얗학희지，제
22권 제
1호
15-2K1978) Yakhak Hoeji,Vol. 22, No. 1
Gentamicin Sulfate 의 蠻光分析法에 관한 硏究
白 于 球 • 金 正 優 • 許 明 權 . 朴根昌
, 종근당 숙央硏究所 '
(R e c e iv e d N o v e m b e r 11
，
1977)W o o H yun Paik, Ju n g W o o K im , M yung K w on H ou and K u n Chang P ark
Research Center, Chong Kun D ang Corporation, Seoul 150Studies on the Fluorophotometric Determination of Gentamicin Sulfate arid its Preparations r
Abstract—Gentamicin sulfate reacted with pyridoxal and zinc ( II) ion in pyridine-methanol solution to yield highly fluorescent
zincC I I ) chelates o f N - p y rid o x y lid e ne d e riv ativ e s. T h is flu o re sc e n ce reaction was sen sitive a n d show ed e x c ita tio n m a x im u m at 398 n m , a n d e m issio n m a x im u m a t 482 n m . T h e effects o f re a g e n t co n c e n tra tio n , re a c tio n tim e a n d te m p e ra tu re , s ta n d in g tim e a n d te m p e ra tu re w ere studied. A n d a n e w flu o ro p h o to m e tric m e th o d fo r th e d e te r m in a tio n o f g e n ta m ic in s u lfate w as developed. A good re sult was o b ta in e d a n d th is m e th o d w as ap p lie d to v a rio u s pre paration s.
gentamicin sulfate 의 分析法으로는 生物學的 定量法1〕以外에 는 아직 뚜렷 한 理 化 學 的 分 析 方法이 確立되어 發表된 바 없 다.
그러 나 Maeda2)등은 hexosamine 이 pyridine methan이 溶液中에 서 pyridoxal 및 Z n ( 표 ) io n 과 反應하여 iV-pyridoxylidene derivatives 의 Z n chelate 化合物이 나타내 는 强한 蜜光을 利 用 한
® 光分析法3〕 을 提示하였고 이 方法을 利用하여 amino acid4) 및 kanamycin，polyoxin, kasuga- mycin 과 같은 aminosugar 系抗生物質의 分析法5》 을 發表한 바가 있 다. 著者둥은 同
一系인 g e n tamicin sulfate 의 分析에 遍用시 켰으나 그 條件에서 는 蛋光이 不安定하고 再現性이 나 빠 ， 보 다 正確하고 安定하며 再現性이 좋은 條件을 檢討한 結果 다음과 같은 營光分析法을 確 立 하 였 기 에 이를 報吿한다 .
實 驗
試 料 ，試藥 및 裝置 gentamicin sulfate 는 crude gentamicin sulfate 의 精製한 것 을 使 用
하였으며 實驗에 使用한 모든 試藥은 特級試藥을 使 用 하 였 다 . 그리고 蜜光은 spectrophotofluo-
rom eter(Am inco Bow m an) 를 使用하여 測定하였다.
方 法 Pyridoxal hydrochloride 0 .002 w /v^?, zinc acetate 0.2 w/v96 및 pyridine 2.0 v / v % 를 含有하는 methanol 溶液을 pyridoxal zinc 試液으로 使 用 하 였 고 , 標準液은 gentamicin sulfate 標準品(U .S .P . XIX 規格品) 50〜 100 m g ( 力價로서)을 正確히 取하여 蒸溜水에 溶解시 킨 後 50 m l 로 하고 다시 이 液 l m l 룰 取하여 5 0 m l 로 만든 液을 使用하였다(最終濃度 : 20〜 40
檢液은 gentamicin sulfate 製劑인 檢體 一定量을 正確히 ' 取하여 蒸溜水에 溶解시 켜 檢液中 gentamicin sulfate 의 最終濃度가 標準液과 비 슷하도록 調劑한 液을 使用하였 다 . 操作은 標準 液 ，檢液 및 對 照液 (증류 수)을 各各 l m l 씩 正確히 取하여 공전시험관에 넣고 pyridoxd zinc 試液 10m l 씩 加하고 잘 振邊한 후 40ᄋ에서 90分間 反應시킨 다음 이를 꺼내어 10〜 15ᄋ의 水浴 上에 서 30分간 放置한 후 excitation 고max 398 nm, emission 고max 482 nm 에 서 標準液의 比較®
光 强 度(R F I: relative fluorescence intensity) 를 100으로 하여 그때의 檢液 및 對照液의 R F I 를 測 定한다 .
檢液中 gentamicin sulfate 의 最終濃度Cwg/ml) ᅳ 檢液의 R F I —對照液의 R F I 、 스|면進旅의
•"■標準液의 R F I - 類 液 의 R F IX 標準液니 最 關 度 여 g /m l) 과自 檢體中 gentamicin sulfate 의 量 (m g ) ^
含 절 나 0 ᅳ 檢體의 量 (m g ) X1UU
結果 및 考察
波長의 선택---- * 般的으로 kanamycin，polyox in, kasugamycin 등과 같은 amino sugar 系 抗 生物質의 excitation 고 max은 380土10 nm ，emission 고max은 475土10칸이로 報吿된 바5〕 있으나
emission 고max 은 482 nm 로 나타났다(Fig. 1).
試液 濃度의 決定 pyridoxal hydroch
loride 의 濃度는 zinc acetate 및 pyridine 의 濃度를 一定하게 維持시 키 고 pyridoxal hy
drochloride 의 濃度를 變化시 킬 때 Fig. 2 에 表示된 바와 같이 pyridoxal hydrochlo- ride 의 濃度가 0 .0 0 2 w /v % 에 서 最大蜜光 을 나타내며 그 以下 또는 以上의 濃度에 서는 發光强度가 현저히 減少하였다. 따라 서 pyridoxal hydrochloride 의 濃度를 最 大蜜光을 發하는 0.002 w /v ※로 定하였 다 .
zinc acetate 의 濃度는 위와 마찬가지 方 法으로 zinc acetate 의 濃度를 변화시 킬 때 0 .2 w / v % 에서 最ᄎ營光을 發하였으며 그 以上의 濃度에서도 發光은 더 以上 增加하 지 않았으므로 zinc acetate 의 濃度를 0. 2 w / v 썼로 定하였으며 이를 Fig. 3에 나타
J. Pharm. Soc. Korea
gentamicin sulfate 의 excitation 고 max 은 398 nm,
WAVE LENGTH ( n a )
Fig. 1—Fluorescence excitation and emission spectra
of gentamicin sulfate reacted with reagents.
황산 겐타마이신의 형광분석법에 관한 연구 17
Fig. 2—Effect of concentration of pyridoxal hydrochloride in gentamicin sulfate solution (40 ^g/ml).
10
0 . 3 0 . 4 0 . 5 w / v %
Fig. 3—Effect of concentration of zinc acetate in gentamicin sulfate solution (40 //g/ml).
내 었 다.
pyridine 의 濃度변화에 따른 ® 光强度의 변화는 Fig. 4와 같이 pyridine 의 濃度가 2 .0 v / v % 以上에서 一定한 最 *蟹 光 을 發하므로 2 .0 v / v % 로 決 定하였다. .
反應 條件— — 反應時間 및 溫度는 이 反應에 있어서 나타난 ®光이 不安定하므로 發光을 安 定 化시켜 이에 따른 誤差를 最少化하기 위하여 다음과 같은 實驗을 하 였 다 . 反應時間 및 溫度에 따른 發光의 변화를 보면 Fig. ,5와 같이 室溫에서 反應시킬 경우 계속적인 蟹光強度의 上 昇 을 나타냈으며，40o로 加溫 反應시키면 1〜 2時間 사이에서 거의 一定한 發光을 나 타냈다 .
放置時間 및 溫度는 40ᄋ에서 90分間 反應시 킨 後 測定時의 溫度를 5〜 10ᄋ. 10〜 15°， 15〜 20ᄋ 로 一定時間 維持시키고 이에 따른 發光强度의 安定性을 본 結果 5〜 15ᄋ에서 安定하게 나 타났
Vol. 22, No. 1, 1978
Fig. 4 _ Effect of concentration of pyridine in gentamicin sulfate solution (40 /^g/ml).
Time (Bin*)
tim(sin.)
Fig. 5—Effect of reaction time at room temperature(-O-) Fig. 6—Relationship between standing time and 40°(—# —). and relative fluorescence intensity at various
temperatures: CO 5〜 10o (2) 10〜 150 (3) 15〜 20o 으나 操作의 便宜上 10~15°로 택 하였다(Fig. 6).
蜜光의 安定性은 Fig. 5 ( _ • ᅳ)와 Fig. 6의 (2)로부터 40°에서 90分間 反應시키고 10〜 15°로 放置시 켜 蜜光을 測定할 때 放置時間에 따른 蜜光의 安定性을 본 結果 Fig. 7과 같이 20~80分 사이에서 매우 安定한 蜜光을 나타냈다.
檢量線— — 以上의 結果로부터 反應條件올 40°, 90分間 加溫하여 反應시키고 , 10~15°로 30分 間 冷却시킨 後 發光을 測定하는 것으로 定하였다.
위 의 條件으로 gentamicin sulfate 의 濃度에 따른 蟹光强度의 변화에 대 한 檢量線을 그린 結
果 Fig. 8과 같이 10 滩 /m l〜 60； «g/m l 사이 의 濃度에 서 直線關係가 成立되 었다.
Eu 60 50
^0 30
20 10
0 20 40 60 80
100Time (m in .) Fig. 7ᅳEffect of standing time., reaction
condition: 40° for 90 min., standing temperature： 13°
120
Table 1—Microbiological and proposed methods comparison for the pure gentamicin sulfate
Percent by weight Proposed Sample of components me«hod method
rONCENTRATIC 했 (mcR/ml) Fig. 8ᅳCalibration curve of gentamicin sulfate.
C i c 2 c la
Potency* Potency*
Bluk
Aᅳ — —
594 591Bulk
B — — — 582 603Bulk
C — — — 600 607Bulk
D — — —600 601
Bulk
E 3 6 .2 41.822.0
582 582B u lk F 3 4 .8
43.8 21.4 600 624
Bulk G 35.5 42.8 21.7 582 592 Bulk H 35.7 42.5 21.8 573 609
* In micrcgrams of base per milligram of gen
tamicin sulfate
製劑에의 應用 精製된 pure gentamicin sulfate 에 대 하여 生物學的 方法과 化 學的 方 法 (提 示된 方法)에 의해 分析한 結果를 Table 1 에 表 示 했 다 . Table 1에서 보는 바와 같이 生物學的 方法이 化學的 方法과 거의 비슷하거나 대체로 약간 낮은 力價를 나타냈으며 gentam icin sulfate
€ i, C2, Cia 의 組成에 따른 影響을 檢討하였으나 위와 마찬가지의 結果를 얻 었 다 .
粗 gentamicin 을 精製時 使 用 되 는 active carbon 의 蟹光强度에 對한 방해여 부 를 檢討하기 위
하여 任意의 檢體를 調劑하여 以上에 서 檢討한 proposed assay method 와 따로 m icrobiological
assay1： ) 를 하여 比較한 것 을 Table 표 에 表示했으며 , carbon 이 混在되 어 도 發光에 거 의 影響이
미치지 않음을 알 수 있다 . 반 면 ，bioassay 에 의한 方法은 plus 방해를 받으며 그 정 도 는 약 5%
Table I ᅳRecovery of gentamicin sulfate from sample containing carbon
Table III ᅳEffect of other materials in determination of gentamicin sulfate
Sample RecoveryC%)
CA) CB)
Gentamicin sulfateC50 mg*) 99.7 105.8 CarbonC50 mg) 98.2 107• 6
* as activity
CA) Proposed method (B ) Microbiological method
以 上 임 을 알 수 있 다 .
gentamicin sulfate 를 製劑化시 킬때 軟 資劑 및 注射劑에 使用될 수 있 는 添 加 劑 들 各各에 대하여 이의 混 在 時 發光强度에 미 치 는 影 響 을 Table I 에 表 示 하 였 다 . 添 加 劑 가 水 溶 性 物 質 인 경 우 에 는 이의 混 在 時 에 도 전혀 蛋光 强 度 에 影 響 을 주지 않았으며 親 油 性 인 添 加 劑 도
Other Materials mg/1.0 mg of Gentamicin
Sulfate
Average Recovery*
%
