생강(Zingiber officinale Roscoe) 에탄올 추출물의 전립선비대 억제 효과
김수정1․이정윤1․주정선2․이유현1
1수원대학교 식품영양학과
2수원대학교 스포츠과학부
Inhibitory Effects of Ginger (Zingiber officinale Roscoe) Ethanol Extract on Benign Prostatic Hyperplasia
Su Joung Kim1, Jeong Yoon Lee1, Jeong-Sun Ju2, and Yoo-Hyun Lee1
1Department of Food Science and Nutrition and 2Department of Exercise Science, University of Suwon
ABSTRACT Benign prostatic hyperplasia (BPH) is characterized by the nonmalignant hypertrophy of epithelial and stromal cells. Although the pathogenesis of BPH is not completely elucidated, it is associated with androgens, and includes increased proliferation and decreased apoptosis of cells in the prostate gland. This study investigates the effects of a 99.9% ethanol extract of Zingiber officinale Roscoe (ZOET) on the BPH-1 cell line and the testosterone propionate-induced BPH rat model. Z. officinale Roscoe was extracted with 99.9% ethanol, giving a final yield of 5%. The amounts of polyphenols and flavonoids in ZOET were determined to be 161.58±6.00 mg gallic acid equivalent/g and 71.47±1.85 mg catechin equivalent/g, respectively. Antioxidant activity was assessed using the 2,2′-azino-bis(3-eth- ylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) assay (57.15±0.62%) and the α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl assay (58.46±1.60%).
Exposure to ZOET significantly inhibited proliferation of the benign prostatic hyperplasia epithelial cell line, BPH-1.
In vivo studies were performed with seven weeks male SD rats divided into four groups: Control, BPH, ZOET 50 mg/kg, and ZOET 150 mg/kg. BPH was induced via subcutaneous injections of testosterone propionate (TP) (3 mg/kg), daily for 4 weeks after castration. ZOET was administered daily by oral gavage, simultaneously with the TP injections.
Administration of ZOET 150 mg/kg in the BPH rat model significantly reduced the prostate ratio and 5α-reductase 2 levels of prostate by 16.77% and 24.59%, respectively. DHT levels in serum were also reduced by 30.97%. The Bax/Bcl-2 ratio in prostate was increased 1.6-fold. These results indicate that the inhibitory effects of ZOET on BPH are exerted by regulation of androgens and apoptosis.
Key words: benign prostatic hyperplasia, Zingiber officinale Roscoe, dihydrotestosterone, 5α-reductase 2, apoptosis
Received 31 January 2020; Accepted 13 April 2020
Corresponding author: Yoo-Hyun Lee, Department of Food and Nutrition, University of Suwon, Hwaseong, Gyeonggi 18323, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-31-229-8194
Author information: Su Joung Kim (Graduate student), Jeong Yoon Lee (Graduate student), Jeong-Sun Ju (Professor), Yoo-Hyun Lee (Professor)
서 론
전립선은 방광의 아래에 위치하며 요도의 일부를 포함하 고 있는 남성의 생식기관이다(Aaron 등, 2016). 전립선은 노화가 진행되면서 지속해서 성장하므로 전립선비대증은 50대 남성에게 흔히 나타나게 된다(Berry 등, 1984). 전립 선이 커지면서 요도와 방광을 압박하여 야뇨증, 빈뇨, 세뇨, 요단절 등의 하부 요로증상이 동반되어 정신적, 신체적 삶의 질을 떨어뜨린다(Seok과 Yi, 2017).
통계청의 세계와 한국의 인구 현황 및 전망에 관한 보도자 료(Statistics Korea, 2019)에 의하면 2019년 우리나라 인
구 65세 이상 구성비는 14.9%이며, 기대수명은 82.7년으로 OECD 국가 중 상위국에 속하며 지속해서 상승하고 있다.
이러한 고령화 추세에 따라 전립선비대증 환자 수도 계속해 서 증가할 것으로 예상되고 있다.
전립선비대증의 병인은 아직 분명하지 않으나, dihydro- testosterone(DHT)이 중요한 요인으로 간주된다(Carson 과 Rittmaster, 2003). 고환에서 생성된 testosterone(T)은 전립선으로 유입되어 5α-reductase(5αR)에 의해 활성형 T 인 DHT로 전환된다(Carson과 Rittmaster, 2003; Roehr- born, 2008). DHT는 T보다 상대적으로 androgen recep- tor(AR)와의 높은 결합력으로 인하여 전립선 세포의 성장 및 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Carson 과 Rittmaster, 2003). AR과 DHT의 결합은 세포의 분열과 분화를 일으키며 노화될수록 전립선의 T 수준은 감소하지만, DHT는 높은 수준을 유지하는 것으로 보고되었다(Roehr- born, 2008).
전립선으로 유입된 T를 DHT로 전환하는 효소인 5αR 중
제1형은 주로 피부 및 간 등에 존재하며 제2형은 전립선과 같은 생식기관 등에 존재한다(Thigpen 등, 1993). T를 DHT 로의 전환에 관여하는 5αR의 억제제인 5α-reductase in- hibitor(5αRI)는 전립선비대증의 치료제로 사용되며, finas- teride와 dutasteride가 대표적이다(Gravas와 Oelke, 2010).
그러나 이러한 치료제의 다양한 부작용이 보고되고 있으며 (McConnell 등, 1998), 상대적으로 안전하다고 할 수 있는 산수유(Kwon 등, 2018), 분홍바늘꽃(Deng 등, 2019), 톱야 자열매(Vela-Navarrete 등, 2005) 등과 같은 다양한 천연 물이 계속해서 연구되고 있다.
본 연구에서 사용된 생강(Zingiber officinale Roscoe)은 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 다년생 식물이다. 생강은 특유의 향과 매운맛이 특징이며, 세계에서 가장 많이 소비되 는 향신료이다(Bode와 Dong, 2011). 또한 생강은 두통, 감 기, 메스꺼움 및 구토 등을 완화하는 데 사용된다(Mao 등, 2019). 생강에 포함된 생리활성에 대하여 항산화 효과(Bae 와 Kim, 2011), 항염증(Ezzat 등, 2018), 전립선암, 유방암 (Karna 등, 2012)에 대한 항암 효과 등 많은 연구가 보고되 어 있지만, 양성 전립선비대증에 대한 연구는 미흡한 실정이 다. 따라서 본 연구에서는 전립선비대 세포주와 전립선비대 증 유발 모델 래트를 이용하여 생강 추출물에 대한 전립선 건강의 건강기능식품의 소재로써 가능성을 평가하고자 연 구하였다.
재료 및 방법
생강 에탄올 추출
본 실험에 사용된 생강은 영천시에서 재배된 말린 생강을 구매하여 사용하였다(제천허브, Jecheon, Korea). 말린 생 강을 실험용 분쇄기(HM-5000, Hyundae Household Ap- pliances, Incheon, Korea)로 분쇄하여 1 kg에 4 L의 에탄 올(99.9%, w/v, Duksan, Asan, Korea)을 첨가하여 실온에 서 24시간 간격으로 용매를 교환하며 총 3회 추출하였다.
추출물은 여과지(No.1, Whatman International Ltd., Kent, UK)로 여과하여 38°C에서 감압농축 하였다(N-1200A, EYELA, Tokyo, Japan). 얻어진 농축액은 건조를 진행하여 남은 용매를 모두 제거한 후에 사용하였다. 생강의 건량 1 kg에서 약 50 g의 샘플을 얻었으며 수율은 약 5%로 나타났 다. 최종샘플은 ZOET(Zingiber officinale Roscoeethanol extract)로 명명하였으며, 사용 전까지 -70°C에서 보관하 였다.
총 폴리페놀 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin과 Denis(1912)의 방법을 변형 하여 측정하였다. 간단하게 설명하자면 희석된 시료는 Folin- Denis reagent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 를 혼합하여 실온에서 5분간 반응시킨 후에 7% Na2CO3를 가하고 90분간 방치하여 750 nm에서 흡광도를 측정(Epoch,
BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)하였다.
ZOET는 1 mg/mL의 농도로 에탄올에 제조하여 사용했으 며, 기준물질은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하 였고 결과 값은 gallic acid의 표준검량선을 그려 equiv- alent volume(µg/mL)으로 환산하여 시료 무게(g)당 gallic acid(mg) 무게로 나타내었다.
총 플라보노이드 측정
총 플라보노이드 함량은 Moreno(2000)의 방법을 변형하 여 시행하였다. ZOET를 1 mg/mL의 농도로 에탄올에 제조 하여 사용했으며, 기준물질은 catechin(Sigma-Aldrich Co.) 을 사용하였고 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 catechin의 표준검량선을 그려 equivalent volume(µg/mL) 으로 환산하여 시료 무게(g)당 catechin(mg) 무게로 나타내 었다.
DPPH 라디칼 소거능 측정
ZOET의 라디칼 소거능은 Blois(1958)의 방법을 변형하 여 측정하였다. 간단히 설명하자면 α,α-diphenyl-β-pic- rylhydrazyl(DPPH) 용액(Sigma-Aldrich Co.)은 99.9%
에탄올에 0.2 mM의 농도로 제조하여 사용하였다. 샘플 200 µL와 DPPH 용액 800 µL를 혼합하여 30분간 빛을 차단한 뒤에 515 nm에서 흡광도를 측정(BioTek Instruments, Inc.)하였다. 대조군으로 L-ascorbic acid(Showa Chemi- cal, Tokyo, Japan) 1 mg/mL의 농도로 에탄올에 제조하여 사용했으며, DPPH 라디칼 소거능 계산식은 다음과 같다.
DPPH radical scavenging
activity (%) ＝
(
1－ SampleControl)
×100ABTS 라디칼 소거능 측정
2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)(Sigma-Aldrich Co.) 라디칼을 이용한 항산 화력 측정은 Re 등(1999)의 방법으로 측정하였다. 간단히 설명하자면 ZOET는 1 mg/mL의 농도로 에탄올에 녹여 사 용했으며, 대조군으로 L-ascorbic acid(Showa Chemical) 를 1 mg/mL의 농도로 사용하였다. 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate의 농도가 되도록 용액을 제조한 후 빛을 차단하고 약 16시간 동안 방치하여 ABTS+･을 형성 시켜 사용하였다. 흡광도는 734 nm에서 측정(BioTek In- struments, Inc.)하였다. ABTS 라디칼 소거능의 계산식은 다음과 같다.
ABTS radical scavenging
activity (%) ＝
(
1－ SampleControl)
×100세포배양
본 실험에 사용된 세포주는 양성 전립선비대증의 전립선 상피 세포로부터 유래된 BPH-1(DSMZ, Braunschweig, Germany)을 사용하였다. 세포는 20% FBS(Gibco, Grand
Table 1. Experimental design of BPH-induced rats Group1) TP2) Administration Control
BPH ZOET-Low ZOET-High
− 3 mg/kg of BW/d 3 mg/kg of BW/d 3 mg/kg of BW/d
Corn oil Corn oil
ZOET 50 mg/kg of BW/d ZOET 150 mg/kg of BW/d
1)Control: corn oil (p.o.), BPH: TP (s.c.)＋corn oil (p.o.), ZOET- Low: TP (s.c.)＋Zingiber officinale Roscoe 99.9% ethanol ex- tract (50 mg/kg of BW/d, p.o.), ZOET-High: TP (s.c.)＋Zingiber officinale Roscoe 99.9% ethanol extract (150 mg/kg of BW/d, p.o.).
2)TP: testosterone propionate.
Island, NY, USA), 1% antibiotic antimycotic solution (Mediatech, Inc., Manassas, VA, USA), 20 ng/mL tes- tosterone(TCI, Tokyo, Japan), 5 µg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite, 5 µg/mL insulin이 포함된 RPMI 1640 배지(HyClone, Logan, UT, USA)를 사용하여 37°C, 5% CO2의 조건에서 배양되었다.
MTT assay
ZOET가 BPH-1 세포의 세포 증식에 미치는 영향을 알아 보기 위하여 96-well plate에 세포를 4.5×103 cells/well로 seeding 하였다. 18시간 동안 배양한 후에 1×phosphate buffered saline(PBS)으로 washing 하고, ZOET를 0, 25, 50, 100 µg/mL의 다양한 농도로 48시간 동안 처리하였다.
MTT 용액을 최종농도 1 mg/mL의 농도가 되도록 분주하고 2시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 dimethyl sulfoxide (Duksan)를 100 μL씩 첨가하여 formazan을 용해하였고, 흡광도 570 nm에서 측정(BioTek Instruments, Inc.)하였다.
실험동물 사육
본 실험에 사용된 7주령의 Sprague-Dawley(SD) 래트 (male, 200~250 g)는 Samtako Bio Korea(Osan, Korea) 로부터 분양받았으며, 실내온도 22±2°C, 상대습도 55±5
%, 12시간 명암 주기에서 사육하였다. 실험동물은 1주일의 적응기간을 거친 후에 castration이 실행되었고, 1주일의 회 복기간을 두고 실험이 개시되었다. 4주간 전립선비대증의 유발과 소재 투여가 동시에 이루어졌으며, 실험은 적응기간 과 수술을 포함하여 총 6주간 진행되었다. 본 실험은 수원대 학교 동물 실험 윤리위원회의 승인(USW-IACUC-R-2019- 002)을 받아 진행하였다.
전립선비대의 유도 및 소재 투여
래트는 적응기간을 거친 후 전립선비대 유발을 위하여 castration을 수행하고 1주일의 회복기간을 두었다. 실험군 은 다음과 같이 분류하였다(Table 1); Control군, BPH군, ZOET-Low군(50 mg/kg), ZOET-High군(150 mg/kg)의 총 4군이며 Control군을 제외한 모든 군에 castration이 시 행되었다. 전립선비대증의 유발을 위하여 Control군을 제외
한 모든 군에 4주간 testosterone propionate(TP)를 0.1 mL의 부피로 피하에 투여하였으며, 시료의 경구투여 부피 는 실험동물의 몸무게 300 g당 1 mL 투여를 기준으로 하고 ZOET를 농도별로 경구투여 하였다.
실험동물 체중 및 장기 무게
실험동물의 체중은 주 2회씩 측정되었다. Body weight gain은 처음 체중과 마지막 체중의 차이로 나타내었다. 희생 후 혈액과 장기를 수집하고, 혈청 분리를 위해 1,800×g에서 20분 동안 원심분리(MF-80, Hanil Science Industrial, Gimpo, Korea) 하였다. 수집된 장기는 1×PBS로 2회 세척 하고 물기를 제거하여 무게를 측정한 후 -70°C에서 저장하 였다.
Dihydrotestosterone (DHT) 및 testosterone (T) 분리된 혈청은 DHT 및 T 수준을 확인하기 위하여 DHT ELISA kit(BioVendor, Brno, Czech)과 T ELISA kit(Cu- sabio, Wuhan, China)을 사용하였으며, 450 nm에서 흡광 도를 측정(BioTek Instruments, Inc.)하였다. 값은 Curve expert 1.3(Hyams Development, Starkville, MS, USA) 프로그램을 사용하여 계산하였으며 백분율로 표시하였다.
5α-Reductase 2 (5αR2)
전립선 조직에 10배(w/v) 1×PBS를 가하여 균질화하고 4°C에서 5분 동안 5,000×g에서 원심분리(Sorvall® Bio- fuge stratos, Kendro Laboratory Products, Hanau, Ger- many) 한 후 상등액을 사용하여 분석하였다. 5α-Reduc- tase 2(SRD5A2)의 수준은 SRD5A2 ELISA kit(Cusabio) 으로 450 nm에서 측정(BioTek Instruments, Inc.)하였다.
값은 Curve expert 1.3(Hyams Development) 프로그램을 사용하여 계산하였으며 백분율로 표시하였다.
Real-time PCR (RT-PCR)
전립선 조직의 RNA iso(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 사용하여 mRNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다(T100TM Thermal Cycler, BioRad, Munich, Germany). 조직의 Bcl-2 및 Bax의 mRNA 발현을 확인하기 위하여 HiPi Real- Time PCR 2×Master Mix(ELPIS, Daejeon, Korea)를 이 용하여 Light Cycler 96(Roche, Mannheim, Germany)으 로 95°C에서 10분간 preincubation 후, 95°C에서 10초, 55°C 10초, 72°C에서 10초 순서로 총 40사이클의 PCR을 진행한 다음, 95°C 5초, 65°C 60초의 melting curve anal- ysis와 37°C 30초의 cooling time을 가졌다. 본 실험에 사 용된 프라이머 염기서열은 다음과 같다: Bcl-2 forward:
5′-GAG GCT GGG ATG CCT TTG TGG A-3′; Bcl-2 reverse: 5′-TTC AGG TCA GGG ATG ACC TT-3′; Bax forward: 5′-CCA GGA CGC ATC CAC CAA GAA GC-3′;
Bax reverse: 5′-TGC CAC ACG GAA GAA GAC CTC
c c b
a
0 20 40 60 80 100 120
0 25 50 100
Concentration (µg/mL)
Cell viability (%) .
Fig. 1. Effect of ZOET on viability of BPH-1 cell lines. All data was expressed as mean±SD. Different letters above the bars in- dicate statistically significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Table 2. Content of polyphenols and flavonoids and antioxidant activity in ZOET
Total polyphenols (mg GAE/g)
Total flavonoids (mg CE/g)
DPPH scavenging
(%)
ABTS scavenging
(%) 161.58±6.00 71.47±1.85 58.46±1.60 57.15±0.62 All data was expressed as mean±SD (n=3).
TCG-3′; GAPDH forward: 5′-TGG AAG GAC TCA TGA CCA CA-3′; GAPDH reverse: 5′-TTC AGG TCA GGG ATG ACC TT-3′.
통계분석
실험 결과는 mean±standard deviation(SD) 혹은 mean
±standard error(SE)로 표기하였다. 통계처리는 SPSS (Ver.20, IBM Corporation, Armonk, NY, USA) 통계 프로 그램을 사용하였으며, 실험군 간 차이는 Duncan’s multiple range test로 P<0.05 수준에서 유의차를 검정하였다.
결과 및 고찰
ZOET의 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화능 측정 ZOET의 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성은 Table 2와 같다. ZOET의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함 량은 각각 161.58±6.00 mg/g, 71.47±1.85 mg/g으로 측 정되었다. Tohma 등(2017)의 연구에서 생강 에탄올 추출 물의 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량은 약 137.5 µg/mg 및 25.1 µg/mg이었다. Ali 등(2018)의 연구에서 클로로포름 과 메탄올 용매로 추출한 생강 추출물의 폴리페놀 및 플라보 노이드의 함량은 60.34±0.43 mg/g 및 40.25±0.21 mg/g 으로 보고되었다.
ZOET의 항산화 활성을 알아보기 위하여 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였다. DPPH는 라 디칼을 생성하여 짙은 보라색을 띠지만 라디칼이 화합물에 의해 전자를 얻게 되면 탈색된다(Blois, 1958). ABTS as- say는 ABTS와 persulfate에 의하여 생성된 청녹색의 라디 칼 용액이 항산화물질에 의해 제거되어 탈색된다(Miller와 Rice-Evans, 1997). DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디 칼 소거능은 ZOET 1 mg/mL의 농도에서 58.46±1.60% 및 57.15±0.62%로 나타났다. Bae와 Kim(2011)의 연구에서 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능은 80% 에탄올 생강 추출물 250 µg/mL에서 78.3±1.8% 및 97.4±1.9%이며, Guon과 Chung(2016)의 연구에서는 70% 에탄올 생강 추출물 1 mg/
mL에서 27.5% 및 27.5%로 확인되었다.
조직 손상 및 산화 스트레스는 세포의 사멸이나 세포의 비정상적인 증식을 일으킬 수 있으며, BPH 환자의 전립선 조직에서 항산화 효소의 감소가 보고되었다(Minciullo 등, 2015). 따라서 풍부한 폴리페놀 및 플라보노이드를 함유한 식품은 전립선비대증 개선 효과가 있을 것으로 생각된다.
생강에는 폴리페놀이 풍부하게 포함되어 있으며, 진저롤 (gingerol)과 쇼가올(shogaol) 등이 있다(Ali 등, 2018; Mao 등, 2019). 생강 추출물의 폴리페놀과 플라보노이드를 측정 하고 이에 따른 항산화능을 측정한 연구에서 폴리페놀 함량 이 증가할수록 항산화능도 증가하는 것으로 나타났다(Mu- kherjee 등, 2014).
전립선비대 세포증식 억제율
전립선비대 세포주의 세포증식에 미치는 영향을 확인하 기 위하여 MTT assay를 실시하였다. BPH-1 세포에 ZOET 를 다양한 농도(0, 25, 50, 100 µg/mL)로 48시간 동안 처리 한 결과 0, 25, 50 µg/mL의 농도에서 전립선비대세포의 증 식이 농도 의존적으로 감소하였으며, 100 µg/mL의 농도에 서 50 µg/mL를 처리한 결과와 유사한 수준으로 나타났다 (Fig. 1). 따라서 전립선비대 세포주에 ZOET의 처리는 세포 증식을 유의적으로 감소시켰다(P<0.05). 전립선비대 세포 주에 ZOET를 처리하였을 때 세포증식이 감소한 것으로 보 아 전립선비대세포에 대하여 증식 억제 효과가 있는 것으로 생각된다. Kim 등(2015)의 연구에서 같은 생강과에 속하는 울금으로부터 유래하는 커큐민에서 실험동물의 전립선 부 피를 감소시키는 효과가 보고되었으며, 세포주를 이용한 in vitro 실험에서는 분홍바늘꽃 추출물을 BPH-1에 48시간 처리한 결과 세포증식이 감소하였는데 이는 분홍바늘꽃 추 출물에 포함된 페놀성 화합물이 가장 강력한 항 BPH 활성을 나타낸 것으로 보고되었다(Deng 등, 2019).
전립선비대증 유발 래트의 체중 및 전립선 무게
ZOET의 급여가 실험동물의 체중 및 전립선비대증 유발 래트의 전립선 무게 변화에 미치는 효과를 Table 3에 나타 내었다. 실험동물의 체중 변화는 실험 시작과 종료일을 측정 하고 그 차이로 나타내었다. 전립선의 크기는 전립선비대시 험에서 중요한 지표이며(Nickel, 2003) 동물시험에서 전립 선 무게를 사용하기도 한다(Kwon 등, 2018; Ub Wijer-
Table 3. Effects of ZOET on body weight (BW), prostate weight, and prostate ratio Group1) Initial BW
(g) Final BW
(g) BW gain2)
(g) Prostate weight
(g) Prostate ratio3) (g/100 g of BW) Control
BPH ZOET-Low ZOET-High
288.09±8.084) 263.64±5.02 252.18±4.84 266.62±7.70
385.53±8.24 360.11±8.90 345.12±9.15 358.54±12.08
97.44±2.80NS 96.46±7.06NS 92.94±6.10NS 91.91±10.87NS
0.58±0.01c 1.14±0.04a 1.03±0.08ab 0.96±0.06b
0.16±0.00c 0.33±0.01a 0.31±0.02ab 0.28±0.01b
1)Control: corn oil (p.o.), BPH: TP (s.c.)＋corn oil (p.o.), ZOET-Low: TP (s.c.)＋Zingiber officinale Roscoe 99.9% ethanol extract (50 mg/kg of BW/d, p.o.), ZOET-High: TP (s.c.)＋Zingiber officinale Roscoe 99.9% ethanol extract (150 mg/kg of BW/d, p.o.).
2)BW gain: final body weight (g)－initial body weight (g).
3)Prostate ratio: prostate weight (g)/ body weight (g)×100.
4)All data was expressed as mean±SE. Different letters in the same column indicate statistically significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
b ab
a
c
0 20 40 60 80 100 120
Control BPH ZOET-Low ZOET-High
DHT levels in serum (%) .
A
a a a
b
0 20 40 60 80 100 120
Control BPH ZOET-Low ZOET-High
T levels in serum (%) .
B
b
a a
b
0 20 40 60 80 100 120
Control BPH ZOET-Low ZOET-High
5αR2 levels in prostate (%) .
C
Fig. 2. Effect of ZOET on dihydrotestosterone (DHT) levels (A) and testosterone (T) levels in serum (B) and 5α-reductase 2 (5α R2) levels (C) in prostate tissue. All data was expressed as mean±SE. Different letters above the bars indicate statistically significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
athne 등, 2017). Table 3에서 체중 변화는 ZOET-Low군 과 ZOET-High군에서 Control, BPH군과 비교하여 유의적 인 차이를 보이지 않았다. 전립선 무게는 음성대조군인 BPH 군의 전립선 무게가 Control군에 비하여 유의적으로 높았다 (P<0.05). ZOET-High군은 BPH군에 비하여 15.79% 유의 하게 감소하였다(P<0.05). 체중당 전립선 비율은 BPH군이 Control군에 비하여 유의적으로 증가하였으며(P<0.05), 앞 서 확인한 전립선 무게의 증가와 함께 전립선비대가 유발되 었음을 확인하였다. 샘플 투여군 중 ZOET-High군의 전립 선 비율은 BPH군에 비하여 16.77% 유의적으로 감소하였 다(P<0.05). 전립선비대 유발 동물모델을 사용한 연구는 Kwon 등(2018)의 연구와 Deng 등(2019)의 연구에서 TP 의 투여에 따라 전립선 무게가 증가하였으며, 시료 투여에 따라 무게가 감소하는 경향을 보였다. 전립선비대증일 경우
정상인보다 전립선이 커지게 되며, 전립선비대증 치료제 중 finasteride는 전립선의 부피를 감소시킨다(McConnell 등, 1998). 이러한 전립선의 크기 변화는 전립선 무게를 측정하 여 확인하였다. 본 연구에서 래트의 전립선 무게 및 전립선 비율은 TP의 투여에 의해 증가하여 전립선비대가 유발되었 고, ZOET의 급여에 따라 감소하였다. 따라서 ZOET는 BPH 에서 전립선의 무게를 감소시킨다고 생각된다.
DHT, T 및 5αR2
전립선비대 유발 래트에 ZOET의 급여가 혈청 DHT, 혈청 T 및 전립선 조직의 5αR2 수준에 미치는 변화를 확인하기 위하여 ELISA assay를 실시하였으며 Fig. 2와 같다. Fig.
2A에서 음성대조군인 BPH군은 Control군에 비하여 혈청 의 DHT 수준이 유의적으로 증가하였다(P<0.05). ZOET-
b b
a
b
0 1 2 3 4 5
Control BPH ZOET-Low ZOET-High Bcl-2 mRNA expression . (Fold change) .
A
b b b
a
0 1 2 3
Control BPH ZOET-Low ZOET-High Bax mRNA expression . (Fold change) .
B
b b
c a
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Control BPH ZOET-Low ZOET-High
Bax/Bcl-2 ratio .
C
Fig. 3. Effect of ZOET on mRNA expression of Bcl-2 (A), Bax (B), and Bax/Bcl-2 ratio (C) in prostate tissue. All data was expressed as mean±SE. Different letters above the bars indicate statistically significant difference at P<0.05 by Duncan’s multi- ple range test.
Low군과 ZOET-High군의 혈청 DHT 수준은 BPH군에 비 하여 각각 19.97%, 30.97% 감소하였으며, 특히 ZOET- High군이 BPH군과 유의적인 차이를 보였다(P<0.05). 따라 서 ZOET의 급여가 높아진 혈청 DHT 수준을 감소시키는 것을 확인하였다.
Fig. 2B에서 BPH군은 Control군에 비하여 혈청 T 수준 이 유의적으로 증가하였고(P<0.05), BPH군과 샘플투여군 인 ZOET-Low군과 ZOET-High군에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. ZOET의 급여는 DHT의 전구물질인 T에 영 향을 미치지 않은 것을 확인하였다.
Fig. 2C는 전립선 조직의 5αR2 수준을 나타낸 결과로 BPH군이 Control군에 비하여 유의적으로 증가하였으며(P<
0.05), 특히 ZOET-High군의 5αR2 수준은 BPH군과 비교 하여 24.59% 유의하게 감소하였다(P<0.05). 5αR2는 주로 전립선에 분포하며 T를 전환하여 DHT를 생성하는 효소이 다(Thigpen 등, 1993). ZOET의 급여는 5αR2를 억제하여 DHT를 감소시켰을 것으로 생각된다.
본 연구에서 혈청의 T 및 DHT와 전립선 조직의 5αR2 수준은 음성대조군인 BPH군에서 Control군에 비하여 유의 적으로 상승하였다(P<0.05). 혈청의 T는 ZOET-Low 및 ZOET-High군이 BPH군에 비하여 유의적인 차이가 보이지 않았으며, DHT와 전립선 조직의 5αR2 수준은 ZOET-High 군이 BPH군에 비하여 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
DHT는 전립선 발달에 필수적이나, 병리학적으로 전립선을 성장시키는 점에 있어서 성인의 전립선에 부정적인 영향을
줄 수 있다(Carson과 Rittmaster, 2003). 전립선비대증 동 물연구에서 전립선비대증을 유도할 경우 DHT의 증가가 보 고되고 있으며, T를 DHT로 전환하는 5αR의 억제로 인하여 DHT 감소 및 전립선비대증이 완화되었다(Deng 등, 2019;
Kwon 등, 2018). Clark 등(2004)의 연구에 따르면 전립선 비대 환자에게 5αR2 억제제의 처방은 혈청 DHT를 감소시 켰다고 보고하였다. 본 연구 결과에서 ZOET의 급여는 전립 선 조직의 5αR2를 감소시켰으며, 그에 따른 DHT 감소로 인하여 전립선비대를 억제하였다고 생각된다.
Bcl-2, Bax 및 Bax/Bcl-2 발현
정상 전립선 조직은 세포증식과 세포고사의 균형으로 항 상성이 유지된다(Carson과 Rittmaster, 2003). Bax와 Bcl- 2의 비율은 세포의 운명과 관련이 있으며, 일반적으로 전립 선비대증에서 Bax/Bcl-2의 비율이 감소한다(Ub Wijer- athne 등, 2017). 세포고사에 관여하는 인자로 Bax 및 Bcl- 2가 있는데, Bax는 pro-apoptotic 인자로써 미토콘드리아 에서 cytochrome-c를 방출하여 세포고사를 유도한다(Fin- ucane 등, 1999). 이와 반대로 Bcl-2는 세포고사를 저해하 고 세포를 증식하도록 한다(Finucane 등, 1999). Fig. 3A에 서 Bcl-2의 mRNA 발현은 BPH군이 Control군에 비하여 유의적으로 증가하였고(P<0.05), ZOET-Low군, ZOET- High군이 BPH군에 비하여 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
Fig. 3B는 Bax의 mRNA 발현으로 BPH군이 Control군에 비하여 유의적으로 감소하였다(P<0.05). Control을 제외한
나머지 군의 Bax의 mRNA 발현은 BPH군에 비교하여 유의 적인 차이가 없었다. Fig. 3C는 Bax/Bcl-2의 비율을 나타내 었으며, BPH군이 Control군에 비하여 유의하게 감소하였 다(P<0.05). ZOET-Low군, ZOET-High군의 Bax/Bcl-2 의 비율은 각각 BPH군에 비교하여 157.41%, 160.10%의 수준으로 유의하게 증가하였다(P<0.05). 본 연구에서 Bax/
Bcl-2의 비율이 증가한 결과는 ZOET의 급여가 전립선의 세포고사를 유도하였다고 생각된다.
본 연구 결과로 전립선비대증 유발 래트의 전립선 조직에 서 Bcl-2의 mRNA 발현 증가 및 Bax/Bcl-2 비율이 감소하 였으며, ZOET의 고농도의 급여는 Bcl-2의 mRNA 발현 감 소 및 Bax/Bcl-2 비율을 증가시켰다. 전립선비대증의 세포 고사와 관련한 연구가 진행되고 있는데, 전립선비대증환자 에게 Saw palmetto 추출물의 투여는 전립선 조직에서 Bax/
Bcl-2 비율을 증가시켜 세포고사를 유도하였다(Vela-Nava- rrete 등, 2005). 또한 Ub Wijerathne 등(2017)의 연구에 서 전립선비대를 유도한 래트의 전립선 조직에서 Bcl-2 단 백질 발현이 증가하는 결과를 보였으며, 시료의 투여로 전립 선 조직에서 Bcl-2의 단백질 발현이 감소하였고 Bax의 단 백질 발현이 증가하였다.
전립선비대증을 유발한 래트에 ZOET의 급여는 전립선 무게 및 혈청의 DHT 수준 및 전립선의 5αR2 수준을 감소시 켰고, Bax/Bcl-2의 비율을 증가시켜 전립선비대 억제 효과 를 확인하였다. 전립선비대증과 관련하여 폴리페놀 및 플라 보노이드에 관한 연구가 보고되고 있으며, 코코아의 폴리페 놀이 전립선비대증을 유발한 래트의 혈청 DHT 수준과 전립 선비대를 감소시켰다(Bisson 등, 2007). 이소플라보노이드 인 genistein, biochanin A, equol과 리그난(lignan)인 en- terolactone은 전립선비대조직의 균질액에서 5αR 활성 억 제 효과를 보였다(Evans 등, 1995). Flavocoxid는 Scutel- laria baicalensis(Chinese skullcap)와 Acacia catechu (black catechu)의 플라보노이드로 전립선비대증을 유발한 래트에 급여한 결과, 전립선 조직에서 세포고사와 관련한 Bax의 단백질 및 mRNA 발현 증가, Bcl-2의 단백질 및 mRNA 발현 감소, 전립선 무게 감소 등의 효과가 보고되었 다(Altavilla 등, 2012). 생강에는 쇼가올, 진저롤을 비롯한 다양한 폴리페놀 및 생리활성물질이 포함되어 있다(Mao 등, 2019). 이러한 생강의 에탄올 추출물인 ZOET는 Table 2와 같이 풍부한 폴리페놀 및 플라보노이드를 포함하고 있 는 것을 확인하였다. ZOET의 급여는 전립선비대증을 유발 한 래트의 혈청 DHT 수준, 전립선 조직의 5αR2, 세포고사 등에 영향을 미쳤으며, 이러한 효과는 생강의 폴리페놀 및 플라보노이드에서 기인하여 전립선비대 억제 효과를 보인 것으로 생각된다.
요 약
본 연구는 생강 추출물의 전립선비대증에 대한 억제 효과를
in vitro와 in vivo에서 확인하였다. 본 실험에서 사용된 생 강 에탄올 추출물(ZOET)은 99.9% 에탄올을 사용하여 추출 하였고, 수율은 5%로 나타났다. In vitro에서 ZOET의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 161.58±6.00 mg GAE/g, 71.47±1.85 mg CE/g으로 측정되었으며, ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능은 ZOET 1 mg/mL의 농도에서 약 57.15%, 58.46%의 활성을 나타내었다. ZOET의 전립선비대세포증 식 억제 효과를 평가하기 위하여 전립선비대 세포주인 BPH- 1을 대상으로 ZOET를 다양한 농도로 처리하였고, 그 결과 유의적으로 세포증식이 감소하였다(P<0.05). In vivo에서 Control군, 음성대조군인 BPH군, ZOET를 50 mg/kg과 150 mg/kg을 급여한 군 총 4군으로 나누어 실험하였다.
ZOET-High군은 음성대조군에 비하여 체중당 전립선 비율 이 약 16.77%, 혈청의 DHT 수준 30.97%, 전립선 조직의 5αR2 수준이 24.59% 감소하였다. 또한 ZOET의 세포고사 에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Bax/Bcl-2 비율을 확인 하였으며, ZOET-High군의 Bax/Bcl-2 비율이 음성대조군 인 BPH군에 비하여 약 1.6배 증가한 것으로 나타났다. 본 연구에 사용된 생강 에탄올 추출물의 급여는 전립선 무게, 혈청의 DHT, 전립선 조직의 5αR2 수준 감소와 Bcl-2의 mRNA 발현 억제 및 Bax/Bcl-2 비율 증가 효과를 보였으 며, 이러한 결과로 보아 다양한 폴리페놀과 플라보노이드가 포함된 생강은 전립선비대증 개선에 도움을 줄 수 있을 것으 로 생각된다.
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