Method Development and Validation of Strychnine in Blood by Gas Chromatography/Mass Spectrometry Using Solid Phase Extraction and its Application in Real Specimens

SPE 및 GC/MS에 의한 혈액중 스트리크닌의 분석법 개발 및 검출사례

이종숙^#·염혜선·문성민·이상기 국립과학수사연구원 법과학부 약독물과

(Received November 12, 2012; Revised February 25, 2013; Accepted March 25, 2013)

Method Development and Validation of Strychnine in Blood by Gas Chromatography/Mass Spectrometry Using Solid Phase Extraction and its Application in Real Specimens

Rhee Jongsook^#, Yum Hyesun, Moon Sungmin and Lee Sangki

Drug & Toxicology Div., Forensic Science Dept., National Forensic Service, Seoul 158-707, Korea

Abstract — An analytical methodology based on solid-space extraction (SPE) with with Bond Elut Certify cartridge (Varian, 130 mg) has been developed for the qualification and quantitation of strychnine in blood. After the elution layer was evap- orated, the residue was reconstituted with methanol for GC/MS. Internal standard was used 10 mg/l dextromethorphan.

Strychnine is a potent central nervous stimulant and convulsant, and an alkaloid found in seeds of Strychnos nux-vomica.

It was used therapeutically to improve circulation and muscle tone in oral or intramuscular doses of 0.05~8 mg. The fatal dose of strychnine for humans is 50~100 mg. A man was found dead lying curled up the corner of the large room in a roof house after the fire fighter opened a locked door inside to put out the fire. The postmortem blood and gastric contents were analyzed for toxicological testing. Strychnine and brucine were detected using GC/MS first in gastric contents extracts. The contents of strychnine was 0.083 mg/l in heart blood, 0.088 mg/l in peripheral blood and 4.0 mg/kg in gastric contents, respectively. Method validation was carried out in terms of linearity, accuracy, precision (intraday, interday) in blood. The assay is linear over 0.05~10 mg/l (r²=0.999). Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) in blood were deter- mined 0.02 mg/l (S/N=3) and 0.07 mg/l (S/N=10), respectively. Accuracy (bias%) of strychnine with 0.1, 1 and 10 mg/l was 12.0% (n=6), 9.3% (n=6) and 6.9% (n=6), respectively. Intraday precision (CV%) of strychnine with, 0.1, 1 and 10 mg/l were 6.4%, 10.4%, 1.2% (n=6), respectively. Interday precision (CV%) of strychnine with 0.1, 1 and 10 mg/l over three days were 24.0%, 18.5%, 13.8% (n=18), respectively. Relative recovery with 0.1, 1 and 10 mg/l (in blood) were 114.9%, 99.3%

and 87.4% (n=6), respectively. The described method can be applied in forensic toxicology to determine strychnine in blood samples.

Keywords □ strychnine, blood, GC/MS, SPE, forensic

스트리크닌(strychnine, Fig. 1)은 마전자 나무(Strychnos nux vomica)의 종자에 함유되어 있는 알칼로이드계 성분^1,2)으로 강력 한 중추신경 흥분 및 경련 유도 작용이 있어 치료목적으로 고미 제, 설사제, 강장제, 강심제로서 중추신경계의 기능항진, 소화불 량 등에 사용되었으나, 지금은 거의 사용되지 않으며, 현재 유럽 과 북미에서는 설치류 등 유해동물의 구제에 살서제 농약으로만 사용되고 있다.^3,4)아시아에서는 드물게 아직도 의료용으로 마전 자를 혈액순환 개선, 위장관의 치료, 진통제 등에 사용되고 있다.

이 약은 경구 섭취시 위장이나 소장에서 빠르게 흡수되고, 중

독증상은 목이나 등 부위에 강직 등의 근육경련에 이어 전신 근 육연축이 일어나며, 과량 복용시 호흡근마비에 의해 사망할 수 있다. 급성중독의 주요 독작용인 발작은 음독후 15분 이내에, 코

#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 02-2600-4925 (팩스) 02-2600-4917 (E-mail) [email protected]

종설

Fig. 1− Chemical structure of strychnine (CAS No: 57-24-9, mw 334.4).

로 흡입한 후 5분 이내, 정맥투여 수분이내 나타날 수 있다. 특 히, 치사량이 50~100 mg으로 매우 낮아 독살, 사형, 자살의 목 적으로 사용되어 왔으며,⁵⁾특히 어린이에 대한 최소치사량이 5~

10 mg으로 매우 낮다고^4,6,7)보고되어 있다. 미국에서는 1962년 연 방법에 의해 치료목적으로 사용이 금지되기 전에는 어린이 사고 사의 주요한 사망원인물질이 스트리크닌이었다.⁸⁾문헌에는 성인 이 스트리크닌 60~100 mg을 복용한 후 호흡근 마비로 인한 사망 한 사례가 보고되어 있으나, 성인의 경우 100 mg 및 700~3700 mg 을 음독한 경우에도 생존한 사례가 있다고 보고된 바 있다.⁶⁾

스트리크닌의 혈액 중 치료농도에 대하여는 문헌에 특별히 보 고된 바 없으나, 독성농도는 0.075~0.1 mg/l,⁹⁾치사농도는 0.2~2 mg/l⁹⁾(혹은 0.5~61 mg/l²⁾)으로 보고되어 있다.

쥐의 경우 투여량의 30%가 7일 내 소변으로 배설되며 투여량 의 6%는 대사되지 않은 형태로 배설된다. 대사는 주로 N-산화 과정, 하이드록실화 과정, 에폭시화 과정 및 포합과정을 일어나 며, 사람의 경우 투여량의 10~20%가 대사되지 않은 채로 24 시 간 내 소변으로 배설된다. 건강한 성인에게 0.38 mg을 경구로 투 여한 경우 투여량의 2.2~8.6%가 12시간 내 소변으로 배설되며, 2~6시간 후 소변중 스트리크닌의 농도범위는 0.023~0.176 mg/l 라고 보고되어 있다. 2.5~4.8 g을 복용 후 사망한 사례에서 0.5~3 시간 후 최고 혈청 스트리키닌 농도는 2.1~3.8 mg/l이었으며 치 료 3~8일 후 사망하였다고 하고, 14 g을 복용 후 사망한 사례에 서 혈중농도 20 mg/l(0.5-61), 뇌 14 mg/l(2.4-26), 간 116 mg/kg (2-257), 신장 42 mg/l(3.2-106), 소변 8.3 mg/l(1-33), 위액 113 mg/kg(7.5-282) 이었다고 문헌에 보고되어 있으며,²⁾스트리크닌 은 심혈농도/말초혈 농도비는 각각 1.8, 15로 사후 재분포된다고 보고되어 있다. 또한, 중독 후 생존한 사람의 경우 12~24시간 내에 경련이 소실되었다고 한다.

문헌에 혈액 등 생체시료에서 스트리크닌의 추출은 톨루엔 등 에 의한 액액추출법,¹⁰⁾ Oaisis^® MCX cartridge,⁴⁾ Oasis^® HLB cartridge¹¹⁾ 등을 이용한 고상추출법에 대하여 보고되어 있고, 분 석법으로는 TLC, GC,⁸⁾ HPLC,⁴⁾ GC/MS법,^6,9,11) GC/MS/MS법⁸⁾ 등이 보고되어 있다.

본 연구에서는 GC/MS에 의한 혈액중 스트리크닌의 분석법을 확립하고 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도, 회수율 등 을 검증하여 유효화하였으며, 실제 스트리크닌의 검출사례로 화 재사로 사망한 부검사례에서 심장혈액, 말초혈액 등 실제 법과 학검체에 대한 스트리크닌의 분석결과를 보고하고자 한다.

연구방법

시약

Strychnine(C₂₁H₂₂N₂O₂, mw 334.4)과 dextromethorphan은 Chem Service사의 표준품을 사용하였으며, 그 이외의 시약은 시

판 특급을 사용하였다. Bond Elut Certify cartridge(130 mg, 3 cc)은 Varian(USA)사 제품을 사용하였다.

기기

가스크로마토그라프/질량스펙트럼(GC/MS) 분석은 Agilent 5973N(USA) GC/MS를 이용하였으며, GC/MS 분석조건은 Table I 과 같이 Inlet 온도 260^oC에서 Injection volume 1 µl를 주입하 였고, 이온화는 EI mode를 사용하였으며, MS source 온도 230^oC, Quadrupole 온도 150^oC, mass range는 m/z 50-650에서 측정하였다. 컬럼은 DB-5ms column을 사용하였고, carrier gas 는 헬륨을 1.0 ml/min으로 하였으며, 온도조건은 초기온도 80^oC 에서 1분간 유지한 후 290^oC까지 분당 20^oC 승온하였다. SPE workstation은 Rapid Trace^®(Caliper, USA)를 사용하였다.

시료

변사자는 경제적인 문제로 아내와 떨어져 딸과 생활하던 중, 2009년 8월 경기도 ○○시 옥상 가건물에서 화재가 난 것을 제 3의 목격자가 119 신고하여 화재진압 후 소방관에 의해 사망한 상태로 방에서 발견되었다. 사인규명을 위하여 국립과학수사연 구소에서 법의부검을 시행하였고, 특기할만한 외부소견이나 장 기조직의 병변을 보지 못하는 등의 부검소견이 있었으며, 이에 생체시료인 혈액 및 위내용물중 약독물검사를 시행하였다.

위내용물중 스트리크닌의 확인

생체시료인 위내용물중 약독물 분석은 Stas-Otto법으로 추출 하여 적용하였다. 즉, 주석산성하에서 주정으로 추출한 농축분획 을 액성을 알카리성으로 한 다음, 초산에칠로 추출한 분획에 대 하여 박층크로마토그라프(TLC)를 시행하였을 때, 일정한 위치의 반점에서 드라겐돌프시액 및 요오드백금산용액에 의해 정색되었 으며, GC/MS분석에 적용하기 위하여, 이 반점을 preparative TLC로 정제하였다. 이어 가스크로마토그라피/질량분석기(GC/

MS)에 주입하여 NIST, Wiley 등 상용 Library를 적용하여 스트 리크닌이 검색되었으며, 이를 대조품과 비교하여 확증하였다.

SPE에 의한 생체시료중 스트리크닌의 추출

혈액에서 스트리크닌의 추출은 Scheme 1과 같은 방법을 사용 하였다. 시험관에 혈액 1 ml를 취한 다음, 내부표준물질 용액 (dextromethorphan 10 mg/l) 50 µl를 첨가하고, 0.1 M phosphate buffer(pH 6.0) 3 ml를 넣고 vortex로 혼화한 후 15분간 초음파 처리하였다. 다음에 2500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액 을 혈액의 시료용액으로 하였다. SPE column은 Bond Elut Certify cartridge(Varian; 3 cc, 130 mg)를 사용하였으며, Rapid Trace workstation에 장착하여 자동시스템으로 추출하였다. 먼저 SPE cartridge를 methanol 2 ml, 0.1 M phosphate buffer 2 ml

의 순으로 넣어 미리 activation하고, 앞서 준비한 혈액의 시료용 액을 loading하였다. 이어 1 ml 증류수, 2 ml 0.2 M 초산으로 세 척한 다음, 0.1 ml 메탄올을 가하여 5분간 45^oC 이하에서 질소 가스로 건조시킨 후, chloroform:acetone(1 : 1) 5 ml로 용리하여 버린 후 ethyl acetate(2% ammonia solution) 용매 5 ml로 용리 하여 45^oC 수욕상에서 질소농축하였다. 이어 50 µl methanol으 로 용해하여 GC/MS에 1 µl를 주입하였다(Scheme 1). 위내용물 의 경우에는 증류수를 이용하여 희석한 10배 희석액 0.5 ml를 취 하고 내부표준물질 용액(dextromethorphan 10 mg/l) 50 µl를 첨 가한 다음, 0.1 M phosphate buffer(pH 6.0) 3.5 ml를 넣고 vortex로 혼화한 후 15분간 sonication하였다. 다음에 2500 rpm 에서 10분간 원심분리하여 상층액을 위내용물의 시료용액으로 하여 Scheme 1과 같은 방법으로 하였다.

분석방법의 유효화

분석법의 유효화는 스트리크닌이 검색되지 않은 공혈액을 사 용하여 검량선 범위, 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ), 시험내 정 밀도(intraday precision), 시험간 정밀도(interday precision), 정 확도(accuracy), 회수율을 검토하였다.

직선성 − GC/MS에 의하여 혈액 및 위내용물에서 스트리크닌 을 정량하기 위하여 0.05~10.0 µg 범위의 스트리크닌 표준용액 에 대하여 검량선을 작성하였다. 스트리크닌의 표준품 10 mg을 정확히 달아 메탄올에 용해하여 1.0 mg/ml 표준원액을 조제하였 다. 이를 메탄올로 희석하여 1, 10, 100 mg/l의 표준용액을 조제 하였다. 내부표준용액은 dextromethorphan를 메탄올에 10 mg/l 의 농도로 용해하여 사용하였다. 검량선은 시험관에 공시험용 혈 액 1 ml에 각각 스트리크닌 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 5, 10 µg을 첨가 하여 실온에서 30분간 방치한 다음, 이어서 SPE 방법으로 추출 하여 농축하고, GC/MS에 주입하여 얻은 크로마토그람에서 스트 리크닌의 경우 m/z 334을 선택하고, 내부표준물질의 경우 m/z 271을 선택하여 SIM 크로마토그램을 구하여 내부표준물질에 대 한 피크면적비를 구하여 작성하였다.

검출한계(LOD) 및 검량한계(LOQ) − 검출한계(LOD)는 시험 관에 스트리크닌 표준용액 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l을 각각

100µl씩을 취하여 Scheme 1에 따라 조제하여 GC/MS에 주입 하여 얻은 검량선에 1 mg/l 스트리크닌용액 100 µl씩 첨가하여 전술한 방법으로 10개의 시료를 준비한 후 GC로 측정한 다음 계산된 스트리크닌 농도의 표준편차(s)를 계산하여 S/N=3에서 표준편차의 3배로 결정하였고, S/N=10에서 표준편차의 10배 값 을 정량한계(LOQ)로 하였다.

정확도(Accuracy) − 정확도는 시험관에 스트리크닌이 검출되 지 않은 공시험용 혈액 1 ml를 취한 다음 스트리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용액을 100 µl씩 취하여 6회 반복시험 을 하여 얻은 결과값을 검량선에 적용하여 스트리크닌의 측정값 을 구하여 이의 bias%를 계산하여 검증하였다.

정밀도(Precision) − 시험내 정밀도는 시험관에 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액 1 ml를 취한 다음 스트리크닌 농 도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용액을 100 µl씩 취하여 6회 반복시험을 하여 얻은 결과값을 검량선에 적용하여 스트리크닌 의 측정값을 구하여 이의 CV%를 계산하여 검증하였다. 시험간 정밀도는 스트리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용 액을 100 µl씩 취하여 6회 반복시험을 하여 3일 동안 연속적으 Scheme 1− Analytical protocol of postmortem specimens using

solid phase extraction (SPE) for GC/MS.

Table I− GC/MS Conditions GC/MS Column Flow rate (He) Column temp.

Injector temp.

Electron multiplier voltage Ion mode

Inlet mode Injection volume Mass range MS source temp.

MS Quadrupole temp.

Agilent 5973N MSD with 6890 GC and 7683 autosampler DB-5MS (0.25 mm×30 m, thickness 0.25µm)

1.0 ml/min.

80^oC (1 min)->290^oC (20 min), ramp rate 20^oC/min 260^oC

1600 V EI, Scan

splitless (purged to flow 20 ml, 3 min) 1µl

50 to 650 m/z 230^oC 150^oC

로 시험하여 얻은 결과값을 검량선에 적용하여 스트리크닌의 측 정값을 산출하여 이의 CV%를 계산하여 검증하였다.

회수율(recovery)_-회수율은 스트리크닌이 검출되지 않은 공 시험용 혈액 1 ml에 스트리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l 의 표준용액을 100 µl씩 첨가하여(최종농도 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 µg/ml), 실온에서 30분간 방치한 다음, 이어서 시료와 동일 한 SPE 방법으로 추출하여 GC/MS에 주입하여 얻은 내부표준 물질에 대한 시료의 피크면적비를 6회 반복시험을 하여 얻은 결 과값을 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액을 사용하여 제조한 스트리크닌 표준용액 0.05~10 mg/l 각각 취하여 작성한 검량선에 적용하여 스트리크닌의 함량값으로 계산하여 회수율을 검증하였다.

실제 법과학검체에의 적용(혈액 및 위내용물 중 스트리크닌의 확인 및 정량)

시험관에 생체시료인 혈액 또는 위내용물 일정량을 정확하게 취하여 Scheme 1의 SPE 방법으로 추출하여 얻은 추출물을 GC/

MS에 주입하여 측정한 GC/MS tic 크로마토그람에서 스트리크 닌의 quantifier ion으로 m/z 334, 내부표준물질으로 m/z 271을 각각 선정하여 작성한 SIM chromatogram에서 각 이온피크의 면적을 구하여, 내부표준물질에 대한 스트리크닌의 피크면적비 를 구하였다. 이어 생체시료중 스트리크닌의 함량은 희석배수를 고려하여 검량선에 적용하여 산출하였다.

결과 및 고찰

분석방법의 유효화

분석법의 유효화는 혈액을 사용하여 직선성, 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ), 시험내 정밀도(intraday precision), 시험간 정밀 도(interday precision), 정확도(accuracy)를 검토하고, 혈액을 사 용하여 회수율을 검증하였으며, Table II 및 Table III에 나타내 었다.

직선성 − 시험관에 혈액 1 ml를 넣고 내부표준용액을 넣은 후 표준용액을 0.05~10 mg/l으로 하여 SPE 추출하여 GC/MS에 주 입하여 얻은 크로마토그람에서 스트리크닌의 quantifier ion으로 m/z 334을 선택하고, 내부표준용액의 quantifier ion으로 m/z 271 을 선택하여 SIM 크로마토그램을 구하여 내부표준물질에 대한 피크면적비를 구하여 검량선을 작성한 결과, 우수한 직선성을 얻 었다(상관계수 0.999).

검출한계(LOD) 및 검량한계(LOQ) − 검출한계(LOD)는 시험 관에 스트리크닌 표준용액(1, 10, 100 mg/l) 3종을 각각 100 µl 씩을 취하여 Scheme 1에 따라 조제하여 GC/MS에 주입하여 얻 은 검량선에 1 mg/l 스트리크닌용액 100 µl씩 첨가하여 전술한 방법으로 10개의 시료를 준비한 후 GC로 측정한 다음 계산된

스트리크닌 농도의 표준편차(s)는 0.0073이었으며, S/N=3에서 표준편차의 3배인 0.02 mg/l으로 설정하였고, S/N=10에서 표준 편차의 10배 값인 0.07 mg/l를 설정하여 Table II에 나타내었다.

정확도(Accuracy) − 정확도는 스트리크닌이 검출되지 않은 공 시험용 혈액 1 ml에 스트리크닌 농도 1, 10, 100 mg/l의 표준용 액을 각각 100 µl씩 첨가하여 최종농도로 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 mg/l으로 조제한 다음, Bond Elut Certify cartridge를 이용 하는 고상추출법으로 6회 반복시험을 하여 이의 bias%를 계산하 였을 때 각각 12.0%, 9.3%, 6.9%(n=18)이었다. 따라서 본 연구 방법에 대한 정확도는 모두 20% 미만으로 독성학실험실 가이드 라인의 허용기준(20%)^11,12)에 적합하였다.

정밀도(Precision) − 시험내 정밀도는 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액 1 ml에 스트리크닌 농도 1, 10, 100 mg/l의 표준용액을 각각 100 µl씩 첨가하여 최종농도로 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 mg/l으로 조제한 다음 Bond Elut Certify cartridge를 이용하는 고상추출법으로 6회 반복시험을 하여 이의 CV%를 계 산하였을 때, 각각 6.4%, 10.4%, 1.2%이었다(n=6). 즉, 시험내 정밀도를 검토한 결과 모두 20% 미만으로 독성학실험실 가이드 라인의 허용기준(20%)^11,12)에 적합하였다. 시험간 정밀도는 스트 리크닌 농도 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l의 표준용액을 100 µl씩 첨 가하여 최종농도로 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 mg/l으로 조제한 다 음 Bond Elut Certify cartridge를 이용하는 고상추출법으로 18 회 반복시험을 하여 3일 동안 연속적으로 시험하여 이의 CV%

를 계산하였을 때 각각 24.0%, 18.5%, 13.8%이었다(n=18). 즉, 본 연구방법의 유효화 파라미터를 검토한 결과 시험내 정밀도는 모두 20% 미만으로 기준에 적합하였다. 또한, 시험간 정밀도를 검토한 결과, 1.0, 10.0 mg/l의 표준용액 농도에서는 CV%가 18.5%, 13.8%으로 법독성학실험실 가이드라인의 허용기준 Table II− Validation parameters of GC/MS method for strychnine

analysis in blood

Validation parameters Results

Linear range 0.05~10 mg/l

(r²=0.999)

LOD^a 0.02 mg/l

LOQ^b 0.07 mg/l

Accuracy (n=18)

0.1 mg/l 1.0 mg/l 10.0 mg/l

12.0%

9.3%

6.9%

Precision, intraday (n=6)

0.1 mg/l 1.0 mg/l 10.0 mg/l

6.4%

10.4%

1.2%

Interday (n=18)

0.1 mg/l 1.0 mg/l 10.0 mg/l

24.0%

18.5%

13.8%

aLOD(limit of detection) and ^bLOQ(limit of quantitation) were calculated for signal-to-noise (S/N) of 3 and 10, respectively, from 0.1 mg/l sytrychnine standard (n=10).

(20%)^11,12)에 적합하였으며, 특히 정량한계와 근접한 농도인 0.1 mg/l에서 CV%가 24%로 LOQ에 대한 법독성학실험실 가이드라 인의 허용기준(±30%)^11,12)에 적합하였다.

회수율(Recovery) − 회수율은 스트리크닌이 검출되지 않은 공 시험용 혈액 1 ml에 최종농도로 스트리크닌 0.1, 1.0, 10.0 mg/l 으로 조제한 다음 Bond Elut Certify cartridge를 이용하는 고상 추출법으로 6회 반복시험을 하여 얻은 결과값을 스트리크닌이 검출되지 않은 공시험용 혈액을 사용하여 제조한 스트리크닌 표 준용액 0.05~10 mg/l의 검량선에 적용하여 스트리크닌의 함량값 으로 회수율을 계산하여 검증하였을 때 각각 114.9%, 99.3%, 87.4%이었으며, Table III에 나타내었다.

위내용물 및 혈액 중 스트리크닌의 확인 및 정량

위내용물 중 스트리크닌의 확인 − 사인규명을 위한 약독물의 대표적인 생체시료인 위내용물을 알칼리성에서 추출하여 Fig. 2 와 같이 silica gel 60 GF₂₅₄(Merck Co.) aluminium plate, 전개 용매 chlorform : ethanol (9 : 1)에서 박층크로마토그라피에 의한 약독물을 검색한 결과, UV 반점이 R_f값 약 0.17에서 관찰되었고, 드라겐돌프시액에 의해 주황색으로, 산성염화백금산 요오드시액 에 의해 진청색이 혼재된 보라색으로 정색되었다. 이 TLC 반점 을 확인하기 위하여 위내용물 추출물을 preparative TLC로 다시 전개하여 정색된 일정한 위치의 반점을 정제하여 가스크로 마토그라피/질량분석법(GC/MS)에 주입하여 Fig. 3의 mass spectrum을 측정하였다. Fig. 3의 (A)는 위내용물 추출물의 EI- mass spectrum에서 스트리크닌 및 브루신의 quantifier ion인 m/z 334, 394을 각각 추출하여 모니터링한 SIM 크로마토그램으로 각 각 단일피크가 19.46 min, 28.4 min에서 생성됨을 알 수 있었다.

Fig. 3의 (B) 및 (C)는 위내용물 추출물의 EI-GC/MS spectrum Table III− Recovery of strychnine in blood using Bond Elut Certify

cartridge

Type Added amount

(mg/l) Found amount

(mg/l)* Recovery (%)

Recovery

00.1 01.00 10.0

0.11±0.01 0.99±0.02 08.7±0.02

114.9 099.3 087.4

*Data are expressed as mean±SE (n=6).

Table IV− Retention time, quantifier ion and qualifier ions selected for strychnine and dextromethorphan (IS)

Compounds Retention time (min)

Quantifier ion (m/z)

Qualifier ions (m/z)

Strychnine 19.46 334 130, 143

Brucine 28.40 394 379, 120

Dextromethorphan (IS*) 10.64 271 150

*IS means internal standard.

Fig. 2− TLC chromatogram of strychnine for alkali fraction of gastric contents. 1) Mobile phase: Chlorform : ethanol (9 : 1); 2) Coloring agents: acidified platinate reagents (left) and dragendorff reagents (right); 3) TLC plate: Silica gel GF254 (Merck Co.); 4) Rf value was 0.17.

Fig. 3− SIM chromatogram (A) at m/z 334 and m/z 394, EI-mass spectrum of strychnine (B, 19.46 min) and brucine (C, 28.4 min) from gastric contents.

으로 m/z 334, 130, 143 등의 질량이온 피크가 스트리크닌 표준 품과 동일한 retention time(19.46 min)에서 관찰되었고, m/z 394, 379, 120 등의 질량이온 피크가 브루신의 표준품과 동일한 retention time(28.4 min)에서 관찰되었다. 즉, 이들을 Wiley library를 사용하여 검색하고, GC/MS에 의해 산출된 mass spectrum의 fragmentation pattern을 검토하고 표준품과 대조, 확인한 결과, 위내용물에서 스트리크닌 및 브루신을 확인하였다.

이상과 같이, 위내용물의 알칼리성 추출물을 박층크로마토그라 피를 시행하여 반점을 확인하였으며, 이를 preparative TLC로 정제하여 EI-GC/MS를 측정하여 약독물 검사를 시행한 결과, 위 내용물에서 스트리크닌 및 브루신이 검출되었다. 스트리크닌은 브루신과 함께 마전자 나무 씨에 함유되어 있는 알칼로이드류의 고유 성분이므로, 변사자는 생약인 마전자를 복용한 것으로 추 정되었다.

혈액 중 스트리크닌의 확인 − 또한, 혈액에서 스트리크닌 및 브 루신 등 약독물의 추출은 Bond Elut Cartridge(130 mg, 3 ml)를 사용하는 고상추출법을 사용하였다. 이 혈액추출물을 GC/MS에 주입하여 얻은 EI-GC/MS 스펙트럼을 측정하여 Wiley library 등 을 검색한 결과 스트리크닌을 확인하였지만, 브루신은 검출되지 않았다.

혈액 및 위내용물 중 스트리크닌의 정량 − 포르투칼에서 Marques 등(2000)¹⁰⁾은 스트리크닌의 검출사례중 제1례(45세, 남자)에서 심한 경련 및 근육위축으로 스트리크닌 중독이 의심되어 병원에 서 위세척 등 응급치료 중 사망사례에서 스트리크닌의 농도는 혈

액 0.35 mg/l, 소변 15.3 mg/l, 위액 0.1 mg/kg이었다고 보고하였 으며, 제2례(47세, 여자)에서 혈액 21.2 mg/l, 간 49.8 mg/kg, 신 장 15.6 mg/l, 심장 16.1 mg/kg, 폐 31.9 mg/kg, 소장액 3.3 mg/

kg, 위액 281.5 mg/kg이었다고 보고하였다. 중국에서 Wang 등 (2004)⁴⁾은 스트리크닌 및 브루신 중독사례(34세, 여자)로 각각 혈 액에서 2.09 mg/l, 1.88 mg/l이 검출되고, 위내용물에서 8.52 mg/l, 6.48 mg/l이었다고 보고하였다. 호주에서 Nooy 등⁵⁾은 2명의 남 성이 스트리크닌의 핀트를 복용 후 응급실로 이송되어 사망한 사 례에서 혈액중 스트리크닌의 농도는 0.99 mg/l, 1.5 mg/l 이 검출 되었으며, 사인이 스크리크닌 중독사로 보고되었다.

본 연구에서 혈액 및 위내용물중 스트리크닌의 함량은 Bond Elut Cartridge(130 mg, 3 ml)를 사용하는 Scheme 1의 고상추출 법에 따라 추출하였으며, GC/MS를 측정하여 산출하였다. Fig. 4 의 (a) 및 (b)는 혈액 및 위내용물에서 스트리크닌의 mass fragmentation ion인 m/z 334, 130, 143 이온을 각각 선택하여 모니터링한 SIM chromatogram이고, 각 하단은 혈액 및 위내용 물에서 추출한 분획에서 얻은 스트리크닌의 EI mass spectrum 이다. Fig. 5는 표준품 스트리크닌을 1 mg/l의 농도로 첨가한 표 준혈액(A), 공혈액(B), 심장혈(C), 말초혈(D) 및 위내용물(E)을 각각 전처리하여 GC/MS 스펙트럼을 측정한 다음, m/z 334 ion 을 선택하여 스트리크닌 피크의 크기를 상대적으로 비교한 SIM chromatogram이다. Table IV는 스트리크닌이나 브루신의 확인 및 정량에 사용한 스트리크닌, 브루신 및 내부표준물질의 retention time, quantifier ion, qualifier ions의 목록이다.

Fig. 4− Selected ion chromatogram at m/z 334, 130, 143 from postmortem blood (a, left) and gastric contents (b, right) and EI mass spectrum of strychnine in each specimen.

문헌에는 스트리크닌에 의한 사람에 대한 혈액중 치료농도는 보고되어 있지 않으나, 세계법과학회(TIAFT)에서 독성을 일으 키는 혈액중 농도는 0.075~0.1 mg/l라고 보고되어 있고, 다른 문 헌에는 치사한 경우의 혈액중 스트리크닌의 농도가 0.5~61 mg/l 라고 보고되어 있다. 중독사의 경우 위내용물 중 농도범위는 0.1 mg/kg, 7.5~282 mg/kg라 보고되어 있다. 실제 법과학 검체 에의 적용예에서 스트리크닌의 함량은 Table V에서와 같이, 혈 액중 스트리크닌의 농도가 심장혈액에서 0.083 mg/l, 말초혈액에 서 0.088 mg/l으로 스트리크닌이 이상반응을 일으키는 혈액중 농 도범위(0.075~0.1 mg/l) 로 검출되었고, 위내용물에서는 4.0 mg/

kg으로 혈액에 비해 상대적으로 높은 농도이고 문헌에서 제시한 위내용물중 스트리크닌의 치사농도(0.1 mg/kg) 이상인 점, 위액/

말초혈액 농도비가 45.4로 매우 높게 나온 점, 이외에 위내용물 에서만 브루신이 검출된 점으로 보아 혈액순환개선 등의 치료목 적으로 스트리크닌이 포함된 약제인 마전자 등 한약제를 고용량

경구로 복용한 사망사례로 추정되었다. 또한, 화재가 발생한 점, 경제고를 겪은 점 등을 종합해볼 때 다른 요인을 고려해볼 수도 있다. 그리고 문헌에 보고된 스트리크닌의 사후재분포는 심혈농 도/말초혈 농도비 1.8, 15으로 2례만이 보고되어 있으며, 본 사 례는 긴급히 화재신고된 사망사고로 심장혈액/말초혈액 스트리 크닌의 농도비가 0.94으로 거의 사후재분포가 일어나지 않았는 데, 이러한 이유는 사망 후 즉시 발견되었고 곧 바로 부검이 이 루어져, 즉, 사망후 부검시 까지의 시간이 단시간이었으므로 사 후 재분포가 거의 이루어지지 않았음을 추정할 수 있었다.

결 론

본 연구에서 혈액중 스트리크닌의 분석은 혈액 1 ml를 취하여 Bond Elut Certify cartridge(130 mg, 3 ml)를 사용하는 SPE 자 동추출법으로 추출하였으며, GC/MS 분석법을 적용하였다. 분석 Fig. 5− Comparison of selected ion chromatogram of m/z 334 (19.46 min) from strychnine-spiked blood sample at 1 mg/l (A), blank blood

sample (B), heart blood (C), peripheral blood (D) and gastric contents (E) in this case.

Table V− Quantitative determination of strychnine in this postmortem specimens and published data in fatalities Type of postmortem

specimen

Concentration of strychnine

Concentration ratio of strychnine against peripheral blood (PB)

Published data in fatalities

Heart blood (B) 0.083 mg/l 0.94

(toxic, 0.075~0.1 mg/l)⁹⁾ 0.2~2 mg/l⁹⁾

0.35 mg/l¹⁰⁾ 21.2 mg/l¹⁰⁾ 0.5~61 mg/l²⁾

Peripheral blood (PB) 0.088 mg/l 1 -

Gastric contents 4.0 mg/kg 45.4

0.1 mg/kg¹⁰⁾ 281.5 mg/kg¹⁰⁾

7.5~282 mg²⁾

법의 유효화는 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도, 회 수율 등 분석파라미터를 검토하였으며, 검토한 유효화 파라미터 는 법독성학실험실 가이드라인의 허용기준^11,12)에 모두 적합하였 다. 또한, 화재사로 사망한 실제사례 1례의 혈액에서 스트리크닌 이 검출되었고, 위내용물에서는 TLC 및 GC/MS에 의해 스트리 크닌 및 브루신이 검출되었으며, 스트리크닌의 함량은 혈액에서 0.083~0.088 mg/l, 위내용물에서 4.0 mg/kg이었다. 즉, 본 사례 의 혈액중 농도는 문헌에 보고된 혈액중 스트리크닌의 독성농도 범위였으며, 위내용물중 농도는 치사농도 이상으로 검출된 점으 로 보아 스트리크닌이 포함된 약제인 마전자 등 한약제를 약용 량 이상 경구로 복용한 사망사례로 추정되었다.

감사의 글

본 연구과제는 일부 국립과학수사연구소 중장기 과학수사 감 정기법 연구개발사업(과제명: 증거물질의 신뢰성 확보를 위한 감 정기술 개발)의 지원사업으로 진행되었기에 이에 감사드립니다.

참고문헌

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