[하이라이트] 바이오 전자코 연구동향

서론

인간의 감각 가운데 그 복잡성으로 인하여 가장 알 려지지 않은 영역이 후각 분야이다. 1991년 Buck과 Axel이 쥐의 후각 상피 조직으로부터 후각수용체 (olfactory receptor; OR) 유전자를 보고하면서 척추 동물의 후각 시스템에 관한 본격적인 연구가 시작되 었으며, 2004년 노벨상 수상(Buck and Axel, 노벨의 약 및 생리학상)으로 인하여 비로서 인간의 후각 메 커니즘에 대한 이해와 이로 인한 분자수준의 연구 발 판이 마련되었다. 선진국을 중심으로 여러 국가에서 후각관련 연구를 수행하고 있지만, 국내외를 막론하 고 후각에 대한 이해 정도는 시각, 청각 등 다른 감각 기관에 비해 여전히 매우 미흡한 상태이다. ‘냄새’의 근원을 제공하는 것은 해당 물질로부터 확산되어 나 온 휘발성의 냄새 유발 물질이며, 인간이 인지하고 기 억할 수 있는 냄새의 종류는 약 1만 가지 정도인 것으 로 알려져 있다. 이들이 공기 중에 섞여서 코 안으로 유입되면 후각 상피세포를 자극하게 된다. 후각 상피 세포는 콧속의 점막에 위치한 일종의 센서라고 볼 수 있으며, 후각 상피세포에는 각각의 냄새와 결합하여 이를 감지할 수 있는 후각수용체가 존재한다. 인간의 경우는 후각수용체에 관여하는 유전자 수가 약 1,000 여 개 정도로 여겨졌으나, 그 중에서 기능을 갖는 것

은 380여 개 정도이며 이러한 후각수용체의 작용에 의하여 냄새를 인지하게 된다. 냄새 및 후각에 대한 기초 연구 및 산업적 응용은 미국, 일본, 독일, 프랑스, 스위스 등 선진국들에 의해 주도되고 있으며, 특히 미 국의 Monell 연구소는 냄새의 감지 및 인지에 대한 기초연구에서 의학, 환경, 식품 등의 다양한 분야에의 응용 등에서 독보적인 연구들을 수행하고 있다. 또한 선진국에서는 이러한 냄새의 산업적 응용의 중요성을 인식하여 Givaudan, Firmenich, IFF 등의 향료 회사 는 물론, P&G, Unilever 등의 다국적 생활용품 및 식 품관련산업에서도 활발한 연구를 수행하고 있다.

냄새를 측정하는 방법으로 전자코(electronic nose)가 연구되어, 그 중 일부는 상업화되었다. 전자 코는 냄새분자와 어레이 타입의 고분자물질간의 흡 탈착 특성에 기반하여 냄새를 측정하는 기술이다. 코 의 후각세포에 해당하는 어레이 타입의 고분자 소자 로 이루어진 감지부와 어레이 타입의 신호를 패턴화 하여 처리하는 기술이 핵심요소이며, 현재의 기술상 일부 제한된 종류(selectivity)와 농도(sensitivity)에 서만 냄새 측정이 가능하며 정량적인 분석이 어렵다 는 단점이 있다. 이와 같은 한계성에도 불구하고 전 자코 시장은 세계적으로 1998년에 1억 4천만 달러에 서 2003년에 2억 달러로 성장하였고, Aroma

박태현, 이상훈

서울대학교 화학생물공학부, [email protected]

Scan(UK), Neotronic(UK), Alpha MOS(France), 및 Figaro Engineering Inc.(Japan)에서 전자코 시스 템을 개발하여 시판하고 있다.

본 고에서 소개하고자 하는 바이오 전자코는 기존의 전자코와는 근본적으로 다른 접근 방법으로서, 인간의 후각을 그대로 재현하는 것을 목적으로 하고 있다. 인 간의 후각을 그대로 재현할 수 있다는 것은 냄새를 이 해하고, 분류하고, 표준화하는데 근본적으로 기여할 수 있을 뿐만 아니라, 후각 바이오센서는 다양한 분야에 서 많은 응용 가능성을 가지고 있다. 바이오 전자코는 생물학적 후각 메커니즘에 기초하여 후각수용체 및 후 각세포를 1차 신호전달기인 후각신호 감지부로 이용하 며, 다양한 나노소자를 2차 신호전달기로 이용함으로 서 1차 신호전달기의 신호를 증폭하여 수 fM까지의 낮은 농도의 냄새물질을 선택적으로 인지할 수 있다.

바이오 전자코 구현을 위해 후각수용체 단백질의 이종 세포계(heterologous expression system)에서의 발현이 필요하지만, 막 단백질(membrane protein)인 후각수용체의 특성상 다양한 발현시스템을 이용한 많 은 연구에도 불구하고 발현 효율이 상당히 낮다. 일정 하지 않은 후각 수용체 단백질의 발현 효율과 분리정 제의 어려움으로 인해 단백질의 수득이 어려우며 후 각수용체 단백질과 냄새물질간의 결합에 관한 보고된 데이터가 한정적이기 때문에 다양한 센서의 개발이 어려운 실정이다. 최근 후각의 생물학적 메커니즘에 대한 기본 이해에 바탕을 둔 바이오 전자코에 대한 연 구가 스페인, 이탈리아, 프랑스의 3개국 6개팀에 의해 SPOT-NOSED 프로젝트라는 공동연구로 2003~2005 년까지 수행되었다. 1차 신호변환기로 인간 후각수용

체를, 2차 신호변환기로 MEA(microelectrode array), SPR(surface plasmon resonance)을 사용하여 후각 수용체 단백질의 고정화 및 바이오 전자코 개발에 대 한 연구가 수행되었다. 본 고에서는 1차 신호전달기로 후각수용체 단백질과 후각기능세포를 이용하는 바이 오 전자코의 개발사례에 대하여 기술하고자 한다.

본론

1) 1차 신호전달기

1차 신호전달기로 사용되는 후각수용체 단백질 및 후각기능세포는 다음과 같은 과정에 의해 제조된다.

후각수용체는 동물세포 표면에 발현하는 방법이 일반 적이지만, 대장균에서 대량의 후각수용체 발현이 가 능하였다.

후각수용체는 genomic DNA로부터 PCR을 통하 여 증폭된 후 발현벡터에 삽입되었다. 동물세포에서 세포막 표면에 후각수용체 단백질이 올바로 삽입될 수 있도록 시각세포 로돕신의 신호서열(signal sequence)인 rho-tag을 후각수용체의 N말단에 삽입 하였다. 후각수용체는 N 말단에 신호서열이 존재하지 않아 이종 세포계(heterologous cell system)에서 발 현 시 세포막 발현이 불가능하다. 따라서 로돕신 신호 서열을 이용함으로써 세포막 표면에서 발현율이 높고 세포막 표면에 효과적인 translocation이 가능하였다 [그림 2(A)]. 후각수용체를 영구적으로 세포막에 발 현하기 위해 G418이라는 선별마커를 포함하는 배지에 서 2~3주 동안 배양한 후 생존한 세포를 선별하였다.

선별된 세포는 면역학적 방법(immunocytochemical method) 및 웨스턴 블롯(western blot)을 이용하여 후각수용체 단백질의 발현을 확인하였고 상기의 방법 으로 후각기능세포를 제조가 가능하였다.

대장균 시스템에서 후각수용체의 발현 또한 가능하 였다. 후각수용체를 포함하는 발현벡터로 대장균을 형질 전환한 후, IPTG처리를 통하여 발현을 유도 (induction)하였다. 발현이 유도된 세포를 수확하여 초 음파 분쇄(sonication)한 후 후각수용체를 포함하는 불 바이오 전자코 연구동향

그림 1. 바이오 전자코의 모식도.

용성 부분(insoluble fraction)을 수획하여 단백질 기반 의 바이오 전자코 개발에 이용하였다[그림 4(B)].

2) QCM(quartz crystal microbalance) 기반의 바이오 전자코

Quartz crystal은 고유의 공명주파수를 가지고 진동 을 한다. 이때 특이적 분자가 quartz crystal의 금박막 표면에 입혀진 물질에 흡착되면, 증가된 질량이 quartz crystal의 공명주파수를 변화시키고 진동수는 질량에 비례하여 감소한다. Quartz crystal microbalance (QCM)가 후각 수용체 I7에 냄새분자의 결합을 감지 하기 위해 사용되었다. 먼저 rat유래의 후각수용체 I7 을 발현하는 후각세포를 quartz crystal의 표면에 배양 하고 이를 진공 건조하였다. 후각수용체 I7에 특이적 인 냄새분자인 octanal의 농도에 따른 결합 반응을 확 인하기 위해, 냄새 용액과 평형을 이룬 포화 기체를 주

입하여 측정하였다.

[그림 2(A)]는 후각수용체 I7이 발현된 후각기능

세포의 사진이다. 후각수용체의 세포막 발현을 위해

신호서열인 rho-tag을 퓨전하여 발현하였으며 면역학

적 방법(immunocytochemical method)에 의해 이를

확인하였다. [그림 2(B)]는 I7 유전자가 삽입된 동물

세포에 5

µM ponasterone A를 처리하여 후각수용체 의 발현을 유도한 경우(induced)와 그렇지 않은 경우 (not induced)에 octanal 자극에 대한 실험결과를 나 타낸다. 후각수용체 발현이 유도된 경우 octanal에 대 한 I7특이적의 반응이 관찰되었고, 10~10^-8mM범위 에서 선형적인 반응이 관찰되었다[그림 2(C)]. [그림 2(D)]에서는 octanal과 유사구조를 갖는 냄새물질을 자극하였을 때 상대적으로 낮은 반응을 나타내며 octanal을 선택적으로 인지함을 알 수 있다. 또한 ODR-10을 대장균에서 발현시켜 QCM을 이용하여

그림 2. (A) 후각수용체의 세포막 표면 발현; 형광이미지(좌), 광학이미지(우), (B) 1mM octanal 자극에 대한 QCM 센서의

반응, (C) octanal의 농도와 주파수 변화와의 농도 의존적 관계, (D) 유사구조 냄새물질에 대한 I7을 발현하는 세

포로 코팅된 QCM 센서의 선택도(Ko and Park, 2005, Biosens. Bioelectron., 20, 1327).

진행한 실험에서도 유사한 결과가 관찰되었다(Sung et al., 2006, Biosens. Bioelectron., 21, 1981).

3) 후각 수용체 단백질과 탄소나노튜브가 결합된 바이오 전자코

1990년대 탄소나노튜브 발견을 기점으로 다양한 나 노입자를 이용한 센서 연구가 활발히 진행되었다. 탄

소나노튜브는 지름이 1nm정도로 속이 비 어있는 튜브 형태의 분자로서 구조와 상 황에 따라 전도체 특성과 반도체 특성을 동시에 갖고 있고 이러한 전기적 성질은 인위적으로 조절하는 것이 가능하다. 따라 서 탄소나노튜브 트랜지스터의 경우 게이 트 전압에 의한 전계 효과 트랜지스터 (field-effect transistor, FET)의 전기전 도도 변화를 이용하여 센서로 활용이 가 능하다. 대장균에서 발현시킨 인간 후각수 용체 hOR2AG1을 tirtonX-100으로 처리 하여 용해함으로써 부분적인 정제과정을 수행하였다. 이를 single-walled carbon nanotube-FET(swCNT-FET) sensor 표면에 흡착 을 통하여 고정화시킨 후, hOR2AG1과 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 amyl butyrate를 자극하여 후각수용체와 냄새분자와의 결합을 확인하였다.

후각 수용체에 냄새물질이 결합할 때 구조적 변화 가 발생하며 이때 일시적인 단백질의 전위 변화가 발 생하며 이 미세한 전류의 변화를 swCNT-FET센서

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그림 3. (A) 냄새물질과 후각수용체 결합에 의해 야기된 구조적 변화, (B) hOR-swCNT-FET 센서의 실시간 반응곡선, (C) 특이적 냄새물질 자극의 선택적 인지, (D) 특이적 냄새물질(amyl butyrate) 및 유사구조 냄새물질의 구조(Kim et al., 2009, Adv. Mater., 21, 91).

그림 4. (A) 폴리피롤 나노튜브 표면에 후각수용체의 고정화, (B) 폴리피롤

나노튜브(위)과 후각수용체 단백질을 고정화한 폴리피롤 나노튜

브(아래)(Yoon et al., 2009, Angew. Chem. Int. Ed., 48, 2755).

를 이용하여 측정한다[그림 3(A)]. [그림 3(B)]는 hOR2AG1에 다양한 농도의 amyl butyrate를 자극한 후 swCNT-FET센서 반응을 실시간으로 관찰한 결 과이다. 극히 낮은 농도인 100fM(10

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M)까지 냄새분 자의 검출이 가능함을 확인하였고 amyl butyrate에 선택적으로 결합함을 확인하였다[그림 3(C), (D)].

4) 후각수용체 단백질과 전도성 고분자 나노튜브가 결합된 바이오 전자코

후각수용체 단백질을 표면에 부착시킨 폴리피롤 나 노튜브(polypyrrole nanotube)를 이용한 전계효과 트 랜지스터 형태의 전기화학센서를 제조하고 후각수용 체에 특이적 냄새 물질인 amyl butyrate를 검출하는 연구를 수행하였다. [그림 4(A)]는 후각수용체 단백 질의 고정화를 모식화한 그림이다. 폴리피롤 나노튜브 표면의 카르복실기(carboxylated polypyrole nanotube, CPNT)를 이용하여 후각수용체 단백질을 공유결합시켰고 이를 FE-SEM을 이용하여 확인하였

다. [그림 4(B)]의 상단은 단백질이 고정화되지 않은 튜브를, 하단은 단백질을 고정화한 그림을 나타낸다.

[그 림 5(A)]는 OR-CPNT-FET센 서 의 amyl butyrate에 대한 실시간 반응 곡선을 나타낸다. 제작된 센서는 amyl butyrate에 노출시 1초 내의 짧은 반응시 간을 통해 전류변화가 감지되었고, 탐지한계농도는 40fM(10

^-14

M) 수준이었다. [그림 5(B)]에서 단백질 고정화양에 따라 검지농도의 감도가 변함을 확인하였 고, 유사구조의 냄새물질 중 amyl butyrate만을 선택 적으로 인지함을 확인하였다[그림 5(C)]. 또한 [그림 5(D)]는 동일한 실험조건에서 냄새물질 인지감도의 유지를 확인하기 위해 센서의 안정성 테스트를 수행한 결과이며 5일 후 약 27±6%의 인지도 감소가 관찰되 었다.

5) 후각기능세포와 MEA(microelectrode array)을 이용한 바이오 전자코

본래의 후각신경세포는 냄새분자 자극에 의해 전기

그림 5. 폴리피롤 나노튜브 전계효과 트랜지스터 센서의 amyl butyrate에 대한 실시간 반응 곡선 (A) amyl butyrate에

대한 실시간 반응 곡선, (B) 단백질 고정화 양에 따른 냄새물질 인지 곡선, (C) hOR-CPNT-FET 센서의 선택도 측

정, (D) 제조된 hOR-CPNT-FET 안정성 테스트(Yoon et al., 2009, Angew. Chem. Int. Ed., 48, 2755).

적 신호를 발생시키며 이를 뇌에 전달하여 냄새를 인지 하는 과정을 갖는다. 후각신경세포에서 냄새분자가 후 각수용체와 결합을 하고 이로 인하여 발생된 신호전달 에 의해 cyclic nucleotide gated(CNG)-channel을 통 하여 세포 외부 이온의 대량 유입이 발생하여 세포막 전위의 변화가 발생한다. 평판형 전극을 이용한 전기적 측정 방법을 도입하기 위해서는 후각세포가 CNG- channel을 가져야 한다. 이러한 전기적 측정방법을 개발 하기 위해 CNG-channel과 유사 기능을 하는 rat의 미각 이온 채널인 gustatory CNG(CNGgust)-channel을 후 각수용체와 함께 co-expression시켰으며, I7과 octanal 의 반응을 세포 외 전위차를 측정함으로써 확인하였다.

[그림 6(A)]는 후각수용체와 CNGgust channel의 발 현하는 세포의 후각신호를 측정하기 위한 전기적 측정 장비와 실험모식도를 나타내 그림이며, octanal 자극에 의해 후각 수용체 I7이 반응하여 후각세포의 막전위 (membrane potential)가 발생됨을 확인하였다[그림 6(B)]. 후각수용체 I7이 발현된 세포는 octanal에 반응 하여 약 10mV의 전위차를 발생하였다.

6) 후각기능세포와 SPR(surface plasmon resonance)이 결합된 바이오 전자코

Surface plasmon resonance(SPR)은 단백질-단백 질, 항원-항체 결합 등의 molecular interactions의 특

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그림 6. (A) 후각신호 측정을 위한 측정장비 모식도, (B) 후 각수용체와 CNGgust channel을 발현하는 세포의 냄새분자 자극으로 유발된 막전위차의 측정(Lee et al., 2009, Biosens. Bioelectron., 24, 2659).

그림 7. (A) 금속박막 표면에 고정화된 후각세포의 측정 원리, (B) 냄새물질과 후각수용체 I7의 결합에 의 해 유도된 신호전달의 결과로서 측정된 SPR 신 호(Lee et al., 2009, Biosens. Bioelectron. in press).

(A) (A)

(B)

(B)

성을 확인하는 목적으로 최근 널리 사용되고 있는 방 법이다. 표면 플라즈몬(surface plasmon)은 금속박막 표면에서 일어나는 전자들의 집단적 거동(charge density oscillation)이며, 이에 의해 발생한 표면 플라 즈몬 파는 금속과 유전체의 경계면을 따라 진행하는 표면 전자기파이다. 표면 플라즈몬 공명이 일어나는 공명각(surface plasmon resonance angle), 즉 반사광 이 최소가 되는 각도는 금속박막 표면에서의 질량이 증가하거나 구조가 변형되면 결과적으로 유효 굴절률 (refractive index)이 변화하여 공명각(angle) 또는 반 사광의 강도(reflectance)를 변화시킨다. 이러한 원리 로 금박막 표면에서의 생물물질들의 결합 반응의 측 정이 가능하다. 본 연구에서는 후각수용체를 발현하는 후각기능세포에 냄새분자 자극을 통하여 세포 내의 신호전달을 SPR을 이용하여 광학적으로 관찰하고자 하였다. 후각 수용체로는 rat의 I7 receptor를 이용하 였으며 HEK-293 세포 표면에 후각수용체를 발현시 켰다. I7을 발현하는 후각세포는 0.1mg/ml의 poly-D- lysine을 코팅한 금박막 표면에서 배양되었으며 후각 신호의 측정을 위해 SPR을 이용하였다[그림 7(A)].

[그림 7(B)]는 I7에 특이적으로 결합하는 냄새분자인 octanal을 농도별로 자극하였을 때 관찰된 후각세포의 반응이다. SPR은 금박막 표면으로부터 200nm의 범 위 내의 반응만을 정확히 측정할 수 있는 것으로 알려 져 있으며 이외의 범위에서는 소산파(evanescent field)가 지수함수적으로 감소하여 측정의 신뢰도를 확신할 수 없다. 그러나 냄새분자 자극 후 농도에 따른 세포 반응이 확인되었으며, 발생된 SPR 신호는 후각 수용체와 냄새분자 결합 후 세포 내 신호전달에 의해 유발된 신호라 할 수 있다.

맺음말

기존의 전자코는 냄새물질과 고분자 소자간의 흡탈 착 특성을 이용하기 때문에 일부 제한된 종류와 농도 에서만 냄새분자의 측정이 가능한 한계를 안고 있다.

반면 인간의 후각수용체를 직접 사용하는 바이오 전자

코는 다양한 종류와 낮은 농도의 냄새물질 검출이 가

능하며 현재 기술상 사람의 코를 대체 할 수 있는 수준

은 아니지만, 여러 측면에서는 사람의 코가 지니지 못

한 장점을 갖는다. 즉 유독가스처럼 사람이 맡을 수 없

거나 인체에 해를 끼치는 냄새물질의 감지, 그 밖에 인

간에 의해 정확한 구분이 힘든 냄새들도 감별할 수 있

다. 또한 사람의 코는 일시적으로 냄새에 민감하지만

쉽게 피로해짐으로 인해 연속적으로 냄새 감별이 어려

운 점을 해결할 수 있다. 최근엔 사람의 호흡이나 소변

에 포함된 특정 휘발성유기화합물(volatile organic

compound, VOC)이 여러 질병, 특히 암의 지표 물질

로 활용될 가능성에 대해서 연구되고 있다. 국내 후각

센서 분야는 식품 검사 및 특정 가스 성분 검출을 위한

목적으로 제한된 분야에서 연구되고 있으며 현재로선

산업 현장이나 일상생활 중에 유해한 성분의 검출을

위한 연구가 일반적이다. 그러나 인간의 후각수용체

단백질을 이용하는 바이오 전자코에 대한 연구개발은

학문적인 가치와 더불어 많은 응용 가능성을 가지고

있다. 기술의 발전을 통해 환경 감시, 식품 신선도나

종류 감별, 질병 진단이 가능한 바이오 전자코가 가능

할 것이며, 또한 다양한 나노소자를 이용한 2차 신호전

달기의 소형화로 인해 휴대가 가능하고 뛰어난 민감도

(sensitivity)와 선택도(selectivity)를 갖는 바이오 전

자코의 개발도 가능할 것으로 기대된다.