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Effect of Mitomycin-C on Experimentally Induced Urethral Stricture in Rats
Dae Eun Shin, Chul Sung Kim, Joon Rho, Hyung Yoon Moon From the Department of Urology, College of Medicine, Chosun University, Gwangju, Korea
Purpose: Urethral stricture is a fibrotic process and, although it is one of the oldest known urologic diseases, it remains a common problem with a high recurrence rate. Mitomycin-C has been reported to have anti- replication properties in animal and clinical studies. The aim of this study was to observe the intraurethral impact of the use of mitomycin-C on scar formation and fibrosis in an experimental rat model of urethral stricture.
Materials and Methods: Twelve male Sprague-Dawley rats were used.
With the animals under deep anesthesia, an internal urethrotomy was made with a cold knife. After the urethral injury, the rats were grouped randomly as follows: group 1 (control, n=4), group 2 (3 mg/l of mito- mycin-C, n=4), and group 3 (5 mg/l of mitomycin-C, n=4). The rats were sacrificed 14 days later to evaluate epithelial proliferation and fibrosis. The penile urethra was removed and histopathologically examined by H&E staining, Masson trichrome staining, and immunohistochemistry with anti-collagen type I antibody.
Results: The stained specimens were examined under a light microscope.
The extent of fibrosis and re-epithelization after urethral injury was greater in the areas with trauma than in those without. These findings were significantly reduced in the groups treated with mitomycin-C as compared with group 1, but there was no statistical difference between group 2 and group 3. Mitomycin-C treatment also prevented increases in collagen type I, whereas group 1 showed increases in collagen type I and collagen contents at the stricture site.
Conclusions: These results suggest that mitomycin-C might inhibit the renewal of the epithelium and the synthesis of collagen secreted by fibro- blasts in the affected urethra and then prevent scar formation. This raises the possibility of the use of mitomycin-C to prevent urethral stricture caused by trauma. (Korean J Urol 2009;50:805-811)
Key Words: Fibrosis, Mitomycin, Urethral stricture
Korean Journal of Urology Vol. 50 No. 8: 805-811, August 2009 DOI: 10.4111/kju.2009.50.8.805
조선대학교 의과대학 비뇨기과학교실 신대은ㆍ김철성ㆍ노 준ㆍ문형윤
Received：April 2, 2009 Accepted：July 3, 2009
Correspondence to: Hyung Yoon Moon Department of Urology, College of Medicine, Chosun University, 588, Susuk-dong, Gwangju 501-717, Korea
TEL: 062-220-3215 FAX: 062-232-3210 E-mail: mu-hn@hanmail.net This study was supported by research funds from Chosun University, 2007.
Ⓒ The Korean Urological Association, 2009
서 론
요도협착은 섬유화에 의한 반흔 조직의 형성과 요도 내 경의 감소를 야기하는 이환율이 높은 비뇨기계 질환의 하 나이다.1 그 원인은 특발성 (idiopathic), 의인성 (iatrogenic), 염증 (inflammation), 손상 (injury/trauma) 등으로 분류할 수 있고, 과거에 흔했던 임균 감염에 의한 요도협착은 감소하 였지만 교통 사고, 수술적 처치, 요도관 유치 등 손상에 의
한 요도협착의 빈도는 증가하고 있다.2 요도협착의 원인, 위 치, 정도에 따라 요도 확장술, 내시경적 내요도절개술, 레이 저, 요도관 삽입, 요도 성형술 등이 치료법으로 제시되었 다.3 요도 성형술이 성공률은 높지만 시술이 어렵고 합병증 이 많다는 단점이 있어 요도협착의 치료를 위해 내시경적 내요도절개술과 요도 확장술이 많이 시행되고 있다. 그러 나 이 치료법들은 성공률이 낮거나, 재발률이 매우 높아 효 과적인 치료는 어려운 실정이다.
정상 요도는 거짓중층원주상피로 덮여 있고, 바닥막 아
도되는 것으로 보고되었다. Streptomyces caespitosus에서 추출한 항암제인 mitomycin-C (MMC)는 섬유아세포와 상피 세포의 복제를 방해하고 콜라겐의 합성을 억제하는 특성으 로 인해 녹내장, 익상편 수술, 누낭비강 문합술, 후두 협착술 등의 치료 후 발생할 수 있는 반흔의 억제에 효과가 있음이 보고되었다.5-7 비뇨기계적으로는 DNA 합성을 억제하는 특 성을 이용하여 표재성 방광암의 치료에 MMC를 이용하였 으나,8,9 요도협착이 섬유아세포의 작용에 기인한다는 특성 은 MMC가 요도협착을 억제 또는 예방할 수 있는 가능성을 시사한다. 이에 저자들은 인위적으로 요도협착을 발생시킨 백서 실험을 통해 MMC의 효과를 알아보고자 하였다.
대상 및 방법 1. 동물 및 요도협착 수술
12마리의 생후 12주령 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 실 험에 이용하였다. Ketamine HCL (5 mg/100 g)로 복강 마취 후, 요도협착은 Ayyildiz 등10이 제시한 방법을 토대로 cold knife를 이용해 요도점막과 요도 주변의 근육, 요도해면체 조직에 손상을 만들었다. 즉, 외요도구에서 근위부 4 mm 떨어진 부위의 1시, 5시, 9시 방향에 요도내측에서 외측으 로 하였으며, 길이는 약 5 mm 정도 종방향으로 절개하였다.
각 실험동물은 무작위로 군을 나누었는데 대조군 (Group 1, n=4)은 손상 후 아무 처치도 하지 않았고, 실험군은 MMC를 3 mg/l (Group 2, n=4), 5 mg/l (Group 3, n=4)를 주입한 군으 로 분류하였다. MMC는 20 G/32 mm intravenous canule sheath를 이용해서 요도 절개 부위에 5분간 주입하였으며, 5분 뒤에 20 ml 0.9% 멸균생리식염수로 5분간 세척하였다.
MMC 처치는 그 외에는 실시하지 않았으며, 식이 및 활동 에 제약을 두지 않고 사육하였다.
2. 요도조직
손상을 유발하고 14일 후 동일한 방법으로 마취시킨 다음 앙와위 상태에서 하복부 정중절개를 통하여 음경조직을 적 출하였다. 적출한 음경 요도 조직은 4 mm 간격으로 잘라 4%
paraformaldehyde가 포함된 고정액으로 3시간 동안 고정하였 다. 고정된 조직은 통상의 수세, 탈수, 투명 등을 거쳐 파라핀 에 포매하였다. 포매된 조직은 5μm 두께의 연속절편을 만든 후 병리조직학적 검사에 이용하였다. 통상의 방법으로 파라 핀을 제거한 후 H&E 염색을 통해 조직의 전반적인 구성을 확인하였고, 삼색염색법 (Masson trichrome stain)을 이용하여
파라핀이 제거된 조직 절편을 3.0% 과산화수소로 15분간 처리하여 내인성 과산화 효소를 불활성화 하였고, 1차 항체 의 반응에 앞서 비특이적 반응을 없애기 위해 2% 소혈청알 부민 (bovine serum albumin)과 정상 말혈청 (normal horse se- rum; Vector laboratories, Burlingame, USA)이 함유된 인산염 완충식염수 (phosphate buffered saline; PBS)에 30분간 처리 하였다. 1차 항체는 토끼에서 추출한 I형 콜라겐에 대한 항 체 (polyclonal anti-collagen type I antibody, 1:500; Santa Cruz biotechnology, Inc., Santa Cruz, USA)를 사용하여 4°C에서 12 시간 처리하였다. 2차 항체의 처리는 상용화된 키트 (Imm- Press reagent, Vector laboratories)를 이용하였다. 발색반응은 0.05% diaminobenzidine (Sigma, St. Louis, USA)를 사용하였 고, hematoxylin으로 대조 염색한 후 봉입하여 광학현미경 하에서 관찰하였다.
4. 통계처리
각 군의 모든 실험동물의 조직 중 H&E 염색에서 비교적 동일한 절편을 각각 4절편씩 선택하여 통계처리에 이용하 였다 (총 16단면/group). 각 단면의 손상 부위에서 상피세포 층의 증식 정도와 섬유화 정도를 평가하기 위해 각각 상피 세포의 길이와 결합조직 층의 길이가 가장 두꺼운 부분을 SPOT FLEXⓇ (Diagnostic investment INC, USA)를 이용해 측 정하였다. 통계처리는 SPSS software를 이용했으며, 실험값 은 평균±표준편차로 표시하였다. 실험군과 대조군 간의 통 계적 유의성은 분산분석 (ANOVA)과 Student's t-test로 검정 하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계학적 의의가 있는 것으 로 판정하였다.
결 과
요도 손상이 정확히 유발되었는지는 수술 후 7일에 확인하 였다. 손상된 부위에는 많은 적혈구가 분포하고 있었고, 정상 요도에 비해 불규칙한 내강을 가지고 있었으며, I형 콜라겐은 거의 관찰되지 않았다 (Fig. 1A, 2A-C). H&E 염색 결과 대조 군 (Group 1)은 요도 내강이 잘 유지되지 않는 상태로 상피세 포 층의 세포 충실도가 높았고, 결합조직 층은 eosin에 의해 붉게 염색되었다 (Fig. 1B). 실험군 (Group 2와 Group 3)은 요 도 내강을 관찰할 수 있으면서 상피세포의 충실도가 낮았으 며, 결합조직 층이 잘 염색되지 않았다 (Fig. 1C). 그러나 각 군 사이에 결합조직 층의 세포 충실도는 차이가 없었다.
삼색 염색 결과 대조군은 수술 이후에 비해 요도 및 해면
Fig. 1. Urethral injury, which was induced by a cold knife, was confirmed by severe bleeding at the sites of urethrotomy (arrows in A) on postoperative day (POD) 7 in the preliminary study. After the urethral injury, the rats were grouped into untreated (B) and mitomycin-C (MMC, 3 mg) treated (C) groups until POD 14. The extent of fibrosis (black arrow) and re-epithelization (white arrow) was measured at the sites of urethrotomy (D and E). Less fibrosis and re-epithelization was observed in MMC-treated groups than in the untreated group, whereas there were no dose-dependent changes in the MMC-treated groups (figures not shown for MMC 5 mg group).
Scale bar (in A)=200μm in (A), (B), and (C) and 50μm in (D) and (E).
Fig. 2. Fibrosis was analyzed by Masson trichrome staining and immunohistochemistry. Collagen appeared blue by Masson trichrome stain (A, D, and G) and a greater intensity of increased deposition was seen in the untreated group 1 compared with the mitomycin-C (MMC)-treated groups. Immunohistochemistry with anti-collagen type I antibody also showed an increase in the untreated group (E and F, arrows), whereas there was less collagen type I at the time of urethral injury (B and C) and in the MMC-treated groups (H and I, arrows). Arrows in (A) indicate the sites of urethrotomy. Scale bar (in I)=200μm in (A), (B), (D), (E), (G), and (H) and 50μm in (C), (F), and (I).
체의 결합조직 층에서 강한 청색 반응을 보였고 (Fig. 2D), I형 콜라겐에 대한 면역조직화학적 염색 결과 요도의 결합 조직 층에서 분명한 양성반응을 보였다 (Fig. 2E, F). 실험군 은 대조군에 비해 약한 청색 반응을 보였고 (Fig. 2G), I형 콜라겐 면역 양성 반응은 요도 결합조직에서 약하게 관찰 되었다 (Fig. 2H, I).
요도 손상을 유발시켰던 부위에서 상피세포 층의 증식
정도와 섬유화 정도를 측정한 후 비교 분석하였다 (Table 1) (Fig. 1D, E). 대조군 (Group 1)에 비해 상피세포 층의 증 식 정도와 섬유화 정도가 각각 실험군인 Group 2에서는 18.1%, 25.6%가, Group 3에서는 15.6%, 27.4%가 각각 감소 하였다. 이 결과는 모두 통계학적으로 의의를 갖는 것이었 으나 (p＜0.01), 실험군인 Group 2와 3 사이에서는 통계학적 유의성을 발견할 수 없었다 (p＞0.05).
Table 1. The mean length of fibrosis and re-epithelization of the urethral stricture. Each length was compared with that of control group 1 and also appears as a percentage
Group Control (Group 1) MMC-3 mg/l (Group 2) MMC-5 mg/l (Group 3)
Length
Fibrosis layer Epithelial cell layer
57.0±7.8μm 47.6±7.6μm
42.4±6.2μm (−25.6%)a 39.0±4.4μm (−18.1%)a
41.4±6.4μm (−27.4%)a 40.2±2.6μm (−15.6%)a MMC: mitomycin-C, a: p＜0.01
고 찰
요도가 손상되면 염증 반응이 일어나면서 치유될 수 있 지만, 과다한 섬유화가 유발되면 해면조직의 정상 구조가 콜라겐으로 대치되면서 요도협착이 유발될 수 있다.11 우리 나라의 경우 요도협착은 20-40대 청장년층에서 흔히 발생 하며, 여러 가지 원인이 있을 수 있지만 외상에 의한 경우가 가장 많다. 최근 교통사고가 늘어나고 의술이 발전하면서 경요도적 시술이나 요도관을 유치하는 경우가 많아져 의인 성에 의한 경우도 증가하고 있다.12,13
요도협착이 발생한 부위와 정도에 따라 보존적 치료와 수술적 치료를 시도할 수 있다.14 보존적 치료로는 증상이 나타났을 때마다 또는 주기적으로 요도 확장술을 시행하거 나 단계적으로 요도관을 유치하는 방법이 있다. 그러나 중 증의 요도협착이 발생했을 때는 요도 천공이나 누공이 발 생할 수 있고, 요도 확장술의 경우 시술 중 심한 통증이 발 생하거나 잦은 요로감염이 있을 때는 시행할 수 없다는 단 점이 있다. 수술적 치료는 크게 내시경적 내요도절개술과 요도 성형술로 나눌 수 있는데, 요도 성형술이 더 높은 성공 률을 보이지만 복잡하고 수술 술기가 어려워 자주 시행하 지 못하고 있다. 내시경적 내요도절개술은 기술적으로 쉽 고 반복시행이 가능하며 출혈, 요실금 등의 합병증이 적어 현재 완전 요도협착의 경우를 포함한 대부분의 요도협착에 서 일차적 치료방법으로 시행하고 있다.15-17 그러나 내시경 적 내요도절개술 후에도 재발률이 높아 추가적인 시술이 필요한 경우가 많다. 보조 치료의 일환으로 triamcinolone, transforming growth factor beta oligodeoxynucleotide, re- combinant adenovirus와 retrovirus gene transfer, 요도 풍선 확 장술 등이 시도되고 있다.18,19 그러나 그 기전과 효과에 대 해 명확히 밝혀지지 않았다.
한편 안과 및 이비인후과 질환의 경우 절개가 필요한 시 술 후 MMC를 적용하여 콜라겐 합성을 억제하였다는 보고 가 있었다.5-7,20-22 요도협착에 대한 형태 계측학적 연구에 의 하면 손상을 받은 협착 부위의 섬유화 영역이 증가하는데,
콜라겐의 증가 또는 콜라겐 아형의 변화에 의해 협착이 야 기된다고 하였다.23 최근 실험적으로 요도협착을 유발한 후 MMC를 적용한 결과 섬유아세포의 증식이 억제되어 콜라 겐의 침착이 현저히 감소하였고,10 요도협착 환자를 대상으 로도 내시경적 내요도절개술 후 MMC를 적용한 결과 재발 률을 현저히 감소시킬 수 있었다는 보고가 있었다.24 본 실 험에서는 우리나라에서 녹내장 수술 시 사용한 용량을6 기 준으로 요도협착을 유발한 쥐의 요도에 MMC를 적용하였 다. 그 결과 대조군에 비해 MMC를 처치한 실험군에서 상 피세포와 섬유아세포의 증식이 현저히 감소한 것을 발견할 수 있었다. 콜라겐 침착은 요도협착이 유발된 군에서 증가 되었으며, 동시에 I형 콜라겐이 증가한 것을 확인할 수 있었 다. 이와 같은 콜라겐의 변화는 MMC를 적용한 군에서는 현저하게 나타나지 않았다. 이상의 결과는 MMC가 세포의 분열을 억제하고, 동시에 콜라겐 합성을 억제하여 요도협 착을 예방할 수 있음을 보여준다. 특히 MMC 적용군에서 관찰되는 I형 콜라겐의 감소는 I형 콜라겐 합성 억제제인 halofuginone을 적용하여 요도협착을 예방하였다는 보고25 와도 일치하는 것이었다.
요도협착은 다양한 원인에 의한 손상 후 회복 과정에서 반흔 조직이 과다하게 발생하면서 요도강의 구경이 줄어든 상태이다.1 정상 조직은 손상에 반응하여 재상피화 과정이 나타난다 하더라도 콜라겐 침착이나 반흔의 형성은 동반되 지 않는 것이 특징이다.26 요도협착이 형성된 후 일차 치료 방법으로 사용되는 내시경적 내요도절개술을 시행하면 상 피세포의 연속성이 소실된 후 일반적인 염증 반응에 의한 회복을 유도할 수 있다. 이 때 재상피화가 상처 부위의 수축 이 일어나기 전에 완성되면 재협착은 발생하지 않는다고 알려져 있다.1 이런 관점에서 본 실험에서 관찰된 MMC의 효과는 의미를 갖을 것으로 생각한다. 즉, MMC를 처치하 면 섬유아세포의 증식이 억제되고, 섬유아세포로부터 콜라 겐의 합성이 저해되며, 결과적으로 상처의 수축과 협착과 같은 반응이 억제될 수 있다. 또 세포의 재생능력이라는 관 점에서 볼 때 섬유화에 비해 재상피화가 먼저 완성될 수 있을 가능성도 제시한다. 더욱이 본 실험에 사용된 MMC의
사, 재협착 등과 같은 다양한 부작용도 보고되었다. 이 들은 모두 수술 과정이나 요도관의 유치과정에서 요도가 손상 받아 점막 아래로 요도 해면체가 노출되어 거짓 통로 가 만들어진 상태에서 MMC의 부작용이 나타난 경우였다.
따라서 기존의 위험 요소를 확인하고 MMC를 적용한다면 부작용을 줄일 수 있을 것으로 생각한다. 또 용량에 따른 차이가 거의 없었기 때문에 MMC 용량을 최소화 한다면 약 물 자체에 의한 부작용을 최소화 할 수 있을 것으로 생각한 다. 향후 부작용에 대한 연구가 더 진행된다면 MMC가 요 도협착의 예방에 유용한 보조 요법으로 사용될 수 있을 것 으로 생각한다. 그러나 본 연구가 정상요도에 MMC를 적용 하였을 때의 결과가 포함되지 못한 점이 본 논문에 제한점 으로 생각되며, 이 문제는 추가 실험을 통해 확인해야 할 것으로 여겨진다.
결 론
실험적으로 백서에 만든 요도협착 모델에 MMC를 주사 한 결과, MMC가 손상을 받은 요도에서 상피세포와 섬유아 세포 증식을 억제하였고, 그 결과 I형 콜라겐의 합성이 억제 되었으며 재상피화와 상처의 수축을 억제함으로써 요도협 착의 재발을 방지할 수 있었다. 이상의 동물 실험의 결과는 MMC가 수상 후 발생할 수 있는 요도협착의 예방을 위한 보조 치료 약제의 하나로 고려할 수 있음을 시사한다.
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