ICG의 형광클립 제작을 위한 ICG와 접착제의 화학적 구조 분석

ICG의 형광클립 제작을 위한 ICG와 접착제의 화학적 구조 분석

이하은¹ · 김홍래² · 김상진² · 김광기² · 손대경^2,3

1아주대학교 화학과, ²국립암센터 의공학 연구과, ³국립암센터 대장암 연구과

Analysis of Chemical Structure of the Mixture Containing Indocyanine Green (ICG) and Polymer Adhesives - Attachment of Fluorescence Clip

and Adhesives

Ha Eun Lee¹, Hong Rae Kim², Sang Jin Kim², Kwang Gi Kim², Dae Kyung Sohn^{2, 3}

1Department of Chemistry, Ajou University, Suwon, Korea, ²Biomedical Engineering Branch, National Cancer Center, Goyang, Korea, ³Colorectal Cancer Branch, National Cancer Center,

Goyang, Korea

=Abstract=

Recently, fluorescence imaging system has shown great progress. Accurate tumor localization is essential for gastrointestinal surgery, especially in cases of early cancer. Sometimes bleeding and other side effects may occur in the surgery. To overcome this problem, fluorescence imaging device is used during surgery. Fluorescence imaging in the near-infrared (NIR) spectrum (600- 900 nm) has been observed to have great potential for the noninvasive detection of disease sites in vivo. We developed a fluorescence clip which a transparent polymer matrix containing highly bright NIR fluorochromes is coated onto. Indocyanine green (ICG) is rapidly bound to serum proteins and photochemically stabilized. The maximum absorption wavelength of the aqueous solution 760 nm rapidly increases to 840 nm. Using IR spectrometer, it was confirmed that there is a change in bond of the silicone that was different from that of latex. ICG with polar solvents (Ethanol, Dimethyl sulfoxide, Water) express fluorescence but it does not with nonpolar solvents (hexane, toluene, dichloromethane) not emit a fluorescence. We should find adhesives that include polarities and react well with ICG. Polyurethane and epoxy that include polar structures are expected to express fluorescence well. Using Spectroscopy, fluorescence was observed for both polyurethane and epoxy. Although epoxy was limited in emitting fluorescence since it disappeared and stiffened, Polyurethane was active in emitting fluorescence. Fluorescence is better expressed in Polyurethane than latex and unidus rubber. The adhesive force for Polyurethane is strong, which makes it suitable for making fluorescent clips. Coated clip fluorescence of polyurethane with

통신저자: 손대경

(10408) 경기도 고양시 일산동구 일산로 323, 국립암센터, 대장암연구과 Tel. (031) 920-1636, Fax. (031) 920-2242

E-mail: [email protected] 통신저자: 김광기

(10408) 경기도 고양시 일산동구 일산로 323, 국립암센터, 의공학연구과 Tel. (031) 920-2241, Fax. (031) 920-2242

E-mail: [email protected]

립에 부착할 수 없는 단점이 있다. 따라서 본 연구에서는 형광이 잘 나오는 결과를 가진 천연고무와 합성고무와 형 광이 발현이 되지 않는 실리콘과의 화학적 구조 차이를 분 석해 보고 ICG와 반응하여 형광이 잘 발현이 되면서도 클 립에 충분히 부착시켜 표지역할을 할 수 있는 접착제를 찾 아보고자 하였다.

Material & Method 화학적 구조 분석

IR분광기를 이용한 화학적 구조 분석

ICG가 천연고무인 라텍스(KSL 2601), 합성고무 (유 니더스사 제조 고무액) 와는 형광을 발현 하나 실리콘 (Silicone rubber base CS-020)과는 형광을 발현하지 않 는 원인을 알기 위해 화학적으로 구조분석을 하고자 여러 가지 방법을 생각해보았다. NMR, XRD를 이용하여 구조 를 분석하면 비교적 정확한 구조를 밝혀 낼 수 있으나 사 용한 시료가 기존에 나와있는 제품이므로 정확한 구조를 예상하여 알아내는 것은 어렵다. 여기서 사용된 NMR로 분석하기 위해서 시료가 용액상태여야 정확한 측정이 가 능한데 실리콘이나 라텍스는 용액상태가 아니므로 잡음 이 많이 생겨 측정이 불가능 하였다. XRD로 실험하기 위 해서는 결정성 고체 구조를 가져야 가능한데 이 조건도 충 족 시키지 못했다. 본 실험에서는 IR분광기를 이용하면 새 로 생긴 결합이나 반응하면서 없어진 결합을 각 파수에서 의 peak가 새로 생기거나 없어짐으로 파악 할 수 있으며 peak의 세기 변화 등을 통해 알아 볼 수 있으므로 IR분광 기(Thermo, nicolet iS10)를 이용하여 분석한다. 각 시료 와 ICG를 KBr pellet으로 만든다. 형광고무 밴드 제작 시 농도와 같게 비율은 100:1 정도로 한다. KBr pellet을 만 들기 위해서는 KBr 2g정도에 시료를 소량 가한 후 충분히 섞일 수 있도록 하고 pellet 형태로 만들어 준다. IR 분광 기로 관측할 경우에는 충분히 IR raser가 투과 하기 위하 여 얇게 만들 수 있도록 제작한다.

Introduction

최근 형광 기법을 이용한 영상장치를 이용하여 형광 영 상 시스템의 최적화 관련한 연구는 많이 진행되어왔다. 수 술 중 맨눈으로는 혈관이 잘 보이지 않고, 잘 못 건들일 경 우 과다출혈이나 다른 부작용이 일어날 수 있다. 이를 극 복하기 위해 영상 장치를 수술 시 이용하는데 형광을 이용 하면 가시광선 또는 이 외의 파장을 이용하여 혈관과 종 양 조직을 표시해 줄 수 있어 수술 시에는 형광 영상과 일 반 컬러 영상 두 가지를 사용한다(1). NIR영역에서는 생 체조직에 의한 빛의 흡수가 가장 적어 근적외선 파장의 빛 이 생체조직을 잘 통과한다. Indocyanine green (ICG)는 근적외선 (near infrared : NIR) 영역의 파장 760 nm에 서 흡수하여 840 nm의 파장에서 가장 밝은 형광을 발한 다. ICG는 형광영상을 이용한 수술에서 정맥주사 하여 혈 관을 관측하거나 조직 내 깊은 곳에 위치한 종양을 표시하 는데 사용한다. ICG는 수용성 물질과 반응해야 형광을 발 현 하므로 물에 희석하여 사용한다(2-7). 복강경 수술은 개복술에 비해 수술 후 통증 감소, 환자의 조기 회복, 입원 기간 단축 등 장점이 있으나 수술 중 종양 부위 및 복강 내 장기를 손으로 직접 확인 하는 것이 불가능 한 문제 점이 있다. 이를 극복하기 위해 수술 전에 이미 종양의 위치를 표시해 주는 것이 매우 중요하다. 현재 사용되는 바륨관장 법, 문신법, 수술중 대장내시경 관찰 등이 있으나, 이러한 방법 들은 복강경 시술에 적합하지 않아, 효용성 및 부작 용을 발생 시킨다(8-10). 이에, 수술 전 또는 수술 중 표 지 부위 정확한 장착 여부 확인을 실시간으로 할 수 있어 야 하며, 표지부위에 부착하였을 경우 수용성인 ICG가 체 액과 혈액에 의해 반응하지 않도록 ICG의 형광을 유지할 수 있어야 한다. ICG를 녹인 수용액과 고분자 접착제를 이용하여 클립에 붙여 형광클립을 만들려는 시도를 해보 았고 이 과정에서 천연 고무인 라텍스나 유니더스 사에서 제조된 고무와는 형광을 잘 발현 하였으나 실리콘과는 형 광이 발현이 안된 것을 관측할 수 있었다. 그러나 형광이 잘 발현된 천연고무나 유니더스 고무는 접착력이 없어 클

ICG is well expressed, the adhesion is also strong, is suitable for use in fluorescent clips. Polyurethane is difficult to manufacture because it swells up while it stiffens. We should find Polyurethane that is harmless in vivo and deforms less. We can also try to look for another adhesive or determine an ideal condition that makes the process of coating the clip easier.

Key Words: Indocyanine green (ICG); Fluorescent clip; Polar solvent; Polymer; Fluorescent guided surgery

분광광도계 (Spectrophotometer) 이용한 용매에 따른 ICG형광 강도 측정

ICG는 불안정한 상태이며 수용성 물질과 반응하여 안 정화 되면서 형광이 발현된다. 적당한 접착제를 찾기 위 해 ICG가 비극성인 용매에서는 반응할 수 없으므로 이 를 확인 하기 위하여 극성용매인 Ethanol, Dimethyl sulfoxide, 증류수와 무극성 용매인 Dichloromethane, Toluene, Hexane을 이용하여 형광강도를 관측하였다.

앞에서 진행한 실험과 비슷한 농도에서 진행하고자 하 여 각각 용매 10 ml에 증류수에 혼합하기 전 ICG가루 0.1 ml 정도의 적당량을 취하였다. 분광광도계(Tecan, safire2) 는 특정파장을 선택하여 용매를 투과하여 용매에 서 발현되는 파장에 따른 빛의 강도를 측정할 수 있다. 본 실험에서는 ICG를 사용하였으므로 760 nm의 파장을 용 액에 투과 시켰다. 무극성 용매 중 일반 플라스틱을 녹일 수 있는 용매가 있어 유리 용기에 담아 실험을 진행하였

다.

ICG와 접착제 혼합물의 형광강도 측정

형광클립을 만들기 위한 접착제는 생체 내 독성과 위해 성이 없어야 하며, 피부에 접촉할 수 도 있어 생체 적합성 이 요구되고, 수술 시 방해하지 않아야 하기 때문에 ICG 와 반응할 수 있는 극성을 띄는 접착제이며 의료용 접착 제로 현재 사용되는 시아노 아크릴레이트계, 폴리우레탄 계 접착제를 사용하고자 하였다. 제작 과정이 간편해야 하 므로 이미 출시된 제품으로 실험하였고 시아노 아크릴레 이트계 접착제(professional Eyelash glue), 폴리 우레 탄계(gorilla glue), 에폭시계 접착제(3M 주사기형 플라 스틱용 에폭시 접착제)를 선택하였다. 각 시료는 앞에서 진행된 실험의 시료의 농도와 비슷하게 ICG와 100:1 정 도의 비율로 혼합하여 confocal plate에 담아 관측하였 다. 760 nm 레이져를 만들어진 샘플에 입사 시키면 샘플 과 반응한 ICG는 840 nm의 파장에서 형광을 최대로 발

그림 1. IR 분광기로 분석한 그래프와 NIR 카메라로 촬영한 이미지, 각 시료의 구조식. (A) Silicone (CS - 020), (B) latex (KSL 2601).

A

B

현 한다. NIR영역을 관찰할 수 있는 카메라로는 영상 이 미지를 얻고 spectroscopy로는 형광강도를 측정한다.

Spectroscopy는 샘플가까이에서 관측하여야 형광이 발 현 되는 840 nm의 파장이 관측 될 수 있어 샘플과 1 cm 이내의 거리에서 관찰한다.

Results IR분광기를 이용한 화학적 구조분석

ICG의 구조는 정확히 알고 있으므로 ICG를 가지고 IR 분광기를 이용하여 분석해 보았다. ICG는 S=O, C=N 결 합을 가지고 있어 1182 cm^-1와 2415 cm^-1에서 각각의 peak이 검출되었다. Latex는 ICG와 반응할 경우 투과율 이 조금 감소 했으나 큰 차이를 보이지 않았으며, silicone 은 ICG와 반응하면 1414/cm의 peak에서 O-H 결합의 변화가 있음을 확인했다. Silicone은 구조식으로 보기에는 유기적 성질을 띄는 것처럼 보이나 실제로는 비극성이다.

ICG를 수용액 상태로 녹여 실리콘과 섞으면 실리콘이 경 화할 때 ICG와 섞인 수용액 성분이 날아가 버리고 실리콘 은 ICG와 반응하지 않아 형광을 띄지 않는다. 반면 라텍 스나 유니더스 고무는 극성구조를 가지며 실제로도 극성 을 띄므로 수용성물질과 반응하는 ICG와 형광을 잘 발현 하였다.

분광광도계 (Spectrophotometer) 이용한 용매에 따 른 ICG형광 강도 측정

ICG는 수용성 물질과 반응하여 형광을 발현하는데 수

용성물질은 극성을 띄므로 극성용매인 Ethanol (EtOH), Dimethyl sulfoxide (DMSO), 증류수 (DW)에 powder 형태의 ICG가 잘 녹았고, 형광도 잘 발현하였다. 반면 무극성 용매인 Dichloromethane (DCM), Toluene, Hexane (HX)는 증류수와 섞기 전 Powder 상태의 ICG 는 무극성 용매와 잘 녹지도 않았으며, 형광도 전혀 관찰 되지 않았다. 따라서 ICG는 극성인 물질과 만나 안정화 되면서 형광이 잘 발현 되는 것을 확인 하였다. 또한 NIR 카메라로 촬영 시 ICG의 농도가 짙은 경우 형광이 잘 관 측되지 않는 것도 확인하였다. 증류수의 경우 다른 용매와 비슷한 농도에서 관찰해보니 비교적 어둡게 나왔으나 실 험을 진행한 후에 용매의 양을 20 ml로 농도를 옅게 해보 니 형광이 더 잘 발현되는 것을 확인하였다. ICG형광 발 현도 중요하나 ICG가 적당한 농도에 있을 때 형광이 발현 되어야 NIR카메라 촬영 시 좋은 형광이미지를 관찰 할 수 있음을 확인했다.

ICG와 접착제 혼합물의 형광강도 측정

기존에 발견한 형광이 잘 발현되는 라텍스, 유니더스고 무 와 함께 시아노 아크릴레이트 접착제, 폴리우레탄 접착 제, 에폭시 접착제를 사용하여 ICG형광이 잘 나타나는지 확인하였다. 시아노 아크릴레이트계 접착제는 1분안에 경 화하며 ICG형광이 나타나지 않아서 형광클립에 사용하기 적당하지 않아 Spectroscopy로 형광강도 측정 할 때는 제외하였다. 에폭시 접착제는 경화제와 접착제가 각각 준 비 되어 있어서 접착제와 경화제를 섞어야 경화하는 접착 제였으며 ICG와 섞여 형광이 잘 발현되는 듯 보였으나 경

그림 2. 각 용매에 따른 형광영상 및 용매의 구조식 (A) Ethanol (EtOH), (B) Dimethyl sulfoxide (DMSO), (C) 증류수(DW), (D) Dichloromethane (DCM), (E) Toluene, (F) Hexane (HX)

화하는 과정에서 형광이 사라져 형광클립에 적당하지 않 았다. 또한 경화하는 과정에서 용매인 증류수가 증발을 하 여 ICG가 반응을 할 수 없는 것인지 본 실험만으로는 밝 혀내기 어려웠다. 폴리우레탄 접착제는 형광이 잘 발현 되 었으며 경화하면서 불투명한 색으로 바뀌었으며 표면이 고르지 않아 형광이 발현 될 때 난반사하여 발현되어 형광

이 매우 잘 관측되었다. 클립에도 우수한 접착력으로 접착 할 수 있어 본 실험에서 사용한 접착제 중 형광클립에 사 용하기 가장 적합하였다.폴리우레탄 접착제를 클립에 부 착하여 형광클립으로 제작해보았는데 형광이 잘나왔고 이 는 표지자로 사용하기 적합한 것을 확인하였다.

그림 3. 각 용매에 따른 형광세기 비교. ICG의 형광은 840 nm에서 최대로 발현함.

그림 4. 각 시료에 따른 형광 이미지. (A)폴리우레탄 접착제, (B) 천연고무 latex, (C) 합성고무 (유니더스사 제조), (D)에폭시 접착제, (E) 폴리 우레탄을 붙인 접착제

그림 5. 각 시료에 따른 형광세기 비교. ICG는 840 tnm에서 최대의 형광을 발현함.

Conclusion & Discussion

복강경 수술시 표지자로 사용하는 형광클립을 만들기 위해 클립과 접착이 잘되면서도 ICG와 형광발현이 잘 되 는 접착제를 찾았다. 이전에 알부민, PEG, 천연고무, 합성 고무 등과 ICG가 잘 반응하는 것을 확인하였고 silicone 은 ICG와 반응하지 않아 형광이 발현되지 않았다. 이 차 이를 알아보기 위하여 대표적으로 형광이 잘 발현되는 latex와 형광이 발현되지 않는 silicone을 ICG와 결합하 였을 때 IR분광기를 이용하여 비교해 보았는데 silicone 은 O-H 결합이 약해지거나, 없어지는 것을 확인하였다.

Silicone은 구조적으로는 유기적인 성질을 띄나 실제로는 무극성으로 ICG와 반응하지 않는다. 표지자 역할을 하기 위해 사용하는 클립은 금속으로 클립에 잘 달라 붙으려면 접착성이 있어야 하며 ICG의 형광을 잃지 않기 위해 극성 을 띄는 접착제를 찾아야 했다. 폴리우레탄은 현재 의료용 접착제로 사용되며 독성에 대한 논의는 현재 진행 중이다.

폴리우레탄은 이소시아네이트기가 하이드록시기 또는 아 민과 반응하여 우레탄 결합을 생성하므로 이를 합성하여 만든다. 폴리우레탄을 합성하여 여러 방면으로 많이 사용 하며, 여러 첨가제를 첨가하면 원하는 용도로 사용 가능하 다. 본 실험에서 사용한 폴리우레탄 접착제는 발포제 성분 이 포함되어 있어서 경화하면서 부풀어 오르는 현상이 발 생하였다. 이로 인해 접착제가 굳으면서 불투명한 색으로 바뀌고 기포가 생성되는 채로 경화하였다. 이는 형광 관측 시 난반사 조건을 형성하여 NIR카메라로 관측을 용이하 게 해줄 수 있다. 그러나 발포현상은 정형화 되지 않은 클 립의 모양을 형성하므로 발포현상이 일어나지 않는 접착 제를 사용해야 할 것으로 사료된다. 폴리우레탄이 안정적 으로 ICG와 반응하여 형광은 나타나고 있으나 인체에 무 해하면서 수술 시 방해되지 않으며 발포현상이 적은 폴리 우레탄을 적용해야 한다.

참 고 문 헌

1. K. Moreland, “Diverging color maps for scientific visualization,” in Advances in Visual Computing, G. Bebis, R. Boyle, B. Parvin, D. Koracin, Y. Kuno, J. Wang, R. Pajarola, P. Lindsrom, A. Hinkenjann, M. L. Encarnacao, C. T. Silva, and D. Coming, eds.

(Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2009).

2. Marshall MV, Rasmussen JC, Tan IC, Aldrich MB,

Adams KE, Wang X, et al. Near-Infrared Fluorescence Imaging in Humans with Indocyanine Green: A Review and Update. Open Surg Oncol J 2010;2(2):12-25.

3. Frangioni JV. New technologies for human cancer imaging. J Clin Oncol 2008;26:4012-4021.

4. Handa T, Katare RG, Nishimori H, et al. New device for intraoperative graft assessment: HyperEye charge- coupled device camera system. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2010;58:68-77.

5. Troyan SL, Kianzad V, Gibbs-Strauss SL, et al. The FLARE intraoperative near-infrared fluorescence imaging system: A first-in-human clinical trial in breast cancer sentinel lymph node mapping. Ann Surg Oncol 2009;16:2943-2952

6. Crane LM, Themelis G, Pleijhuis RG, et al.

Intraoperative multispectral fluorescence imaging for the detection of the sentinel lymph node in cervical cancer: A novel concept. Mol Imaging Biol 2010. in press. DOI: 10.1007/s11307-010-0425-7.

7. Matsui A, Tanaka E, Choi HS, et al. Real-time intra- operative near-infrared fluorescence identification of the extrahepatic bile ducts using clinically available contrast agents. Surgery 2010;148:87-95.

8. F. BARBIER AND G. A. DE WEERDT .Policlinic of Internal Medicine, University of Ghent (Belgium) : CHROMATOGRAPHY AND I.R. SPECTROGRAPHY OF INDOCYANINE GREEN (Received February gth, 1964) Clin. Chim. Acta, IO (x964) 549-554

9. Tanaka E, Choi HS, Fujii H, et al. Image-guided oncologic surgery using invisible light: Completed pre- clinical development for sentinel lymph node mapping.

Ann Surg Oncol 2006;13:1671-1681.

10. Park JW, Sohn DK, Hong CW, Han KS, Choi DH, Chang HJ, Lim SB, Choi HS, Jeong SY. The usefulness of preoperative colonoscopic tattooing using a saline test injection method with prepackaged sterile India ink for localization in laparoscopic colorectal surgery. Surg Endosc 2008;22:501-505

11. Montorsi M, Opocher E, Santambrogio R, Bianchi P, Faranda C, Arcidiacono P, Passoni GR, Cosentino F Original technique for small colorectal tumor localization during laparoscopic surgery. Dis Colon Rectum 1999;42:819-822 2376 Surg Endosc (2011) 25:2372-2377

12. Fox, I. J., Brooker, L. G. S., Heseltine, D. W., Essex, H. E., and Wood, E. H. A tricarbocyanine dye for

continuous recording of dilution curves in whole blood independent of variations in blood oxygen saturation.

Proc. Mayo Clin. 1957;32:478.

13. A Review of Indocyanine Green Fluorescent Imaging

대한의학영상정보학회지│2016;22:38-44

=초록=

최근 형광영상 이미지 시스템은 많은 발전을 이뤄왔다. 특히 위암수술이나 대장암 수술에서 내시경으로 종양 의 위치를 관측 후 형광 표지자로 표지 후 복강경 수술로 종양을 제거하는 수술기법도 개발되고 있다. 본 연구 에서는 형광 표지자를 클립 형태로 개발하여 병변부위에 쉽게 표지 할 수 있게 개발하였다. 클립에 고분자 코 팅을 하여 높은 형광 발현을 할 수 있도록 하였다. 형광시약은 인도시아닌 그린(ICG)을 사용하였다. IR 분광 기를 사용하여 ICG와 실리콘 혼합물, ICG와 라텍스 혼합물의 특성을 비교 하였으며 두 혼합물의 성질이 다름 을 확인하였다. 두 혼합물의 차이는 용매의 극성 유무로 ICG는 극성용매와 혼합하였을 때 원하는 결과를 얻 을 수 있었다. 추가로 극성용매인 Ethanol, Dimethyl sulfoxide, Water에서 형광발현이 잘 되며 비극성 용매 인 hexane, toluene, dichloromethane에서 형광발현이 잘 되지 않았다. 클립을 형광 발현시키기 위하여 폴 리우레탄과 에폭시 접착제를 ICG와 혼합하여 클립에 도포하여 관측을 하였으며 그 결과 형광 관측이 잘 되는 것을 확인하였다. 형광 클립을 사용한 정밀 수술기법 개발은 환자의 생존율 향상에 많은 도움이 될 수 있을 것 이다.

in Surgery. Jarmo T. Alander, Ilkka Kaartinen, Aki Laakso, Tommi P til , Thomas Spillmann, Valery V.

Tuchin, Maarit Venermo, and Petri V lisuo. Hindawi Publishing Corporation International Journal of

Biomedical Imaging 2012, 26