H2O2-Bis(2,4,6-trichlorophenyl) Oxalate Chemiluminescence Detection of Monodansyl Cadaverine Derivatives of Free Fatty Acids in High Performance Liquid Chromatography

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약학회지 제3 7권 제4호 362*^364(1993)

Yakhak Hoeji

Vol. 37, N o. 4

Monodansyl Cadaverine

^{유 도 체 화 된} 유 러 지 방 산 류 의

H202-Bis(2,4,6-trichlorophenyl) Oxalate

에 의 한 고 속 액 체 크 로 마 토 그 라 피

이 용 문 " • 문 동 철 충복대학교 약학대학

(R eceiv ed Ju ly 6. 1993)

H202-Bis(2,4,6-trichlorophenyl) Oxalate Chemiluminescence Detection of Monodansyl Cadaverine Derivatives of Free Fatty Acids in

High Performance Liquid Chromatography

Yong Moon Lee** and Dong Cheul Moon

College of Pharmacy, Chungbuk National University. Chongju 360-763, Korea

Abstract—The sensitive detection of free fatty acids was investigated by using H

20

；rbis(

2

,

4

,

6

- trichlorophenyl) oxalate chemiluminescence system after monodansyl cadaverine labeling. Because dansyl moiety is well excited by this chemiluminescence system, monodansyl cadaverine was a prominent reagent to this system for the determination of free fatty acids. The eluent of 50 mM tris-HCl buffer (pH 7.7)-acetonitrile

(1

: 4, v/v) was run through TSK gel ODS 80 TM column.

The reagent solutions were mixed with the eluent containing the monodansyl cadaverine derivative of fatty acids from the column. By this system, linolic acid was detected 50 fmol by injected amount.

Keywords □ Free fatty acids, monodansyl cadaverine, chemiluminescence detection, high-performa

nce liquid chromatography.

최근■어 high-performance liquid chromatography(HPLC)에서 사용되는 검출장치에는 분석대상물 의 종류가 다앙해점에 따라 그에 대응하는 새로운 방식의 고감도 검출 방범이 요구되고 있다. 그 중에서 화학발광(chemiluminescence)현상을 이용한 검출방 범은 형광분석법에서 볼 수 있었던 형광시약과 반응 부산물들에 외한 chromatogram의 back ground상승 및 소광현상 등과 같은 분석상의 문제점들이 적으며, 목적물만을 선택적으로 검출할 수 있는 방범이다. 또 반응시약의 선택에 따라 감도외 향상을 기대할 수 있는 우수한 방범으로 이용되기 시작하고 있다. 화 학발광현상은 여러 반응계에서 보고되어 있으나, HPLC와 연결하여 사용할 수 있는 반웅은 Chand-

** 본 논문에 관한 문의는 이 저자에게로.

ross에 외하여 보고된 oxalate와 과산화수소외 반응 이며/^ 측정감도를 향상하기 위한 검토는 Rauhut에 의하여 정리되어 비로소 고감도 분석이 가능하게 되 었 다 2> 본 연구는 형광성 probe 인 monodansyl cada

verine (MDC)을 사용하여 지방산류를 완화한 조건 에 서 신속하게 유도체 화하여 H

2

O

2

와 bis(2,4.6~trichlorophenyl)oxalate (TCPO)의 화학반응에서 나오는 에 너지에 외하여 MDC를 여기시킨 후, 방출되는 형광 량을 검출하여 지방산류를 50fmol까지 검출할 수 있었다.

실험방법

지방산류의 M D C 유도체 화 ■포 화 및 불포화 지방

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Monodansyl Cadaverine유 도 체 화 된 유리지방산류외 H^jQrBis Oxalate에 외한 고속액체 크 로 마 토 그 라 피 363

산류 10종을 Lee 등의 방범 에 외하여 유도체화하였다

.3

» 12 mM MDC 및 coupling agent로 diethyl phospho- rocyanidate (DEPC)를 사용하였다. 반응용매 dimeth- ylformamide (DMF) 50|j/에 500 pmol의 지방산류를 녹인 후, 50 m/ M DC용액 및 DEPC 2 m/를 가하였다.

2 ^ 3 초간 흔화한 후 상온에서 15분간 반응시켜 M D C에 외한 유도체화를 완결하였다.

지방산류의 분리 및 검 출 ~ H P L C 장처는 880-PU intelligent pump와 825-CL intelligent CL detector 및 RC-250 desktop recorder로 구성된 Jasco사 (To- kyo, Japan)의 기기를 사용하였고, 용매류는 HPLC grade를 사용하였다.

결과 및 고찰

H

2

O

2

와 oxalic ester와의 용액내 반응에 외하여 발생하는 활성중간체가 형광단과 반응하여 형광단을 여기시킨 후 형광단이 기저상태로 되돌아오면서 발 생하는 형광외 광량을 측정하는 방범을 화학발광검 출범 (chemiluminescence detection)이라 한다. Oxa-

(회 ■니 ^

C I I

TCPO

H

2

O

2

a

[ F L R ] * +

2C0z

니 G H T

Fig. -The chemiluminescent reaction of bis(2,4,6-trichlorophenyl) oxalate with hydrogen peroxide.

[FLR]*: excited fluorescer

lie ester 중 bis-(2,4,6-trichlorophenyl) oxalate (TCPO)나 수용성 인 bis[4-nitro-2-(3,6,9-trioxadecyl- carbonyl)phenyl]oxalate (TDPO)를 사용하여 H

2

O

2

와 반응시키면, 활성중간체

1

,

2

-dioxetanedione이 생성되 며, 이것이 용매내 형광단과 접촉하면

2

분자의 C

02

로 분해한다. 이때 생성되는 화학energy (약 71 kcal /mol, 402 nm)로 dansyl fluorophore를 여기시킬 수

었다.^»

M D C에 의하여 유러 지방산류 11종을 유도체화하 였다. 3대외 pump를 사용한 HPLC system에서 50 mM tris-HCl buffer (pH 7.7) : acetonitrile (1 : 4, v/v) 외 용리액을 유속 0.4m//min로 하고, 시료를 주입하 여 TSK gel ODS 80 TM (4.6 mm i.d.X 150 m m )을 통하여 분리되어 나오는 각각외 유리지방산외 MDC 유도체들을 5m]VI TCPO의 ethyl acetate용액 및 50 mM H

2

O

2

의 acetone용액의 유속을 각각 0.25 m//min 및

0.1

m//min로 하여 mixer에 서 흔화한 후, 용리 액외 형광체와 반응하여 나오는 광량을 화학발광 검출기로 측정하였다.

혈액등 체액에 존재하는 포화 및 불 포 화 유리지방 산류

10

종은 margaric acid를 내부표준물 절 로 하여 완전히 baseline 분리가 가능하였다. 이 조건에서 li- nolic acid의 경우, 형광검출기 (Xex. 340 nm, Xem, 520nm)에서외 검출한계는 약 100 fmol이었으나,^^ 본 방범에 외한 검출한계는 약 50 fmol이었다. 본 방범의 조건이 에비적 조건임을 감안할 때 차후 조건의 상 세한 검토에 의하여 더욱 고감도 검출이 가능하리라 생각된다. 앞으로 고감도화를 하기 위하여는 용리 액의

• W aste

Fig. 2 ― Flow diagram for chemiluminescence detection system for MDC derivatized free fatty acids:

D, damper; I, injector; M, mixer; P, pump.

Vol. 37. No. 4, 1993

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0 30 60 90 120 150 Retention tim e/m in

F ig . >흑一C h r o m a t o g r a m o f a m ix t u r e o f M D C d e r iv a t i

ze d free fatty a c id s . C o n d itio n s : in je c te d a m o u n t, 5 p m o l e a c h ( in te r n a l s ta n d a r d , 2 p m o l); d e te c to r a tte n . X g a in , 1 6 X 1 0： H P L C c o n d itio n s w e r e d e s c r ib e d in R e s u lts a n d D is c u s s io n . P e a k id e n tific a tio n s : (1) la u r ic a c id (C

12；o). (2) m y r is to le ic a c id ( C h i). (3) lin o le ic a c id (C i8：：i), (4) m y r is tic a c id (C i4；o), (5) palm i- to le ic a cid (C i6 ：iX (6) a r a c h id o n ic a c id (C20：4).

(7) lin o lic a c id ( C is：2), (8) p a lm itic acid (C i6：o), (9) o le ic a c id ( C is：1), (1 0 ) m a r g a r ic a c id (C i7：o, I.S .), (11) s te a ric a c id (C i8；o).

유속, 시약농도, 시약용매 등의 조건 설정이 필요하며, 그외 반응용매에서 유래하는 불순물의 제거 및 오염 방지에 세심한 주외가 필요하다. 또 a m i n o a c i d s의

d a n s y l-유도체가 i m i d a z o l e b u f f e r에서 고감도 검출된

보고가 었어"' 앞으로 본 방법의 개선에 유용하러라 생 각된다.

결론적으로 본 방법에 의한 유러지방산류의 고감도 측정법은 생물학적 시료로부터 미량으로 존재하는 시방산류외 선택적인 분석수단으로 유용하리라 생각 된다.

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364 이용문 • 문동철