Enhancement of Anticancer Activities of Ephedra sinica Stapf Extracts by Nano-encapsulation

마황 추출물의 나노 입자화를 통한 항암 활성 증진

정향숙*·김승섭*·오성호*·정명훈*·최운용*·서용창*·나천수***·곽형근****·이현용*^,**^†

*강원대학교 생물소재공학과, **강원대학교 생명공학연구소, ***생명의나무, ****스카이007

Enhancement of Anticancer Activities of Ephedra sinica Stapf Extracts by Nano-encapsulation

Hyang Suk Jeong

^*

, Seoung Seop Kim

^*

, Sung Ho Oh

^*

, Myoung Hoon Jeong

^*

, Woon Yong Choi

^*

, Yong Chang Seo

^*

, Chun Soo Na

^***

, Hyeong Geun Kwak

^****

and Hyeon Yong Lee

^*,**†

*

Dpartment of Biomaterials Engineering, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea.

**

Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea.

***

Tree of Life, Seodun-dong, Kwonsun-gu, Suwon 441-853, Korea.

****

SKY007, Daejeon-dong, Kangneung 210-340, Korea.

ABSTRACT : This study showed the increase of antitumor activities of water soluble ^{E. sinica} extract by nano-encapsula- tion process with lecithin. Five groups of lecithin only group (LO), lecithin nano-encapsulated ^{E. sinica} group (LE), ^{E. sinica} only group (EO), one negative control group (NCO) and positive control group (PCO) were set for several anticancer exper- iment and fed into Sarcoma-180 injected mice. The cytotoxicity of LE on the human normal kidney cell (HEK293) showed 14.8% lower than 19.2% of EO and 18.4% of LO. Growth of human liver carcinoma cell and human stomach carcinoma cell as representative of digestive system ^{in vitro} was inhibited up to about 85.1% and 87.3%, in adding 1.0 ^㎎ / ^㎖ of LE, which values 15% higher than that from conventional EO. The survival rates of each mice group were 40%, 63%, 48%, 33% and 100%, respectively after 40 days of injecting Sarcoma-180. The increment of their body weights of the extract feed- ing groups was suppressed down to 10~15%, compared to the negative control. The nano-particles also reduced the hyper- trophy of the internal organs such as spleen and liver down to 15~20%, compared to those as the other groups. Among them, LE effectively reduced the size of tumor form to 20%. From these results, ^{in vitro} and ^{in vivo} antitumor activities of ^{E. sinica} could be enhanced by using nano-encapsulation process with lecithin because of better permeation into the cancer cells by confocal observations.

Key Words : Nano-encapsulation, Ephedra sinica Stapf, Antitumor Activities, Lecithin

서 언

마황은 중국 북부 , ^{몽골 등지에 주로 분포하는 길이가} 30~70 ^{㎝ 인 한약재로서} ephedrine, pseudoephedrine, ephed- roxane, norephedrine ^{등 체액성 면역과 관련된 물질에 의해}

교감신경계 자극에 영향을 주는 것으로 알려져 있다 . 주로 천 식치료 및 열병을 다스리는데 쓰이고 있으며 (Lee et al ., 2005) 발한 , 해열 , 항염증에 효과가 있다고 보고되었다 (Song and Lee, 2006). 이외에도 최근에는 마황의 미백활성과 관련된 연구 (Kim, 2008) 및 알러지성 피부염 억제 효과에 대해 보 고되어진 바 있다 (Shin and Kim, 2005).

한편 , 한약재들은 알려진 뛰어난 효능에 비해 체내에서 그

역할을 다하지 못하는 것이 사실이다 . 최근 한약재의 유용성 분을 체내 특정 부분에 표적화 하여 응용하고자 하는 시도

(Li et al ., 2009) 와 함께 나노기술을 이용한 약물전달시스템

(DDS : Drug Delivery System) ^{이 세포치료분야에서 혁신적인}

변화를 가져올 것으로 전망됨에 따라 (Youn et al ., 2008), ^전

달체에 대표적인 항종양제인 독소루비신을 봉입하여 효능 및 효과를 최적화하는 연구 (Lee and Yoo, 2008) 및 복분자와 같은 천연물을 고분자로 포집한 후 나노 입자화하여 면역 활 성을 평가하는 연구 (Han et al ., 2009) 등이 활발하게 진행 되고 있다 .

나노입자 (10

⁻⁹

m) ^{는 인체에 쉽게 침투할 수 있기 때문에 순}

환을 통하여 각기 다른 신체 부위로 전달되며 , 특히 100 ㎚

†

Corresponding author: (Phone) +82-33-250-6455 (E-mail) [email protected]

Received 2010 April 3 / 1st Revised 2010 May 7 / 2nd Revised 2010 May 20 / Accepted 2010 May 26

이하의 소수성 표면을 갖는 리포솜은 분자성 약물의 운반을

용이하게 하여 세포에 대한 친화성이 증가하게 된다 (Mertins

et al. , 2005). 하지만 인체의 내피세포는 인지질로 구성되어

있어 수용성 성분이 침투하기 어려운 구조로 되어 있다 . 따라 서 수용성 물질의 세포내 침투 효율 향상을 위해서 활성물질 을 레시틴의 유상이 포집한 리포솜 형태로 제조하고 이를 생 체에 적용시켜 높은 침투력 및 생체활용성을 나타내고자 하는 연구가 많이 진행되고 있다 (Kim and Kwak, 2004).

본 연구에서는 식품과 천연물 중 암의 발생을 억제 또는 지연하거나 항암보조기능 성분들이 다수 포함되어 있다는 것 을 밝혀낸 다양한 연구 결과 (Jin et al., 2008; Ha et al.,

2009) 를 근거로 보통 열수추출 방법을 통해 얻은 마황 추출

물을 생체적합성 고분자 소재인 레시틴으로 나노 입자화하여

in vitro 및 in vivo 활성을 비교함으로써 항암효과를 알아보 았다 . ^{최근 마황의 각성 작용으로 인해 마황이 뛰어난 항암}

활성 등의 유용한 기능을 가짐에도 불구하고 그 이용이 제한 적이다 (Marchei et al., 2006; Deventer et al., 2007). 이 에 본 연구에서는 적은 양의 추출물로도 세포 수준에서 최적 의 효과를 낼 수 있는 나노의 가치를 재평가하고 , 더 나아가 이러한 항암 효과를 극대화시킬 수 있는 기능성 소재와 관련 된 분야에 활용하기 위한 기초 자료로 이용하고자 마황 나노 포집물의 다양한 분석 연구 및 세포 투과 관찰 실험을 수행 하였다 .

재료 및 방법

1. ^{실험재료 및 추출방법}

본 실험에 사용된 마황은 경동시장에서 2009 년 국내산을 건 시료로 구입하여 음지의 상온에서 보관하면서 사용하였다 . ^마

황 50 g ^{을 수직 환류 냉각기에 부착된 추출} flask ^{에 시료 중}

량에 대하여 10 배의 증류수를 추출용매로 사용하여 60 ℃에서

24 시간 추출하였다 . 얻어진 추출물을 감압여과장치 (Rotary Vacuum Evaporator N-N series, Eyela, Germany) 로 여과하 여 농축을 하였고 , 동결건조를 한 후에 파우더를 얻어 실험에 사용하였다 (Jeong et al ., 2009).

2. ^{나노입자 제조 및 확인}

나노 입자화를 통한 항암활성 증진효과의 탐색을 위해 천연 항암 효과가 기대되는 마황 추출물 (Park et al., 2004) 을 이 용해 nanoparticle 을 제조하였다 . 우선 마황 60 ℃ 물 추출 시 료 50 ㎎을 1 ㎎ / ㎖의 농도로 증류수에 녹였다 . 그리고 레시 틴 (L- α -phosphatidylcholine, Sigma, USA) 을 둥근바닥플라스 크에 넣어 chloroform (Sigma, USA) ^{으로 녹였고} , ^{이후 감압}

회전상태에서 유기용매를 모두 날려 multilayer ^{를 형성시켰다} .

완전히 건조되어 다층의 layer 가 형성된 둥근바닥플라스크에

액상의 마황 추출시료를 넣고 , ^{초음파 분산기} VCX500 (Sonics & Materials Inc., USA) ^{를 이용하여 상온에서} 2 ^시간

동안 균질화시켜 수용성 나노입자를 제조하였다 (Fallouh et al , 1986). 본 실험에서 레시틴만 나노 입자화 한 것은 LO 로 ,

마황 나노 추출물 레시틴 나노 입자는 LE 로 , 마황 추출물은

EO 로 , 음성대조군은 증류수로써 NCO 로 , 양성대조군은 대표 적인 항암제인 Taxol (Sigma, USA) 로써 PCO 로 각각 표기하 였다 (Kim and Lee, 2001; Sandoval et al, 2002).

나노 입자의 분포 및 확인을 위해 사용된 장치는 TEM (Transmission Electron Microscopy) 이고 , 나노 입자의 크기를 알아보기 위해 사용된 장치는 DLS (Dynamic Light Scattering, Benthos, USA) 이다 . TEM 은 나노입자 한 개를 크게 확대하여 관찰하는 것도 가능하기 때문에 입자의 모양 , 입자의 크기 등 을 결정하는데 효과적으로 사용될 수 있다 . TEM 사진을 찍기 위해서 phosphotungstic acid solution ^{을 이용하여} negative

staining ^{을 하였다} . ^{나노 입자가 충분히 염색이 된 후} ,

formvar/carbon 으로 코팅된 grid 에 얇게 펴서 말린 뒤 EF- TEM (LEO 912AB OMEGA, Carl Zeiss, Germany), 120 kV 에서 관찰 하였다 (Saxena et al ., 2005).

3. ^시약

세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640 ^{을 사용하였고} , ^{그 밖}

에 배양에 필요한 시약으로 hepes buffer (Sigma, USA) 와

fetal bovine serum (Gibco, USA), gentamycin sulfate (Sigma, USA), trypsin-EDTA (Sigma, USA) 를 사용하였다 . 4. ^{세포주 및 실험동물}

실험에 이용된 세포주로는 추출물 및 나노입자의 정상 세포

에 대한 독성을 알아보기 위해 인간 신장 세포인 HEK293

(Kidney normal, Human, ATCC, USA) ^{를 이용하였고} , ^세포

수준의 항암 활성을 평가하기 위해 인간 유래 간암 세포인

Hep3B (Hepatoma adenocarcinoma, Human, ATCC, USA),

인간 유래 위암 세포인 AGS (Stomach adenocarcinoma, Human, KCLB, Korea) 를 이용하였다 . 모든 세포는 RPMI 1640 배지에서 10% heating-inactivated FBS (fetal bovine serum) ^{으로 적응시켜 배양하여 실험에 이용하였다} .

In vivo 실험에 사용된 실험동물은 오리엔트바이오

(KOREA) 로부터 4 주령의 ICR (Female, 22~24 g) 마우스를 구입하여 온도 20~25 ℃ , 습도 55 ± 10% 가 유지 가능한 사육 실에서 각 군별로 8 마리씩 일주일간 안정기를 취한 후 사용하 였다 . 12 시간 간격으로 점등하였으며 , 멸균된 고형 사료와 식 수를 자유 급식하였다 . 마우스에 접종된 세포주는 Sarcoma- 180 (ATCC, USA) ^{로 복강 내에서} 6~7 ^{일 간격으로 계대 배양}

하여 사용하였다 .

5. ^{나노입자의 정상세포독성 및 항암 활성 측정}

마황 나노입자의 정상세포독성 및 항암 활성 측정을 위해 사용된 SRB (Sulforhodamine B) assay 는 세포 단백질을 염 색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법이다 . 실험에 사 용된 세포주는 인간 신장 유래 정상세포인 HEK293 과 소화계

장기 유래의 대표적인 암인 간암세포 (Hep3B), 위암세포

(AGS) 였다 . 세포의 농도가 4~5×10

⁴

cells/ ㎖ 가 되도록

NucleoCounter

^TM

(Cell counting device, New Brunswick, USA) ^{를 이용해 세포수를 세었고 적정 농도로 배지희석을 한}

후 , 96well plate 의 각 well 에 100 ㎕ 씩 분주하였다 . 24 시간 동안 배양 (37 ℃ , 5% CO

2

incubator) 한 후 , 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎ / ㎖가 되게 100 ㎕ 씩 세 포가 배양된 배지에 첨가 분주하여 48 시간 동안 다시 배양하 였다 . 배양이 완료된 후에 상층액을 aspirator 를 이용해 제거하 였고 , ^차가운 10% (w/v) TCA (trichloroacetic acid) 100 ^㎕

를 가하여 4 ^℃에서 1 ^{시간 동안 방치하여 세포가 더 이상 자라}

지 못하게 하였다 . 증류수로 5 회 반복 세척하여 TCA 를 제거 하고 실온에서 plate 를 건조한 뒤 각 well 에 1% (v/v) acetic acid 에 녹인 0.4% (w/v) SRB 용액을 100 ㎕ 씩 첨가하고 상 온에서 30 분 동안 염색시켰다 . 결합되지 않은 SRB 염색액은

1% acetic acid 로 5 회 정도 세척 , 건조시킨 후에 10 mM Tris buffer 100 ^{㎕를 첨가하여 염색액을 녹여냈다} . Micro reader (Molecular Devices, Thermo max, USA) 를 이용하여 540

㎚에서 흡광도를 측정하였다 . Selectivity 측정은 SRB assay 를 이용하여 정상세포 (HEK293) 에 대한 각 sample 농도에서 세

포독성을 측정하고 , SRB assay 를 이용하여 각 암세포주의 생

육억제활성을 측정한 후 각 농도에서의 세포 독성에 대한 암 세포 생육 억제 활성의 비로 selectivity 를 계산하였다 (Dol and Peto, 1981).

6. Sarcoma-180 ^{복수암 및 고형암에 대한 in vivo 항암}

효과 측정

Sarcoma-180 ^세포를 10% heating inactivated FBS ^{를 함유}

한 RPMI 1640 의 기본 배지에서 배양하였다 . Cell scraper (Biocompare, UK) 로 배양 flask 로부터 cell 을 분리한 후

2×10

⁶

cells/ ㎖의 농도로 조절하여 200 ㎕를 마우스 복강에

1 ㎖ syringe 를 이용하여 피하이식 하였다 . 상기의 방법으로 마 우스 복강 내에서 6~7 일 간격으로 계대배양을 통해 보존된

sarcoma-180 세포를 취하여 복수암 실험군 마우스의 복강과

고형암 실험군 마우스의 왼쪽 대퇴부 근육에 200 ^{㎕ 씩 피하}

이식 하였다 . 종양세포 이식 후 21 일 동안 시료의 농도를 100

㎎ / ㎖로 조절하여 매일 동일한 시간에 0.5 ㎖ 씩 경구 투여

하였다 . ^{양성대조군인} Taxol ^{은 이미 효능이 알려진 약물이므}

로 추출물의 농도 대비 20 ^{배 희석된} 5 ^㎎ / ^{㎏의 농도로 제조}

하여 마황 시료와 동일한 조건에서 매일 1 회분씩 나누어 투여 하였다 (Bárdos et al., 2003). 40 일간 3 일 간격으로 복수암 유발 마우스의 체중을 측정하였고 , 생존율 (survival rate) 을 측 정하였으며 , 고형암 유발 마우스에서 종양 세포 이식 40 일 후 희생시켜 고형암과 비장 및 간의 무게를 측정하여 체중에 대 한 장기의 중량을 측정하였다 (Jung et al., 2002; Kim et al., 2007).

S : Mean survival days of treated mouse C : Mean survival days of control mouse

C : The average tumor weight of control / The average body weight of control

S : The average tumor weight of treated group / The average body weight of treated group

7. Confocal ^{현미경으로 세포 투과 관찰}

나노시료 첨가에 의한 면역세포 B cell (Raji) 의 분포양상을

공초점 레이저 주사 현미경 LSM510 META NLO (Carl

Zeiss Jena GmbH, Germany) 으로 관찰하였다 . 나노입자 제조 를 위해 초음파 분산을 시작할 때 , dye ^로 FITC (fluorescein isothiocyanate) ^{를 넣어줌으로써} fluorescence tagging ^하였다 . 1 ㎖의 면역 B 세포 2 × 10

⁸

cells/ ㎖을 CO

2

농도 5%, 30 ℃의

incubator 에서 배양한 후 , FITC 로 염색된 나노시료 (1 ㎎ / ㎖ ) 100 ㎕와 1 시간 동안 반응시켰다 (Lee et al., 2007).

8. ^통계처리

SPSS program (ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)

의 T-test ^{로 검정하였으며 모든} data ^{는 평균 ± 표준오차} (Mean ± standard error) 로 나타내었다 .

결과 및 고찰

1. ^{나노입자의 확인}

Fig. 1 ^{과 같이 레시틴으로 포집한 마황 추출물 나노입자} LE

는 50~200 ㎚ 의 범위로 형성된 것을 알 수 있다 . 평균

200 ㎚ 인 세포 간극의 크기를 고려한다면 제조된 나노입자는 암세포에 효과적으로 적용 가능한 제형이라고 생각된다 . 이는

Selectivity = ^{암세포 생육 억제 활성}

정상 세포의 세포 독성

Survival rate (%) = ^{S −} _C ^C × 100

Tumor growth inhibition ratio (%) = ^C _C ^{− S} × 100

기존 대장암 세포의 나노입자 투과를 물리학적 접근을 통해 밝혀낸 연구 결과와 비교해 의미가 있다 (Lochner et al., 2003). 또한 나노입자가 모두 깨지지 않고 70% 이상 그대로 피크를 이루며 detection 된 결과를 바탕으로 , 이는 기존의 복 분자 추출물을 나노 입자화 하여 항산화 효과 및 미백 활성을 측정했던 결과와 비교해 (Jeong et al., 2009) 천연물이 나노 입자화 공정을 통해 적은 양으로도 높은 생리 활성 증진 효과 를 낼 수 있음을 알 수 있다 . Fig. 2 는 TEM 으로 촬영한 마 황 레시틴 나노입자의 모습이다 . 구형의 나노 입자들은

negative staining 에 의해 하얗게 보인다 . 염색에 사용한

phosphotungstic acid 는 수용성 부분을 염색시키므로 지질이 포함되어 있는 나노 리포솜 바깥부분은 염색이 되지 않아 하 얗게 보인다 . ^{제조된 나노 입자는 수용성 추출물을 유상이 포}

집한 W/O ^{형태의 리포솜으로 구성된다} . 2. ^{나노입자의 정상세포독성}

실험에 사용된 마황 나노 시료의 농도는 0.2, 0.4, 0.6, 0.8

그리고 1.0 ㎎ / ㎖로 조절하여 정상세포에 대한 세포독성과 각 암세포에 대한 성장 효과를 검토하였다 . Fig. 3 은 HEK293 정 상 세포에 대한 독성을 나타낸 것으로 최고 농도인 1.0 ㎎ / ㎖ 에서 LE ^가 14.8% ^로 EO ^의 19.2%, LO ^의 18.4% ^{와 비교했을}

때 가장 낮은 세포 독성을 보였다 . ^{레시틴으로 나노 입자화한}

경우 , 마황 추출물군의 세포독성보다 4% 낮은 세포 독성을 나 타냈다 . 전반적으로 20% 이하로 나타난 마황 시료의 세포 독

성 값은 HEK293 세포를 이용하여 천연알칼로이드의 세포 독

성을 연구한 결과인 40% 와 비교했을 때 (Ji et al ., 2008) 세 포 수준에서 큰 영향을 주지 않으며 , 경미한 독성을 보이는 것으로 사료된다 .

3. ^{나노입자의} in vitro 항암 활성

Fig. 4 의 (A) 와 (B) 는 인간 간암 세포 유래 Hep3B 와 인간 위암 세포 유래 AGS 에 대한 항암 활성을 나타낸 것이다 . 1.0

㎎ / ㎖의 농도에서 간암세포와 위암세포 모두에서 나노 입자 화한 LE 가 각각 85.1%, 87.3% 로 가장 높은 항암 활성을 나 타냈다 . ^{마황 열수 추출물} EO ^{가 간암세포에서} 67.2%, ^위암세

포에서 70.6% ^{의 저해활성을 나타낸 것과 비교했을 때} , ^레시틴

으로 나노 입자화한 군에서 16~17% 감소된 암세포 생육을

나타낸 것은 나노 입자화를 통해 시료의 세포 투과가 용이해 졌고 (Parag et al. , 2009), 마황 고유의 유용성분의 방출이 효과적으로 제어되었기 때문인 것으로 사료된다 (Antina et al. , 2005). 약 60% 의 암세포 생육 저해 효과를 보이는 기존 의 다른 한약재 추출물 가시오갈피 , ^{복분자 등과 비교했을 때} (Park et al. , 2004) 역시 나노 입자화를 통해 항암 활성이

20% 이상 향상된 것을 확인할 수 있다 . 한편 , 양성대조군으로 사용한 taxol 의 경우 30 µ M 를 첨가하였을 때 , 간암에서는

Fig. 1.

Size distribution of nanoparticles with lecithin using

dynamic light scattering (DLS).

Fig. 2.

TEM micrograph of nanoparticles from the

^{E. sinica}

extract by lecithin-encapsulation. Scale of bar is 50~

200

^㎚

.

Fig. 3.

Cytotoxicity of

^{E. sinica}

extracts by nano-encapsulation on normal cell line, HEK293. Results are expressed as mean

^±

S.D. of data obtained from three independent experiments. Each values were compared with control at

p

< 0.05.

†

LO : lecithin only nanoparticles, EO :

^{E. sinica}

only extracts,

LE : lecithin

^{E. sinica}

extracts by nano-encapsulation

98.5% 의 항암 효과를 위암에서는 96.2% 의 억제 효과를 나타 내는 것으로 보고되었다 (Sandoval et al, 2002).

4. S-180 ^{복수암 및 고형암에 대한 in vivo 항암 효과}

복수암 유발에 따른 복수의 형성을 확인하기 위한 지표로

Table 1 에서와 같이 체중 측정 결과를 이용하였다 . EO 및

LE 실험군이 S-180 복수암 주사 후 최장 40 일까지 생존하였 기 때문에 전체 마우스 군에 시료를 매일 경구투여하며 3 일 간격으로 40 ^{일까지 마우스의 체중과 수명을 측정하였다} . ^증류

수를 경구 투여한 마우스 군의 최종 체중이 48.8 ^± 0.5 g ^으로

나타난 것과 대조적으로 LO 군에서는 44.0 ± 0.4 g, EO 군에서 는 42.6 ± 0.2 g, LE 군에서는 39.1 ± 1.3 g 로 나타나 전반적으로 체중 감소를 보였다 . 특히 , LE 를 경구 투여 하였을 때 음성대

Fig. 4.

Inhibition ratio of growth of (A) Hep3B (H, hepatoma adenocarcinoma) and (B) AGS (A, stomach adenocarcinoma) in adding the nanoparticles from

^{E. sinica}

extracts (bar chart, %). The line chart means selectivities of (A) Hep3B and (B) AGS against normal cell line, HEK293. Results are expressed as mean

^±

S.D. of data obtained from three independent experiments. Each values were compared with control at

^p

< 0.05.

†

LO : lecithin only nanoparticles, EO :

^{E. sinica}

only extracts, LE : lecithin

^{E. sinica}

extracts by nano-encapsulation

Table 1.

The effect of treatment with 100

㎎

/

㎖

of samples on body weight (g) and survival rate (%) in female ICR mice.

Group** Inintial (1day) Final (40 day) Body weight (g) Survival rate (%)

LO 28.4 ± 0.5 44.0 ± 0.4* 40

EO 27.2 ± 0.6 42.6 ± 0.2 48

LE 29.0 ± 1.2 39.1 ± 1.3 63

NCO 28.6 ± 0.4 48.8 ± 0.5 33

PCO 29.0 ± 1.1 35.6 ± 0.1 100

*Mean ± S.D. of data obtained from three independent experiments.

**Each values were compared with control at

p

< 0.05.

**LO : lecithin only nanoparticles, EO :

^{E. sinica}

only extracts, LE : lecithin

E. sinica

extracts by nano-encapsulation,

NCO : negative control by D.W,

PCO : positive control by taxol (5

㎎

/

㎖

)

조군과 비교해서 15% ^{이상 복수 형성이 지연된 것으로 미루}

어 보아 , ^{마황 추출물의 나노 입자가 마우스의 복강에 효과적}

으로 침투해 종양의 형성을 더디게 진행시킨 것으로 사료된다

(Twan, 2010).

Fig. 5 는 S-180 을 마우스 복강에 투여한 후 40 일까지 마우 스의 생존율을 측정한 결과이다 . 본 실험 기간인 40 일 동안의 마우스의 생존 상황을 뚜렷하게 가시화 위해 그래프로 표현하 였다 (Ha et al., 2009). ^{음성대조군에서} 16 ^{일째부터 생존율의}

감소가 일어나 33% ^{의 생존율을 나타낸 것과 대조적으로} , ^마

황을 나노 입자화한 LE 군에서는 63% 로 생존율의 감소가

30% 정도 더디게 진행되었다 . Taxol 을 투여한 양성대조군의

경우 실험이 종료되는 40 일 째까지 100% 의 생존율을 나타냈

다 (Jagetia and Nayak, 1996). 본 실험 결과를 통해 복수암 에 효과적으로 작용하는 마황 레시틴 나노입자의 기능을 확인 하였고 , ^{이번 연구 결과를 기반으로 나노입자의 항암 기작에}

대한 더욱 심도있는 연구가 진행될 필요가 있을 것으로 사료

된다 .

나노입자를 경구 투여한 LE ^{군에서의 고형암 성장 억제 효}

과 및 면역 장기에 미치는 영향을 알아보고자 종양세포 이식

40 일 후 고형암 및 장기의 무게를 측정한 결과를 Table 2 에 나타냈다 . 나노입자를 경구 투여한 LE 에서 마우스 간의 무게 는 1.92 ± 0.14 g 으로 , 비장의 무게는 0.51 ± 0.15 g 으로 양성대 조군과 비교했을 때 가장 적은 차이를 보였다 . 경구 독성이 있는 추출물을 섭취하였을 때 간 , ^{비장과 같은 면역 장기의}

비대화가 일어나기 때문에 (Ma et al., 2010) ^{면역 기능이 약}

한 사람들에게는 더욱 치명적이다 . 따라서 나노입자의 섭취 시 장기의 비대화가 일어나지 않은 것으로 보아 , 향후 나노 단위 로 포집한 천연물이 항암소재로서 높은 부가가치를 가질 수 있을 것으로 사료된다 .

5. Confocal ^{현미경으로 세포 투과 관찰}

Fig. 6 ^은 Confocal ^{현미경을 이용해 마황 레시틴 나노입자의}

모습을 실시간 10 분 간격으로 찍은 사진으로서 , 나타난 면역

Fig. 6.

Confocal microscope photographs of cancer cell line (Hep3B) containing nanoparticles of

^{E. sinica}

every 10 min. (A) 0 min, (B) 10 min and (C) 20 min.

Fig. 5.

The survival ratio (%) treated with different samples on the growth of Sarcoma-180 inoculated intraperitoneally.

†

LO : lecithin only nanoparticles, EO : E. sinica only extracts, LE : lecithin E. sinica extracts by nano-encapsulation, NCO : negative control by D.W,

PCO : positive control by taxol (5

^㎎

/

^㎖

)

Table 2.

The effect of nano-particles on the weight of tumor, liver and spleen of ICR mice after 40 days (g).

Group** Weight (g)

Liver Spleen Tumor

LO 2.11 ± 0.11 0.72 ± 0.12 6.45 ± 0.13*

EO 2.41 ± 0.08 0.73 ± 0.07 5.15 ± 0.08 LE 1.92 ± 0.14 0.51 ± 0.15 3.48 ± 0.12 NCO 2.71 ± 0.05 0.82 ± 0.06 10.94 ± 0.25 PCO 1.88 ± 0.07 0.42 ± 0.05 1.84 ± 0.04

*Mean ± S.D. of data obtained from three independent experiments.

**Each values were compared with control at

^p

< 0.05.

**LO : lecithin only nanoparticles, EO :

E. sinica

only extracts, LE : lecithin

E. sinica

extracts by nano-encapsulation,

NCO : negative control by D.W,

PCO : positive control by taxol (5

㎎

/

㎖

)

세포에서 나노 입자의 침투정도를 확인할 수 있다 . ^{따라서 본}

연구를 위해 제조한 나노 시료의 경우 입자의 크기가

50~200 ㎚로 분산됨에 따라 세포의 침투의 용이성이 일반 열

수 추출물에 비해 뛰어난 것을 확인 할 수 있다 . 100 ㎚ 이하

의 소수성 표면을 갖는 리포솜은 약물의 분자성 약물의 운반 을 용이하게 하여 세포에 대한 친화성이 증가하게 된다 . 마황 과 같은 수용성 성분을 레시틴으로 포집시킴으로써 인지질로 구성된 인체의 내피세포에 대해 수용성 물질의 세포내 침투 효율 향상시킬 수 있다 . ^{새로운 나노} encapsulants ^{에 대한 검}

색이 이루어져야 할 것으로 사료된다 . 감사의 글

본 연구는 농촌진흥청 바이오그린 21 ( 과제번호 :

20070401034013) ^{연구지원으로 수행된 것으로 이에 감사의}

뜻을 표합니다 .

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