진 유전적 변이 5개 (rs35289132, rs10997784, rs1941996, rs2924307, and rs1786929)와 새로운 유전적 변이를 찾았다. 그 중 rs1786929는 recessive 모델에서 TDI천식진행에 유의한 연관성을 보였다 ( p = 0.015 성별,나이로 보정, OR = 1.783, 95% CI = 1.042–3.052). rs1786929의 CT or CC 유전자형을 가진 그룹이 TT 유전자형을 가진 그룹에 비해 CK19에 대항하는 특이 IgG가 통계적으로 유의하게 높았다. 위의 결과를 바탕으로 TDI 천식에 영향을 미치는 CTNNA3의 정확한 병인기전을 명확히 하기 위해 더 많은 연구가 필요하다.

CTNNA3외에 TDI 천식에 유전적 위험인자인 CTNNA1 유전적 변이를

발견하였다. CTNNA1의 다수의 유전적 변이들은 TDI 천식과 연관성을 보이지만 다른 임상변수와는 연관성을 보이지는 않았다. 게다가 α-카테닌(catenin)과 연관된 단백질인 카테닌 (catenin) α-like 1 (CTNNAL1)은 천식의 생쥐 모델(mouse model)에서 천식 진행에 영향을 미치는 것으로 보고 되어 있다 (Xiang et al. 2008). 특히 Balb/c 생쥐 모델에서 CTNNAL1의 mRNA 레벨이 낮았고 폐의 저항성에서는 음의 연관성을 보였다 (Xiang et al, 2008).

TDI 천식 병인기전에서 CTNNA3의 역할이 본 연구에서 명확 하지 않지만, CTNNAL1과의 상동 관계 (homology)는 CTNNA3 의 발현의 감소가 TDI와

같은 독성물질에 의한 기도 과민증 증가에 의해 TDI천식의 진행에 기여함을 나타낸다.

천식은 만성 염증 기도 질환으로 비가역적일 수 있는 기도폐쇄와 기도 염증, 기도 과민성을 특징으로 한다. 기도 개형 (airway remodeling)은 반복적 염증 반응으로 인한 기도의 구조적인 변화로 기도상피세포하 섬유화(subeptithelial

fibrosis), 점액세포 증식 (goblet cell hyperplasia), 근육섬유모세포, 평활근 비후와

(56)

2000;

Howarth

et al, 2004). 이중 기도 평활근의 비후와 증식은 기도개형에서 가장 중요한 소견 중 하나이다. 천식에서 기도 평활근은 병적 환경에서 분비되는 각종 신경전달 물질, 향염증성 매개체, 외부 물질에 반응하여 수축함으로써 환기 장애를 일으키는 효과세포이며, 구조세포로써의 수축과 이완 작용 이외에 각종 싸이토카인(cytokine)과 케모카인(kemokine)을 합성, 분비하여 염증세포를 동원하고 활성화함으로 천식에 특징인 염증 반응을 유발하는 작용이 있다 (Johnson et al, 2000; Johnson et al, 1997). 이온 채널(ion

channel)은 세포내의 칼슘이온(Ca2+) 농도와 평활근 막의 수축성을 조절하는

역할을 한다 (Parameswaran et al, 2002). 기도 평활근 수축 조절에서 중요한 역할을 하는 양이온 채널은 천식의 병인기전에서 중요한 역할을 한다 (Gosling

et al, 2005). 아직 양이온 채널에 대해서 정확히 알려진 것은 많이 없지만, TRP (transient receptor potential) 양이온 채널에 대한 많은 연구가 보고 되고 있다. TRP 채널이 기도 평활근 수축을 조절하는 주된 역할을 한다는 것은 천식과 같은 기도 질환에 대한 새로운 치료법 개발에 기여 할 수 있음을 예고하고 있다 (Gosling et al, 2005). 기도 평활근 안에서 발현하는 양이온 채널중의 하나인 TRP(transient receptor potential) 채널은 시각에 이상이 있는 초파리 변이체에서 발견된 단백질로, 이 변이체에서 빛에 의해 수용체전압 (receptor potential)이 일시적으로 발생하는 특성을 따라 Transient Receptor Potential(TRP) channel 이라고 명명되었다 (Nilius

et al, 2007). 그 후 사람을 포함한 포유류에서도 유사한 유전자가 20개 이상

발견되었으며, 그 구조적 특성에 따라 크게 6종류로 TRPC (canonical), TRPV

(vanilloid), TRPM (melastatin), TRPP (polycystin), TRPML (mucolipin), TRPA (ankyrin)

나누어져 있다 (Nilius et al, 2007). 온도수용체로 작용한다고 알려진 TRP 통로는 6개의 소가족 (subfamily) 단백질로 구성되며, 외부 자극에 의한 일부 구조의 변화가 통로의 3차 구조에 영향을 주어서 통로가 열림으로써 세포막 안으로 양이온 이동을 가능하게 만들어 열 자극과 화학적 자극의 감지를 가능하게 한다 (Mckemy et al, 2002;Patapoutian et al, 2003). TRP 통로 가족에는 유해성 자극과 따뜻한 온도를 감지하는 수용체인 TRPV1, TRPV2, TRPV3,