J. of Korean Orthopaedic Research Society V o l u m e 5 , N u m b e r 1 , A p r i l , 2 0 0 2
반코마이신을 흡착시켜 혈액으로 겉입힘한 탈석회화 해면골로부터의 반코마이신의 유리
서울대학교 의과대학 정형외과학교실
유기형・임수택・김희중
= Abstract =
In Vitro Release of Vancomycin from Vancomycin-loaded Demineralized Bone Coated with Hematoma
Kee Hyung Rhyu, M.D., Soo Taek Lim, M.D., and Hee Joong Kim, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, Seoul College of Medicine, Seoul, Korea Intellectual Biointerface Engineering Center, Seoul National University, Seoul, Korea
Purpose : This study was performed to find a method to utilize demineralized bone matrix as a vehicle for local delivery of the antibiotics for the treatment of chronic osteomyelitis.
Materials and Methods : Bovine bone blocks with the same size were randomly divided into 4 groups.
Using demineralization and hematoma coating, the different characteristics were given to each group, and van- comycin was adsorbed to these bone blocks. We performed two identical experiments with phosphatebuffered saline and fetal bovine serum as a solute. We exchange the solution with 24-hour interval for 6 weeks. The eluted concentrations of vancomycin at each week were measured.
Results : Regardless of the solution used, the eluted concentration of vancomycin was significantly higher in demineralized and hematoma-coated group than those of other groups. The eluted concentration of vancomycin were 22.6μg/ml at week 6 in saline condition and 12.4μg/ml at week 5 in serum condition.
Conclusions : We thought that demineralized and hematoma-coated cancellous bone can be used as a good vehicle for local antibiotics delivery.
Key Words : Cancellous Bone, Demineralized, Hematoma Coating
※ 통신저자 : 김 희 중
서울시 종로구 연건동 2 8번지 서울대학교 의과대학 정형외과학교실 Tel : 02) 760-2368, Fax: 02) 764-2718 E-mail: oskim@snu.ac.kr
*본 연구는 과기부・한국과학재단지원 우수연구센터“지능형 생체 계면공학 연구센터”의 연구수행 결과임.
서 론
만성 골수염은 정형외과 영역에 있어 가장 치유 하기 힘든 질환 중의 하나로, 여러 번의 수술을 필요로 하는 경우가 많다. 이 경우 치료를 위하여 항생제를 사용한 골 시멘트( P M M A )를 이용한 단계적 수술법이 그간 널리 시행되고 있으나1 , 3 , 4 , 7 1 0 )
, 이 방법은 열에 안정한 항생제만을 이용할 수 있고, 제거를 위한 이차 수술이 필요하다는 단점 이 제기되어 왔다. 그런 이유로, 제거가 필요 없 고, 항생제의 선택이 제한되지 않는 해면골을 항 생제의 전달 매개체로 이용하려는 시도가 있었다
6 , 8 , 9 , 1 2 ). 그러나 해면골을 이용한 항생제의 전달 체
계는, 항생제가 해면골의 표면에 단지 흡착되어 있기 때문에 유리 속도가 빠르고, 예측이 불가능 하다는 단점이 있어 그 장점에도 불구하고 널리 이용되지 않고 있는 실정이다.
본 연구에서는 항생제의 전달 물질로서의 해면 골의 단점을 극복하기 위한 방법으로, 흡착되는 항생제의 양을 증가시키기 위해 해면골을 탈 석회 화 시키고, 항생제를 흡착시킨 탈 석회화 해면골 을 혈액으로 겉입힘하여 생체 적합한 방벽을 만들 어 항생제의 유리를 조절하고자 하였다.
연구재료 및 방법 1. 재료
5×5×5 m m크기의 동결 건조 시킨 우형 해면 골편( S u r g i b o n eⓇ, Unilab Surgibone Inc., C a n a d a )을 이용하였다. 항생제는 염화 수소 반 코마이신(Donga Pharmaceutical, Seoul, K o r e a )을 구입하여 사용하였고, 페하가 7 . 4로 조절된 인산완충 식염수액(Phosphate Buffered
Saline: PBS)과, 우형 태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS, HyClone, Utah, USA)을 유리 용액으로 이용하였다.
2. 항생제 함유 골편의 제작
P B S와 F B S에서의 항생제 유리에 각각3 2개의 골편을 8개씩 4개의 군으로 무작위로 분류하여 사용하였다. PBS에서의 유리에 사용된 골편의 무게는 평균 7 9 . 2±5.6mg (70.3-88.1mg)이었 고, FBS에서의 항생제 유리 실험에 사용된 골편 의 무게는 평균 6 6 . 9±4.9mg (59.7-81.3)이었 다. 각각의 실험에서 각 군간에 사용된 골편의 무 게에는 유의한 차이가 없었다 (p=0.698 in PBS, p=1.000 in FBS).
네 군으로 분류한 후 각 골편에 일련 번호를 부 여하여 제조 과정 중 섞이는 것을 방지 하였다.
탈석회화 군(제 I군과 제 I I군)에 속하는 골편들은 0.5N HCl 용액에 24 시간동안 담가 탈석회화를 시켰다. 24시간이 지난 후 이들 골편을 꺼내어 페 하가 7 . 4에 이를 때까지 P B S로 세척하였다. 이 후 90% 에틸 알코올에 6 0분, 100% 에틸 알코올 에 3 0분 동안 담가 놓은 후 2 4시간 동안 공기 중 에서 탈수 시켜 탈석회화를 완료하였다.
항생제의 흡착을 위해 네 군의 골편 모두를 각 각 1 2 5 m g / m l의 포화 반코마이신 용액 800 μl가 들어있는 48 well plate에 담가 1 0 0 m m H g의 진 공 상태로 2 4시간 동안 흡착시켰다. 이후 탈 석회 화 여부와 상관 없이 모든 골편을 동결 건조 시킨 후 각각의 무게를 측정하였다.
I군과 I I I군에 해당하는 골편들은 사람의 신선 정맥혈 속에 3시간 동안 담가 혈액 겉입힘을 시행 하였다. 위의 과정 후 결정된 각 군의 성상은 Table 1과 같다.
Table 1. The characteristics of bone blocks in each group
Group Characteristics
I Demineralized Cancellous Bone coated with Hematoma
II Demineralized Cancellous Bone
III Undemineralized Cancellous Bone coated with Hematoma
IV Undemineralized Cancellous Bone
3. 항생제의 유리
실험 전 과정동안 무균 조작법을 이용하였다.
위에서 제작된 4개군의 골편을 1 m l의 P B S와 F B S가 각각 들어있는 48 well plate에 넣어 2 4 시간 동안 3 7℃의 항온 배양 용기에 보관 하였다.
이후 2 4시간 간격으로 6주간, 골편들을 새로운 P B S와 F B S가 담긴 well plate로 옮겨 담았다.
전일에 유리되었던 남겨진 용액은 추후의 반코마 이신 농도 측정을 위해 영하 2 0도로 냉동 보관하 였다. 첫 2 4시간 동안 유리된 용액이 담긴 w e l l p l a t e를 1일로 표기하고, 같은 방법으로 4 2일째 까지의 검체를 보관하였다.
4. 농도의 측정 및 통계
유리된 반코마이신 농도의 측정은 TDx 기기 (Abbott Laboratories Inc, Abbott Park, IL, USA)를 이용한 형광 편광 면역학적 검정을 이용하였다. 측정 가능한 최저 농도는 0 . 6μg / m l 이었다. 측정 방법과 시기, 시약에 따른 오차를 줄이기 위해 전 용액을 영하 2 0도에 보관 하였다 가 동일한 시약을 이용하여, 제 1, 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42일의 검체를 측정하였다. 측정 시 혈색소에 의한 측정 농도의 오차를 배제하기 위해 혈액을 입힌 군의 용액은 모두 원심 분리하여 상 층액만을 이용하였다.
통계적 분석으로는 전체 골편의 무게 및 흡착 항생제 양의 분석에 A N O V A법이, 각 군간의 항
생제의 유리 농도 및 추이 분석에 K r u s k a l - W a l l i s와 M a n n - W h i t n e y법이 이용되었다.
결 과
항생제 흡착 전의 건조상태의 골편의 무게와 항 생제 흡착 후 동결 건조한 무게와의 차이로 얻어 진, 골편에 흡착된 반코마이신의 양은 각 군별로 각각 18.2mg, 17.8mg, 12.1mg, 6.7mg으로, 탈 석회화한 군( 1 8 . 0±3 . 1 m g )과 그렇지 않은 군 ( 9 . 4±4.9mg) 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있었다( p = 0 . 0 0 1 ) .
탈석회화나 혈액 겉입힘의 여부, 사용된 용액의 종류와는 상관 없이 네 군 모두에서 첫 1주일 간 은 항생제의 유리가 매우 급속도로 이루어졌다.
그러나, 그 평균 유리 농도와 속도에는 차이가 있 어, 첫 날의 혈액 겉입힘한 군(I, III군)의 두 용 액에서 검출된 농도의 평균은 P B S에서 2 9 5 8 . 0μ g / m l와 F B S에서 2 1 9 1 . 9μg / m l로 혈액 겉입힘하 지 않은 군(II, IV군)의 평균 농도인 P B S에서의 9 0 2 1 . 7μg / m l와 F B S에서의 4 3 0 5 . 9μg / m l에 비 해 유의하게 낮았으며(p=0.000, 0.001), 시간에 따른 농도의 감소도 혈액을 입힌 군에서 유의하게 서서히 일어났다(p=0.000). 반면 혈액을 겉입힘 한 제 I군과 제 I I I군간의 사이에는 유리 속도의 유의한 차이는 발견되지 않았다( p = 0 . 2 4 0 ) .
가장 오랫동안 항생제가 검출되었던 제 I군에서 는 P B S에서 4 2일에 평균 2 2 . 6μg / m l이, FBS에 서는 평균 3 . 0μg / m l이 검출되었다(Tables 2, 3 ) .
Table 2. Average concentration of vacomycin (μg/ml) released in PBS
Group\day 1 5 7 14 21 28 35 42
I (DH) 2005.2 812.9 590.6 301.2 179.8 66.7 37.5 22.6
±799.6 ±128.3 ± 47.8 ± 64.0 ± 28.5 ± 28.9 ± 24.6 ± 16.0
II (D) 10274.2 629.0 477.8 78.1 7.8 0 0 0
± 1379.3 ± 68.4 ±84.2 ± 28.2 ± 5.1
III (UH) 3910.0 1036.6 439.7 83.0 15.5 2.1 0 0
±2558.9 ±186.2 ± 82.7 ± 42.0 ± 16.8 ± 4.3
IV (U) 7769.2 21.4 9.4 0 0 0 0 0
±1715.0 ± 5.9 ±15.0
*D: demineralized, H: hematoma coating, U: undemineralized
P B S를 매개 용액으로 사용한 연구에서, 통계적 분석이 가능한 2 8일째까지의 탈석회화한 군과, 탈석회화하지 않은 군의 평균 검출 농도는 7, 14, 21, 28일에서 유의한 차이가 있었으며( p = 0 . 0 0 0 , 0.002, 0.004, 0.004), 혈액 겉입힘한 군과, 혈 액 겉입힘하지 않은 군간에는 전 기간동안에 유의 한 차이를 보였다(제 5일째의 p = 0 . 0 2 4를 제외하 고는 모두 p=0.001, Fig. 1, 2).
고 찰
1 9 4 7년 De Grood가2 ) 골수염 환자에게 페니실 린을 섞은 자가 해면 골편을 이식하여 좋은 결과 를 얻었다는 임상 시험을 보고한 이래, 항생제를 함유한 해면 골편을 이용한 실험실 또는 임상 연 구가 보고된 바 있다6 , 8 , 9 , 1 2 ). 이들의 보고를 종합하 면, 해면 골편은 그 자체가 골 유도 및 전도능력 을 가지고 있어, 제거를 위한 수술이 필요치 않다는 Table 3. Average concentration of vacomycin (μg/ml) released in FBS
Group\day 1 5 7 14 21 28 35 42
I (DH) 2154.9 634.4 308.6 127.9 64.6 21.1 12.4 3.0
± 389.6 ± 238.5 ± 152.2 ± 90.5 ± 52.9 ± 30.4 ± 22.9 ± 9.9
II (D) 3029.3 207.2 54.5 0 0 0 0 0
± 751.4 ±110.7 ± 44.3
III (UH) 2194.3 581.6 245.7 73.9 24.5 2.3 0.8 0
±492.9 ±180.0 ±95.6 ± 36.5 ± 22.4 ±5.6 ± 2.0
IV (U) 5510.3 421.4 34.3 0 0 0 0 0
± 2084.1 ± 327.9 ± 55.5
*D: demineralized, H: hematoma coating, U: undemineralized
Fig. 1. The average concentrations of released Van- comycin in PBS
Fig. 1.There was a significant difference in the average concentration between demineralized (DH+D) and undemineralized (UH+U) groups at days 7, 14, 21 and 28(p<0.05). The difference between hematoma coated (DH and UH) and uncoated (D and U) groups was also significant at days 1, 5, 7, 14, 21, and 28 (p<0.05).
Fig. 2. The average concentrations of released Van- comycin in FBS
Fig. 2.The rate of vancomycin release in FBS was a lit- tle faster than that in PBS. Total amount of released vancomycin from a bone block was smaller compared with the release in PBS.
장점은 있으나 실험 및 임상 실험의 결과 모두 초 반의 유리가 너무 빠르고 효과적인 농도가 지속되 는 시간이 길어야 8일 이하인 단점을 가지고 있다.
만성 골수염의 치료에서 부골의 절제를 포함한 충분한 변연 절제술은 대부분의 경우 큰 골 결손 을 남기게 되며, 따라서 만일 좀 더 장기간의 항 생제의 유리가 가능하기만 하다면 해면골이야말로 가장 이상적인 항생제의 국소 전달 물질이라 할 수 있다. 본 연구에서는 흡착된 항생제의 양을 늘 이기 위한 방법으로 해면 골편을 탈 석회화시켜 다공성을 증가시키고5 ), 포화된 항생제 용액을 진 공 상태에서 흡착 시킨 후 전체를 동결 건조시키 는 방법을 생각하였고, 유리의 속도를 조절하기 위해 생체 적합한 물질을 표면 처리하여 생물학적 방벽으로 이용하는 방법을 고안하였다.
본 연구의 결과 이전의 해면 골편을 이용한 항 생제의 유리 실험1 2 )보다 훨씬 긴 기간동안 비교적 높은 농도의 유리가 가능하여, 적절한 탈 석회화 로는 골편에 흡착되는 항생제의 양을 늘일 수 있 고, 혈종 등의 생체 적합한 물질로의 표면 겉입힘 은 골편으로부터의 항생제의 유리 속도를 충분히 늦추어줄 수 있다는 가설을 뒷받침해 줄 수 있는 것으로 생각된다.
예비 실험에서, 반코마이신의 용해도가 P B S보 다는 F B S에서 더 낮은 현상을 관찰한 후 F B S에 서의 유리가 P B S에서 보다 더 서서히 일어날 것 을 예상하였으나, 실험의 결과는 그 반대로 도출 되었다. 그 이유에 대해서 정확한 규명은 이루어 지지 않았으나 몇 가지의 인자가 작용했으리라 생 각된다. 첫째로는 실험 대상의 차이이다. PBS 환 경에서 사용된 것과 동일한 골편을 구하는 것이 불가능하여, FBS에 사용된 골편은 먼저의 실험 에서 사용하고 남은 골편 중 무게의 편차가 가장 적은 골편들을 선택한 관계로 P B S에서 사용된 골편의 무게 보다는 유의하게 적었다. 이는 동일 조건으로 탈석회화된 경우 무게가 무거운 군에서 의 유리가 더 오래 지속될 수 있다는 것으로 생각 되며, 이것은 후에 따로 이루어진 실험의 결과에 서 확인되었다. 두 번째로는 탈석회화가 동일하게 시행되었음에도 불구하고 F B S에서 사용된 골편 들의 탈석회화 후의 무게 감소가 P B S에서 사용 된 골편들보다 현저히 작았던 점으로 보아 탈석회
화가 유의하게 덜 된 점도 한 요소로 작용하였으 리라 생각된다.
이러한 결과로 볼 때 해면 골편을 탈석회화하고 혈종을 포함한 생체 적합한 물질로 겉입힘한 경우 한 번의 수술 후 만성 골수염을 치료하기에 적절 하다고 알려진 기간 동안1 1 ), 국소 조직에 치료 농 도 이상의 항생제를 효과적으로 전달할 수 있을 것이라 생각된다.
그러나 아직은 초기 1주일 간의 항생제의 유리 농도가 너무 높고 유리 속도 또한 너무 급속하여, 다른 생체 적합 물질 등을 이용하여 초기 유리를 조절하는 방향의 연구 및 다양한 항생제를 이용한 유리 연구, 그리고 실험 동물을 이용한 생체 연구 등이 요구된다.
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