Genetic Authentication of Cynanchi Wilfordii Radix and Cynanchi Auriculati Radix by Using Conventional-PCR and Real-time PCR

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Kor. J. Pharmacogn.

49(1) : 55∼ 64 (2018)

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Conventional-PCR 및 Real-time PCR을 이용한 백수오와 이엽우피소의 유전자 종감별 시험법 비교

류회진*·김애경·김성단·정삼주·장정임·이희진·이정미·유인실·정 권 서울특별시보건환경연구원 한약재검사팀

Genetic Authentication of Cynanchi Wilfordii Radix and Cynanchi Auriculati Radix by Using Conventional-PCR and Real-time PCR

Hoe Jin Ryu*, Ae Kyung Kim, Sung Dan Kim, Sam Joo Jung, Jung Im Jang, Hee Jin Lee, Jung Mi Lee, In Sil Yu, and Kweon Jung

Medicinal Herb Inspection Team, Seoul Metropolitan Government Research Institute of Public Health and Environment, Gwacheon 13818, Korea

Abstract − Recently, it has been a big issue to distinguish the dried roots of Cynanchum wilfordii and C. auriculatum in health functional food market. The original plant species of Cynanchi Wilfordii Radix belong to the Asclepiadaceae family is dif- ferentially described in the national pharmacopoeia of Korea, China and Japan. Owing to the morphological similarities of the dried roots of this plant to those of C. auriculatum, which is often misidentified in Korean herbal medicine marketplace, dis- tinguishing these two species is exceedingly difficult. The purpose of this study was to compare the conventional-PCR with the real-time PCR for detection of C. wilfordii and C. auriculatum DNA. We also tried to realize a quantitative real-time PCR assay using species-specific matK primers, which allowed us to estimate the ratio of C. willfordii and C. auriculatum using varying ratios of mixed genomic DNA template from the two species. The differentiation of intentional and unintentional mixture in this study would be applied to food safety management and can be helpful for protection of consumer’s right and cul- tivators.

Keywords − real-time PCR, conventional-PCR, C_T(Cycle Threshold), Cynanchum wilfordii, Cynanchum auriculatum

한약재의 이용에 있어 정확한 기원식물을 사용하는 것은 약효 동등성을 확보하고 품질관리를 하는데 있어 기본적으 로 고려해야 할 사항이며 이러한 품질의 확보는 한약의 표 준화와 과학화를 위한 전제조건이라고 할 수 있다.^1,2) 한약 재의 감별은 성상, 이물 등의 규정에 따라 외형, 색, 맛, 냄 새 등의 형태적인 특징을 통해 감별하는 관능검사가 직접 적인 확인이 가능하고 간단하여 현장에서 널리 이용되고는 있지만 주로 감별자의 경험과 주관에 의존하는 단점을 가 지고 있다.^1,3)최근 이슈가 되었던 가짜 백수오 파동에서 보 았듯이 실제 외관을 비교해보면 백수오에 비해 이엽우피소 의 뿌리가 비대한 경향이 있긴 하지만, 겉껍질을 벗긴 후 건 조하여 사용할 경우 그 차이가 분명하지 않으므로 육안으

로 감별하기는 쉽지 않다. 이러한 단점을 보완하기 위한 방 법 중의 하나인 유전자 마커 감별법은 각각의 식물이 가진 고유의 유전자 정보를 기반으로 하고 있어 식물의 재배 기 간이나 성장 정도, 환경적 요인 등에 영향을 받지 않는 이 점이 있다.⁴⁾또한 분자생물학 및 유전자 분석 기술의 발달 로 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 통해 DNA 염기서 열 차이를 이용한 종 판별이 가능하게 되었으며 특히, 종 특 이 프라이머를 이용한 PCR법은 종간 판별은 물론 동종 내 에서의 판별이 가능한 방법으로 식품원료 진위판별 등에 이 용되고 있다.^5,7-10) 최근에는 conventional-PCR 방법보다 신 속하고 높은 검출감도로 증폭이 되며, 증폭산물을 전기영동 으로 확인할 필요가 없어 그에 따른 오염에 대한 위험성을 줄일 수 있다는 장점 때문에 real-time PCR을 활용하기도 한다.

대한민국약전외한약(생약)규격집(The Korean Herbal

*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel): +82-2-968-5089

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Pharmacopoeia)에서는 백수오의 기원식물을 박주가리과 (Asclepiadaceae)의 은조롱(Cynanchum wilfordii Hemsley)의 덩이뿌리로 명시하고 있는 반면 중국약전에는 등재되어 있 지 않고 중약대사전에서만 백수오의 기원식물을 이엽우피 소(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight) 또는 대근우피 소(Cynanchum bungei Dence)라고 정의하며, 은조롱에 관해 서는 수록하고 있지 않다.²⁸⁾ 이렇게 국가별로 수재하는 기 원종의 차이 뿐만 아니라 우리나라에서 백수오로 널리 재 배되어 온 은조롱은 지주 설치비용과 노동력이 많이 소요 되고 생산성이 낮아 농가에서 재배를 기피하여 왔는데,^5,11,12) 1990년대 초반에 수량성이 높은 이엽우피소가 중국으로부 터 도입되면서 이엽우피소를 백수오의 개량종 혹은 중국 도 입종으로 알고 재배하고 있는 경우도 있었다. 이로 인한 백 수오 혼·오용 정도는 재배단계에서 31%, 유통단계에서는 약 43% 이라는 보고도 있다.¹⁾현재 이엽우피소는 식품에 사용 할 수 있는 원료가 아니며 임신 중인 돼지가 이엽우피소 섭 취 시 유산을 야기한다는 보고가 있어 U.S. FDA는 이엽우 피소를 독성식물로 분류하였다.^5,6,16)백수오 진위판별과 관 련된 선행연구로는 하수오, 백수오, 이엽우피소를 유전자 마

커로 구분하는 multiplex-PCR 기법²⁷⁾과 종 특이 프라이머 를 이용한 판별법⁵⁾ 등 여러 연구결과가 있지만 주로 검출, 불검출 판정과 같은 정성분석에 초점이 맞추어져 있다. 아 직까지는 분쇄 가공육이나 유전자변형농산물 등과 같은 식 품에서 관리하는 혼입률에 대한 연구결과는 미비한 실정이 다. 따라서 본 연구에서는 기 구축된 종 특이 프라이머를 이 용한 conventional-PCR¹⁵⁾과 real-time PCR^13,14) 기반에서 백 수오, 이엽우피소 표준생약 2종과 유통중인 단순 건조상태 의 농산물 백수오를 대상으로 이엽우피소 혼입률 비교실험 등을 진행하고 각 시험법 간 그 효율성 및 적용 적합성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료 − 본 연구에서 사용된 백수오 및 이엽우피소 표 준생약 2종은 식품의약품안전평가원 생약연구과를 통해 기 원 및 품질규격 등이 명확한 것으로 분양 받아 사용하였으 며, 서울약령시 도·소매업소에서 백수오라는 이름으로 판매 중인 농산물 백수오 20건을 무작위로 구입하여 conventional- Table I. List of plant materials for baekshuoh used in this study

Lane No. Sample name Locality of collected samples Material used

1 Standard 1 (C. wilfordii) -^a Powder

2 Standard 2 (C. auriculatum) -^a Powder

3 Sample 1 -^b Dried Root

4 Sample 2 Yeongcheon, Gyeongsangbuk-do Dried Root

5 Sample 3 Gangwon-do Dried Root

6 Sample 4 Gangwon-do Dried Root

7 Sample 5 Yeongju, Gyeongsangbuk-do Dried Root

15 Sample 13 Yeongcheon, Gyeongsangbuk-do Dried Root 16 Sample 14 Yeongcheon, Gyeongsangbuk-do Dried Root

17 Sample 15 Sangju, Gyeongsangbuk-do Dried Root

aReceived from MFDS(Ministry of Food and Drug Safety)

bNot confirmed

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PCR 및 real-time PCR을 이용한 유전자 감별법으로 기원을 확인하였다(Table I). 표준생약은 양성대조군으로 사용하는 것 이외에도 분쇄하여 혼합하는 방법과 각각의 유전자를 추 출하여 혼합하는 비교실험에도 사용하였다.

전처리 및 유전자 추출 − 원재료 상태인 백수오는 가능 한 모든 개체의 일부가 실험용 검체로 포함되도록 하였고 믹서로 잘 분쇄한 후 50호(300 μm) 체를 통과한 중말(中末) 형태로 이용하여 시료의 균질성과 대표성을 최대한 확보하 고자 하였다. 분쇄된 시료의 혼합은 백수오를 기준으로 이 엽우피소의 혼입량을 50%, 20% 비율(w/w)로 혼합한 시료 에서 유전자를 추출하였다. 유전자 혼합방법은 백수오 및 이엽우피소 원재료에서 각각 유전자를 추출한 뒤 5 ng/μL의 농도가 되도록 희석하여 준비하고, 각 함량에 맞게 혼합하 였다. 백수오에 이엽우피소 혼합 시 50% 함량은 백수오 유 전자(5 ng/μL) 20 μL와 이엽우피소 유전자(5 ng/μL) 20 μL 를 혼합하고, 20%의 경우에는 백수오 유전자(5 ng/μL) 30 μL 와 이엽우피소(5 ng/μL) 7.5 μL를 혼합하는 방법으로 혼입 비율을 조절하였다. 그 외 20건의 백수오는 DNA 추출액을 5 ng/μL으로 희석 후 -20^oC에 보관하여 사용하였다. 시료에 서 genomic DNA 추출은 DNeasy^® Plant Mini Kit(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였고, 추출방법은 제조 사에서 제공하는 방법과 식품 중 백수오, 이엽우피소 원료 판 별 시험법^13-15)에 따라 추출하였다. 추출된 DNA는 ScanDrop (Analytik Jena, Germany)을 이용하여 260, 280 nm에서 흡 광도를 측정하고 그 양과 순도를 확인 후 최종 5 ng/μL 농 도로 희석하여 분석에 사용하였다.

conventional-PCR 및 real-time PCR 반응조건 − 각각의 PCR에 필요한 반응액 및 반응조건 등은 「식품 중 백수오, 이엽우피소 원료판별 시험법(Detection of Cynanchum wilfordii and C. auriculatum DNA using conventional- PCR & real-time PCR)」^13-15)에 따라 실험하였다. 총 3번의 시험법 개정이 있었으나 그 중에서 종 특이 프라이머를 이 용한 conventional-PCR 방법¹⁵⁾과 가장 최근에 개정된 real- time PCR 시험법¹³⁾을 비교하여 실험하였다(Table II).

각 반응 시에는 음성대조군(NTC, no template control)으

로서 주형 DNA 대신 DEPC(diethyl pyrocarbonate)-DW (distilled water)를 사용한 것과 양성대조군으로 표준생약 2 종(백수오 및 이엽우피소)에서 추출한 DNA를 분석대상 시 료와 함께 진행하였다. 또한 PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 하나의 DNA 추출액에 대하여 2~3번 반 복 시험하여 측정하였다.

1) conventional-PCR 반응 및 분석조건 − conventional- PCR을 위한 반응액의 조성은 AccuPower^® PCR PreMix (Bioneer, Korea)와 추출한 주형 DNA 20 ng/μL, 희석한 정 방향 및 역방향 프라이머(Table III) 각각 10 pmol을 혼합하 였으며, 최종 용량이 20 μL가 되도록 DEPC-DW를 첨가하 였다. 또한 백수오, 이엽우피소의 검출한계를 확인하기 위 하여 추출 DNA 20 ng/μL를 10배 단위로 희석하여 PCR 실 험을 진행하였고 백수오 종 특이 프라이머 및 이엽우피소 종 특이 프라이머 사용 조건에 따라 2회 반복실험을 하였 다. 최종 증폭 산물은 반응액 5 μL를 취하여 Eco-dye(Midori Green Advance DNA Stain)가 5 μL 첨가된 1.8~2% 아가로 즈 겔로 100V, 30분간 전기영동하였다. PCR 산물의 크기 확인은 100 bp DNA ladder(Bioneer, Korea)를 사용하였으 며, 전기영동 완료 후 UVsolo TS(Biometra, Analytik Jena) 를 이용하여 특정 증폭밴드를 확인하였다.

2) real-time PCR 반응 및 분석조건 − real-time PCR 반 응액은 백수오, 이엽우피소 및 PAC 조건에 따른 정방향 및 역방향 프라이머(Table III) 각각 10 pmol, 주형 DNA는 10 ng/μL, AccuPower^®2X GreenStar^TMqPCR Master Mix (Bioneer, Korea) 10 μL, Passive reference dye(80X ROX Dye)는 0.25 μL를 추가하여 총 반응액이 20 μL가 되도록 DEPC-DW를 첨가하였다. 유전자증폭기는 7500 Fast real- Time PCR System(Applied Biosystems, Singapore)을 사용 하여 백수오, 이엽우피소, PAC 조건 모두 단일 PCR 반응 을 수행하였다. 또한 10 ng/μL 농도의 추출 DNA 용액을 10 배 단위씩 희석하여 백수오, 이엽우피소의 검출한계를 확인 하고자 하였다. 분석결과의 판정은 PAC 프라이머를 이용한 real-time PCR 결과 C_T 값이 30 미만인 동시에, 백수오 프 라이머와 이엽우피소 프라이머를 이용한 각각의 real-time

Table II. The comparison of method and revision history for detection of Cynanchum wilfordii and C. auriculatum DNA using conventional-PCR and real-time PCR

2014. 12.¹⁵⁾ 2016. 05.¹⁴⁾ 2017. 04.¹³⁾ conventional-PCR real-time PCR

Cycles 45 40 28

Time^a 288 min 311 min 285 min

Template DNA concentration(ng/µL) 20 10 10

Gel electrophoresis 30 min - -

aminimum time required for PCR reaction

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PCR 결과 C_T값이 28 미만일 경우 해당 DNA 시료액이 양 성이라고 판단하였다. 또한 증폭 곡선의 검출에 SYBR Green I Dye를 사용하였기 때문에 융해곡선(melting curve)의 Tm 값을 확인하여 비특이적 증폭이 일어났는지 여부를 확인하 는 과정을 거쳤다.

통계분석 − 원료 혼합 방법과 추출 유전자 혼합 방법의 상관성을 조사하기 위해 50%, 20% 함량에 따른 3반복 실 험을 진행하였고 SPSS PASW Statistics 20.0 프로그램을 사 용하여 F-Test와 T-Test를 통한 시료 간 유의적 차이의 유무 를 확인하였다. F-Test를 통해 등분산 검정을 실시하고 p값 이 0.05 보다 크면 등분산으로 가정하여 T-Test를 통해 p<0.05 일 때 유의하다고 판단하였다.

결과 및 고찰

민감도 − 각각의 종 특이 프라이머를 사용하여 conventional- PCR을 수행한 결과, 비 특이적 반응이 없이 각각 147,

119 bp로 예상되는 크기의 백수오 및 이엽우피소 증폭 산물 을 확인할 수 있었다. DNA추출액을 20 ng/μL으로 정량한 후 10배씩 연속 희석하여 진행한 결과, 최적의 조건에서 백 수오는 약 2 pg/μL 수준까지 증폭밴드가 검출되었고 이엽 우피소는 이보다 높은 0.2 ng/μL 수준으로 확인되었다(Fig.

1). 이는 백수오 종 특이 프라이머를 이용한 유전자 증폭조 건이 이엽우피소 종 특이 프라이머를 이용한 조건에 비해 상대적으로 민감도와 증폭효율이 좋은 것으로 사료되었다.

real-time PCR을 이용한 방법에서도 백수오 DNA 추출액 및 이엽우피소 DNA 추출액 10 ng/μL를 가지고 10배씩 연 속 희석하여 진행한 결과 민감도는 각각 1 pg/μL, 10 pg/μL 까지 확인하였다(Table IV). 이는 conventional-PCR 시험법 보다 real-time PCR 기반의 방식이 검출한계가 낮다는 기존 결과와 유사한 경향을 보였다. 각각의 증폭곡선을 통해서는 PCR 증폭효율을 산출하였는데 X축은 DNA 농도(ng), Y축 은 C_T(Cycle Threshold)로 나타낸 그래프에서 slope를 이용 한 증폭효율이 83%~90% 수준으로 확인되었다(Fig. 2, Fig.

Table III. Information of species-specific primer used in this study

Species Primer sequence(5’→3’) Amplicons size (bp)

conventional-PCR

C. wilfordii ATA TTA TAT TCT AAA ATT AGA T

147^b CTC TAT TTC TAT TTC TAT

C. auriculatum AAA TGA ATT TAA AAA TTC AAT ACA

GTT CTA TTT CTA TTT ATT TTT AT 119^b

real-time PCR

PAC^a TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A

AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T 137^c C. wilfordii GCG TAT ATG TAG AAA CC

CAA AAA AGC CCG TAG 139^d

C. auriculatum CTT GTT CCA ATT ATT CC

AAT GAG AAA AGT TTC TG 151^d

aPAC: Positive amplification control

bpsbA-trnH: Intergenic spacer

c18S: 18S ribosomal RNA

dmatK: Maturase K

Fig. 1. Conventional-PCR results from two standard samples by PCR using Cynanchum wilfordii and Cynanchum auriculatum specific primers. (A) C. wilfordii (B) C. auriculatum, Negative Control (Lane 1), 20 ng (Lane 2), 2 ng (Lane 3), 0.2 ng (Lane 4), 0.02 ng (Lane 5), 0.002 ng (Lane 6), Size marker (M)

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3). PCR 증폭 효율(Efficiency)의 산출은 다음과 같은 식(1) 을 이용하였으며 일반적으로 80~120% 범위가 바람직하다 고 알려져 있다. C_T 값을 이용한 표준곡선의 결정계수(R²)

는 백수오 0.999, 이엽우피소가 0.9985로 나타나 표준곡선 의 linearity가 양호한 수준이었다.

Efficiency (%) = ((10^-1/slope) -1) × 100 식(1) 함량별 및 원료 혼합법에 따른 결과 − 위의 민감도 결과 에 따라 좀 더 높은 민감도를 보이는 real-time PCR 방법을 이용하여 함량별 및 원료 혼합법에 따른 결과를 비교해 보 았다. 백수오에 이엽우피소를 혼합한 시료를 50%, 20% 함 량(w/w)으로 준비하여 3반복 진행하였으며, F-Test와 T-Test 를 통해 시료 간 유의적 차이의 유무를 확인하였다. 그 결 과, 분쇄 후 원료를 혼합하는 방법과 각각의 원료로부터 추 출한 유전자를 함량에 따라 혼합하는 방법은 유의적 차이 가 없는 것으로 확인되었다(Table V).

Table IV. Sensitivity tests and C_T(Cycle threshold) value for C. wilfordii and C. auriculatum

DNA concentration (ng/µL)

C_T values

C. wilfordii C. auriculatum 10 10.67±0.09 13.48±0.15 1.0 14.02±0.14 16.84±0.10 0.1 17.41±0.00 20.90±0.40 0.01 20.97±0.17 24.81±0.23

0.001 24.89±0.18 -

All values represent mean±S.D. of triplicate determinations.

(n=3)

Fig. 2. (A) Amplification of a Species-specific Primer target gene was detected using serially diluted Cynanchum wilfordii genomic DNA with AccuPower® 2X Greenstar^TMqPCR Mas- ter Mix (B) The standard curve obtained is based on efficiency and correlation of coefficient(R²) of DNA extracted from the plant roots. All reactions were run in triplicate.

Fig. 3. (A) Amplification of a Species-specific Primer target gene was detected using serially diluted Cynanchum auriculatum genomic DNA with AccuPower^® 2X Greenstar^TMqPCR Master Mix (B) The standard curve obtained is based on efficiency and correlation of coefficient(R²) of DNA extracted from the plant roots. All reactions were run in triplicate.

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이엽우피소의 혼입률 추정 및 의도적, 비의도적 혼입 판 별 가능성 확인 − 원료 또는 추출 유전자를 대상으로 진행 한 혼합법에 따른 real-time PCR의 결과가 유의적인 차이가 없다는 결과를 바탕으로 유전자 혼합방법을 이용하여 백수 오 내에 포함된 이엽우피소 원료의 혼입률 추정과 의도적, 비의도적 혼입 판별 가능성을 확인하고자 하였다. 참고로 유전자변형농산물(GMO)은 분별유통을 하더라도 파종, 재 배, 수확, 유통과정에서 비의도적으로 GMO와 non-GMO의 혼입이 이루어지는데 이점을 감안해 표시제에서는 비의도 적 혼입치를 설정하여 운영하고 있다. EU의 경우는 0.9%, 일본과 대만은 5.0%, 우리나라는 3.0%로 관리하고 있는데 본 연구에서는 표준품종이 개발되지 않은 야생작물이라는 점을 고려하여 최대 허용치인 일본과 대만의 기준을 적용 하여 이엽우피소 비의도적 혼입 허용치를 5% 이하로 가정 하였다. 이엽우피소의 함량을 100%, 50%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1% 비율로 혼합하여 2반복 진행한 결과, 최적의 조건 에서 conventional-PCR 방법으로 2% 이상의 이엽우피소가 혼합되었을 때 이엽우피소를 검출할 수 있었고 20% 이상 에서는 혼입량에 따른 증폭 밴드의 차이가 뚜렷하게 구분 되지 않았다(Fig. 4). 하지만 real-time PCR에서는 0.5% 수 준으로 혼입되어 있더라도 검출이 가능하였으며, 각 함량에 서의 C_T(Cycle Threshold) 값을 100% 함량일 때의 C_T 값과

대조하여 그 차이를 확인한 결과, 100% 시료와의 C_T 값 차 이(ΔC_T)가 4 cycles 이내라면 10% 이상의 혼입이라고 추정 할 수 있었다. 또한 ΔC_T 값이 6 cycles 이상이라면 2% 이 Table V. The comparison of C_T(Cycle threshold) value

according to content and raw material mixing method by real-time PCR

Content (%)

C_T value Powder mixture

DNA mixture C. wilfordii

(mixed C. auriculatum)

50 21.80±0.15â 21.27±0.44â 20 23.47±0.48â 22.69±0.18â All values represent mean±S.D. of triplicate determinations.

(n=3) ^aMeans within the same row without a common letter are significantly different at p<0.05 by F-TEST and T-TEST.

Fig. 4. The conventional-PCR detection of C. auriculatum adulteration into C.wilfordii presented in ratio of 0%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 50% and 100% (A) C. wilfordii specific primer, (B) C. auriculatum specific primer(C. auriculatum adulteration ratio 0%

(Lane 1), 1% (Lane 2), 2% (Lane 3), 5% (Lane 4), 10% (Lane 5), 20% (Lane 6), 50% (Lane 7), 100% (Lane 8), Negative Control (Lane 9), Size Marker (M)

Fig. 5. Real-time PCR graph obtained with C. auriculatum DNA using C. auriculatum specific primer. (A) Quantifica- tion graphs of real-time PCR detection for C. auriculatum DNA. All reactions were run in triplicate. (B) Standard curve for C. auriculatum PCR products obtained from C. wilfordii DNA of spiked C. auriculatum DNA in the range between 0.5% (0.05 ng/µL) and 100% (10 ng/µL).

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하의 혼입으로 예상할 수 있었으며 이상의 결과를 통해 혼 입률 추정 및 의도적, 비의도적 혼입 판별가능성을 확인할 수 있었다(Table VI). 다만 함량에 따른 실험결과 100%, 50%, 20%의 이엽우피소에 대하여 real-time PCR 법으로 정

량을 하기에는 각 함량별 시료에 따른 C_T값의 차이가 매 우 작기 때문에 적용하기에는 한계가 있음을 확인하였다.

농산물로 유통중인 원재료 백수오에 대한 적용 − 상기의 결과를 바탕으로 서울약령시에서 농산물로 유통중인 백수

Table VI. Real-time PCR results(C_T, ΔC_T) according to the content of C. auriculatum Content (%) Mixed sample C_T value

mean ΔC_T^a 1^st Test 2^nd Test 3^rd Test

C. auriculatum

100

C. wilfordii + C. auriculatum

15.32 15.33 15.59 15.41 0.00

50 16.66 16.62 16.48 16.59 1.18

20 17.83 17.81 17.85 17.83 2.42

10 18.98 19.15 19.07 19.07 3.66^b

5 20.46 20.19 20.13 20.26 4.85^c

2 21.41 21.59 21.61 21.53 6.12

1 22.86 23.25 23.03 23.05 7.64

0.5 24.08 23.95 23.77 23.93 8.52

aΔCT = C_T(C. auriculatum of each content) – CT (100% C. auriculatum)

bIntentional mixture

cUnintentional mixture

Table VII. Amplification results of twenty samples using conventional-PCR and real-time PCR conventional-PCR real-time PCR

C. wilfordii C. auriculatum PAC C. wilfordii C. auriculatum

C. wilfordii Standard + - + + -

C. auriculatum Standard - + + - +

Sample 1 + - + + -

Sample 2 + - + + -

Sample 3 + - + + -

Sample 4 + - + + -

Sample 5 + - + + -

Sample 6 + + + + +

Sample 7 + - + + -

Sample 8 + - + + -

Sample 9 + + + + +

Sample 10 + - + + -

Sample 11 + + + + -

Sample 12 + - + + -

Sample 13 + - + + -

Sample 14 + - + + -

Sample 15 - + + - +

Sample 16 + - + + -

Sample 17 + - + + -

Sample 18 + + + + +

Sample 19 + - + + -

Sample 20 + - + + -

+: Target gene was detected.

−: Target gene was not detected.

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오 20건에 대해 진행한 결과, conventional-PCR 시험법의 경우에는 백수오 15건, 이엽우피소 1건 그리고 백수오와 이 엽우피소가 혼입된 4건으로 확인되었으며, real-time PCR 시험법에서는 백수오 16건, 이엽우피소 1건, 백수오와 이엽 우피소의 혼입 검체는 3건으로 판정되었다(Table VII, Fig.

6).

각각의 이엽우피소 검출률은 conventional-PCR 시험이 25%(5건/20건), real-time PCR 시험에서 20%(4건/20건)로 확인되었다(Table VII). 검출된 Sample 6, Sample 9는 이엽 우피소 100%(표준시료) 대비 C_T값 차이(ΔC_T)로 판단해볼 때 5% 미만의 이엽우피소가 혼입되었을 것으로 보이며 Sample 18은 20% 이상의 이엽우피소가 포함되어 있을 것 으로 추정되었다. 그 외 Sample 15는 백수오가 음성인 관 계로 이엽우피소 자체로 특정하여도 무방할 것으로 판단하 였다. 그러나 conventional-PCR 결과에서 증폭된 밴드를 비 교해보면 Sample 6을 제외한 나머지 4개(Sample 9, Sample 11, Sample 15, Sample 18)의 검체는 밴드의 강도나 선명도 가 비슷하여 real-time PCR에서 얻은 ΔC_T 값으로 추정한 혼입률과 연결하여 해석하기는 어려웠다. 추가로 두 시험법 간의 검출률 차이를 분석하기 위해 real-time PCR Cycle 수 를 개정 전¹⁴⁾의 40 cycles까지 증가시켰더니 conventional- PCR 시험에서만 검출되었던 1건 역시 real-time PCR법에서 이엽우피소 양성 판정을 할 수 있었다. 하지만 ΔC_T 값을 비 교하면 이엽우피소 함량 100%(표준시료) 대비 약 16 cycles 정도 차이가 나는 것으로 확인되었다(Table VIII).

고 찰

본 연구에서는 식품의약품안전처의 ‘식품 중 백수오, 이 엽우피소 진위판별 시험법’ 이라는 지침에 따라 conventional- PCR 방법과 real-time PCR 기반의 개선된 방식을 이용하여 식품의약품안전평가원으로부터 분양받은 백수오와 이엽우피 소 표준생약을 통한 시험법 비교를 해 보았다. 기 보고된^5,25,26) 결과와 유사하게 2% 이상의 이엽우피소가 혼입되었을 때 conventional-PCR 및 real-time PCR 방법에서 이엽우피소 검출이 가능한 것으로 확인되었다. conventional-PCR의 경 우 이엽우피소 혼입률에 따른 증폭밴드 유무로 최소 검출 한계는 확인할 수 있었지만 20% 이상의 혼입에 있어서는 증폭밴드의 강도나 선명도 등의 뚜렷한 차이가 없어 혼입 률 예측은 어려웠다.

real-time PCR 시험법은 cycle이 진행됨에 따라 유전자가 지수적으로 증가하며, 이론적으로 유전자간 10배 차이가 날 때 Slope이 대략 -3.32 정도이므로 약 3.3cycle의 C_T값 차이 (ΔC_T)가 생긴다.^17,18) 이는 100%, 50%, 20% 등의 함유에 따 른 차이를 정량하기에는 C_T값의 차이가 매우 작기 때문에 정확한 정량이 어렵다는 의미를 포함하고 있다.²⁰⁾ 따라서 본 연구에서는 유전자변형농산물에서 인정되는 최대 허용기준 치인 5% 이하의 혼입수준은 비의도적 혼입으로 가정하고 백수오 이외의 이엽우피소가 혼입되었을 경우 100% 이엽 우피소와 대조실험을 진행하여 C_T값의 차이(ΔC_T)로 혼입률 을 포함한 의도적 혼합과 비의도적 혼입의 판단 가능성을 Fig. 6. Conventional-PCR results from 5 samples by PCR using C. auriculatum specific primers. Negative Control (Lane 1), C. wilfordii (Lane 2), C. auriculatum (Lane 3), Sample 6 (Lane 4), Sample 9 (Lane 5), Sample 11 (Lane 6), Sample 15 (Lane 7), Sample 18 (Lane 8), Size Marker (M)

Table VIII. Real-time PCR result(C_T, ΔC_T) for five samples detected in conventional-PCR

real-time PCR 28 Cycles 40 Cycles

C_T value ΔC_T^a C_T value ΔC_T^a

Standard (C. auriculatum) 15.69±0.03 0.00 15.61±0.06 0.00

Sample 15 16.76±0.04 1.07 16.60±0.05 0.99

Sample 18 17.31±0.09 1.62 17.17±0.11 1.56

Sample 6 20.97±0.17 5.28 20.88±0.07 5.27

Sample 9 22.87±0.07 7.20 22.30±0.87 6.69

Sample 11 ND^b ND^b 31.34±0.45 15.73

All value represent mean±S.D. of triplicate determinations. (n=3)

aΔCT = C_T(Sample) – C_T(Standard of C. auriculatum)

bnot detected

(9)

확인해 보았다. 예를 들어 ΔC_T가 4 cycles 이내라면 10% 이 상의 의도적 혼입으로 보거나 ΔC_T가 6 cycles 이상이라면 2% 이하의 비의도적 혼입으로 예측할 수 있었다. 이러한 결 과를 바탕으로 백수오라는 이름으로 유통중인 원재료에 적 용한 결과, 이엽우피소가 검출된 Sample 중에서 Sample 18 은 20% 이상, Sample 6은 5% 미만, Sample 9는 2% 미만 의 혼입으로 추정할 수 있었다. 그 외 conventional-PCR 시 험에서는 검출되었지만 real-time PCR 시험법에서는 이엽우 피소가 불검출이었던 Sample 11은 PCR cycle수를 40으로 증가시켜 개정 전 판정기준을 적용하면 C_T값이 40 미만이 고 백수오 양성대조군의 C_T값 미만이기 때문에 이엽우피소 양성으로 판단이 가능하였다. 그러나 이 결과는 이엽우피소 마커(matK) 부위의 염기서열이 백수오의 미토콘드리아 내 해당부위가 존재하는 백수오가 발견되어짐에 따른 백수오 의 유전적 다양성에 기인한 real-time PCR의 위양성 결과일 가능성도 있다.¹⁹⁾ 또한 국내 재배 백수오는 표준품종이 개 발되지 않은 야생작물이기 때문에 유전적 다양성의 가능성 은 더 커질 수 밖에 없을 것으로 사료된다. 이 부분에 대한 보다 정확한 판단을 위해서는 대상 검체수를 늘리고 증폭 산물의 염기서열 분석을 통한 재확인이 필요하다고 보여진다.

한편, 혼입된 이엽우피소에 대한 정확한 정량분석을 하기 위해서는 극복해야 할 여러 가지 문제점이 있다. 첫번째로 검량선 작성용 표준시료는 기본적으로 목적 유전자의 서열 을 가지고 있는 DNA나 RNA를 사용하게 되는데 예를 들 어 plasmid DNA나 in vitro 전사 산물 등이 해당된다. 그러 나 표준시료와 실제로 측정하는 미지시료의 PCR 증폭 효 율이 일치해야 하기 때문에 극단적으로 형상이 다른 DNA 는 표준시료로서 적당하지 않다. 다시 말해 사이즈가 크고 복잡한 서열을 가지는 genomic DNA와 작은 plasmid DNA 는 같은 primer를 이용해도 PCR 반응성이 일치하지 않기 때문에 표준시료는 가능한 한 측정대상인 실제 시료의 형 상에 가까운 것이 좋다. 하지만 분석하고자 하는 대상의 순 수한 실제 표준품(CRM)을 확보해야 하는 현실적인 어려움 이 있고 표준 plasmid를 사용하여 정량을 시도하는 경우에 도 내부표준비를 알고 있어야 정확한 정량이 가능하다. 또 한 real-time PCR의 정량능력과 정확성은 DNA 추출량에 영향을 미치는 인자로서 같은 동종 식물이라도 다른 개체 에서 얻어지는 세포당 DNA의 양에 차이가 있을 수 있으므 로 DNA를 정량분석에 사용하는 것에 대한 문제는 계속해 서 제기되었으며,^21,22) 비록 유전자를 추출하는 전처리 과정 을 동일한 조건으로 유지하고 내용 구성물을 동일하게 한 다고 하더라도 유전자의 양과 순도를 일정하게 얻는다는 것 은 실현 가능성이 매우 낮을 수 있다.²³⁾ 또한 가공식품에서 의 real-time PCR을 통한 정량분석 시 전체적으로 사용된 원료보다 낮게 나타나는 경향을 보였다는 결과도 있었다.²⁴⁾ 따라서 본 연구를 통한 이엽우피소의 혼입량 추정 및 의도

적, 비의도적 혼입에 대한 판단은 참고자료로서 활용하는 것이 바람직할 것으로 생각되며²⁰⁾ 향후 추가적인 연구를 통 한 보완이 더 필요하다고 판단된다.

최근 보도된 식품의약품안전처의 이엽우피소와 백수오 안 전성 평가 결과에 따르면 백수오 분말을 사용한 동물시험 에서 일부 체중감소 등이 관찰되어 환이나 분말형태가 아 닌 열수 추출물 상태로만 사용하도록 제한한다고 밝혔다.

또한 백수오에 실제 혼입된 이엽우피소 혼입비율(3% 정도) 을 적용한 열수 추출물의 경우에도 위해 우려가 없는 것으 로 평가되었다는 결과를 내놓았다. 게다가 단순 건조된 원 형이나 슬라이스 상태로 유통되는 농산물 백수오의 경우에 는 분말이나 추출물 또는 다양한 식품원료가 포함된 가공 식품에 비해 경제적 목적 등의 이유로 미량의 이엽우피소 를 혼입하는 사례는 많지 않을 것으로 판단되므로 원재료 백수오는 기존 conventional-PCR을 이용하는 방법으로도 객 관적 판단이 가능한 수준에서 이엽우피소를 확인할 수 있 을 것으로 보인다. 이엽우피소가 검출된 시료에 대해서는 real-time PCR에서 얻어진 ΔC_T값을 활용하여 의도적, 비의 도적 혼입에 대한 간접적인 추정도 가능할 것으로 판단된다.

오랫동안 야생작물로 재배되어온 백수오의 특성상 유전 적 다양성을 완전히 배제하지 못하는 만큼 위양성 요소를 제거할 수 있는 이엽우피소만의 특이적인 마커 및 시험법 에 대한 개선이 추가적으로 마련되어야 할 것으로 생각된 다. 또한 백수오 표준품종 개발과 원료 표준화를 통해 기원 이 확실한 종자만을 보급하여 재배단계부터 철저한 관리가 필요하다고 보여진다.

결 론

백수오에 혼입된 이엽우피소 함량에 따른 비교실험 결과, 백수오에 2% 이상의 이엽우피소가 혼입되어있는 경우에는 conventional-PCR 방법과 real-time PCR 방법간의 검출률 차이가 크지 않는 것으로 확인되었다. 단, conventional-PCR 방법으로는 20% 이상의 이엽우피소 혼입시료에서 증폭밴 드의 강도나 선명도 등의 차이가 없어 혼입률 예측은 어려 웠다. real-time PCR을 이용한 의도적 혼합 및 비의도적 혼 입을 판별하기 위한 정량법 검토에서는 의도적 혼입의 경 우 100% 이엽우피소와의 C_T 값 차이가 4 cycles 이내이고, 비의도적 혼입일 경우 100% 이엽우피소와의 C_T값 차이가 5 cycles 이상이었다. 따라서 본 연구를 통하여 검토해 본 원재료 백수오에서의 의도적, 비의도적 혼입 판별법은 소비 자와 재배농가 보호에도 크게 기여할 것으로 기대된다.

인용문헌

1. Moon, B. and Kim, H. (2014) Authentication of cultivated

(10)

and commercial herbal materials of Cynanchi wilfordii Radix using molecular discrimination methods. Korean Herb. Med.

Inf. 2: 53-59.

2. Hon, C. C., Chow, Y. C., Zeng, F. Y. and Leung, F. C. C.

(2003) Genetic authentication of ginseng and other traditional Chinese medicine. Acta Phamacol. Sin. 24: 841-846.

3. Zhang, Y., Shaw, P., Sze, C., Wang, Z. and Tong, Y. (2007) Molecular authentication of Chinese herbal materials. J. Food and Drug Anal. 15: 1-9.

4. Kalpana, J., Preeti, C., Dnyaneshwar, W. and Bhushan, P.

(2004) Molecular markers in herbal drug technology. Curr.

Sci. 87: 159-165.

5. Kim, K., Kim, Y., Kim, M., Lee, H., Lee, K. H., Kim, J. H., Seong, R. S., Kang, T. S., Lee, J. and Jang, Y. (2015) Devel- opment of primer sets for the detection of Polygonum multiflorum, Cynanchum wilfordii and C. auriculatum. J. Food Hyg. Saf. 30: 289-294.

6. FDA Poisonous Plant Database. Available at: https:// www.

accessdata. fda.gov/ scripts/plantox/detail.cfm?id=11513.

7. Kocher, T. D., Thomas, W. K., Meyer, A., Edwards, S. V., Pääbo, S., Villablanca, F. X. and Wilson, A. C. (1989) Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals:

amplification and sequencing with conserved primers. PNAS.

86: 6196-6200.

8. Park, Y., Jin, S., Kim, M., Kim, K., Lee, J., Cho, T., Lee, H., Lee, S. and Han, S. (2012) Detection method for identification of Pueraria mirifica (Thai kudzu) in processed foods.

J. Food Hyg. Saf. 27: 466-472.

9. Park, Y., Jin, S., Lim, J., Kim, K., Lee, J., Cho, T., Lee, H., Han, S., Lee, S., Lee, K. and Yoon, H. (2012) Application for identification of food raw materials by PCR using universal primer. J. Food Hyg. Saf. 27: 317-324.

10. Park, Y., Lim, J., Kim, M., Park, Y., Lim, J., Hwang, C., Kim, H., Lee, J., Cho, T., Lee, H., Lee, S. and Han, S. (2012) Iden- tification of faulty red pepper powder containing seasoned red-pepper sauce. J. Food Hyg. Saf. 27: 182-187.

11. Kim, M. J., Song, B. H., Nam, S. Y., Kim, I. J., Lee, C. H.

and Yun, T. (2005) Effects of nonsupporting methods on growth and yield of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight. Korean J. Medicinal Crop Sci. 13: 268-272.

12. Kim, M. J., Kim, I. J., Choi, S. Y., Han, D. H., Kim, Y. H., Lim, S. C., Kim, T. J., Nam, S. Y., Song, B. H., Oh, B. U. and Park, C. G. (2014) Comparison of Cynanchum wilfordii, C.

auriculatum, Metaplexis japonica and Polygonum multiflorum by morphological characters. Korean J. Medicinal Crop Sci. 22: 113-120.

13.식품의약품안전처 (2017) 식품 중 백수오, 이엽우피소 원 료판별 시험법.

16. Han, J. and Luan, D. H. (1984) Sow abortion caused by feed- ing Cynanchum auriculatum. Anim Husb Vet Med Xumu yu Shouyi 16: 266.

17. Ha, S. J. (2013) Rapid detection of Clostridium difficile by real-time PCR and whole genome amplification(WGA). 국 민대학교 일반대학원 석사학위논문. p. 21.

18.신승구 (2010) Real-time PCR을 이용한 환경 미생물의 분 석 및 그 한계에 관한 보고서, DICER.

19.식품의약품안전처(2017) 식품원료진위판별분석과정, 한국 보건복지인력개발원, 청주.

20. Kim, K., Kim, M., Park, Y., Kim, Y., Lee, H., Park, Y., Kim, S. Y., Choi, J. D. and Jang, Y. (2014) Detection and differentiation of intentional and unintentional mixture in raw meats using real-time PCR. J. Food Hyg. Saf. 29: 340-346.

21. Fajardo, V., González, I., Rojas, M., García, T., and Martín, R. (2010) A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species. Trend in Food Sci. Technol. 21: 408-421.

22. López-Andreo, M., Lugo, L., Garrido-Pertierra, A., Prieto, M.I., Puyet, A. (2005) Identification and quantitation of species in complex DNA mixture by real-time polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 339: 73-82.

23. Prado, M., Fumière, O., Boix, A., Marien, A., Berben, G., Holst, C. (2009) Novel approach for interlaboratory transfer of real-time PCR methods: detecting bovine meat and bone meal in feed. Anal. Bioanal. Chem. 394: 1423-1431.

24. Min, D., Kim, M., Jung, S., Heo, M., Kim, J., and Kim, H.

(2004) Quantitative analysis of genetically modified soybean in processed foods using real-time PCR. Korean J. Food Sci.

Technol. 36: 723-727.

25.식품의약품안전처 (2015) 식품 중 백수오, 이엽우피소 원 료 판별 지침.

26.식품의약품안전처 (2015) 식품 중 이엽우피소 혼입 여부 유전자분석 지침.

27. Kim, M., Wang, H., Kim, Y., Sathiyamoorthy, S., Kwon, W.

and Yang, D. (2013) Molecular authentication by multiplex- PCR of three similar medicinal plant species: Cynanchum wilfordii, Cynanchum auriculatum and Polygonum multiflorum (Fallopia multiflorum). J. Med. Plants Research 7: 2584- 2589.

28.한의약융합연구정보센터 (2015) 백수오와 이엽우피소의 효 능 및 부작용 비교 분석 보고서.

(2018. 1. 3 접수; 2018. 2. 12 심사; 2018. 2. 23 게재확정)