Antibiotic Resistance and Bacterial Biofilm Formation by Staphylococcus aureus Strains Isolated from Various Foods

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식품에서 분리한 황색포도상구균의 항생제 내성 특징 및 균막 형성

이주영, 왕해진, 신동빈, 조용선*

한국식품연구원식품분석센터

Received : August 30, 2012 / Revised : October 5, 2012 / Accepted : November 13, 2012

서 론

최근몇년간우리나라식중독발생중황색포도상구균은

중요한발생원인이되고있다^[8].미생물을억제하는항생

제는사람과동물의질병치료와예방에사용되고있다^.그 러나식용가축등의식품생산량증가등을목적으로항생 제의오남용으로생긴내성균이식품생산과정^,제조공정 등의여러단계를거치면서사람과달리식품유통망을타 고짧은시간에전국적으로전파될수있으며^,전파된항생 제내성균은사람에게전이되어상재균화될수도있으며

또다른공급원이될수있다^[9].근래들어황색포도상구균

은의료분야에서항생제오·남용따른 methicillin에내성 을 보이는 MRSA(methicillin resistant Staphylococcus aureus)와 VRSA(vancomycin resistant Staphylococcus

aureus) 출현으로빠르게증가하고있어심각성이점차커

가고있는실정이다^.최근에는병원뿐아니라지역사회에서

MRSA가광범위하게노출되어있고식품과관련된^MRSA

에대한오염이미국이나네덜란드등에서보고되어있다^[22].

병원성세균의항생제에대한내성에중요한역할을하는 것중에균막^(biofilm)이있다^.균막은세균이고체표면에부 착하여다당류또는단백질로둘러싸여있는형태이다^.균막 이완전히형성되면고체표면에강하게부착되어있어제 거가어렵고^,생체내에서는만성염증의원인이된다^.또한 표면으로부터지속적으로미생물을방출하기때문에유해 미생물의저장소(reservoir)와같은역할을한다^.균막은부 유생활(planktonic life)을할때에비해가혹한환경^,항생 제^,면역세포의공격등에대해강한저항력을가지기때문 에멸균^,소독^,치료가매우어렵다^[18].항생제내성을갖는 세균이균막을형성한경우에항생제가균막에작용하여효 과를보이기도전에이미획득하고있는항생제내성을이 용하여해당항생제의활성을무력화시키기때문에균막형 성의유무는중요한항생제내성감염기전으로작용할수 있다^.균막을형성한황색포도상구균은여러종류의항균제 에대해실험실내에서배양된세균(planktonic bacteria)보 다^10~1,000배이상높은내성을보인다^[3].그러므로균막 이형성된세균에의해식품재료및작업환경이오염된경 Antibiotic Resistance and Bacterial Biofilm Formation by Staphylococcus aureus Strains Isolated from Various Foods. Lee, Joo-young, Hae-Jin Wang, Dong-Bin Shin, and Yong-Sun Cho*. Food Analysis Center, Korea Food Research Institute, Gyeonggi-do 463-746, Korea

Staphylococcus aureus is a major human pathogen that produces a wide array of toxins, leading to a number of adverse symp- toms. We examined 275 strains of Staphylococcus aureus isolated from various foods between 2006 and 2008 for antimicrobial susceptibility. At least 259 (94.2%) of the tested strains showed antibiotic resistant properties, and 106 (40.7%) of them showed multiple antibiotic resistance. Eleven of the tested strains were resistant to oxacillin and mec A-positive. Moreover, oxacillin-resistant strains were significantly more likely to be multi-drug resistant (p < 0.01). Of the 275 isolates tested, 24.4%

were noted as being positive for slime production and 30.5% were positive for biofilm assay. Antibiotic resistance was not asso- ciated with a significantly higher prevalence of biofilm formation. Twenty strains were classified using the DiversiLab system.

Most of the strains could be classified into 2 clusters and 4 unique types. All 10 mec A-positive strains (cluster I) were grouped together into the same sub-cluster. Cluster II (6 strains) was not found to be resistant to oxacillin in this study. Although the prevalence of methicillin-resistant S. aureus in food is currently low, the risk of its transmission through the food chain cannot be disregarded.

Keywords: Staphylococcus aureus, antibiotic resistance, biofilm, MRSA

*Corresponding author

Tel: +82-31-780-9242, Fax: +82-31-780-9280 E-mail: yscho@kfri.re.kr

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우항생제및항균제의활성이떨어지기때문에세균을제 거하기가매우어렵고이로인해위생적인문제를야기할 수있다^.또한균막이형성된균에의해식중독이발생할경 우항생제에의한치료가어렵다^.병원감염이나식용가축에 서분리한황색포도상구균의항생제내성이나균막에대한 연구는활발하나즉석섭취식품이나가열조리식품에서분 리한황색포도상구균의균막에관한연구가부족한실정이다^. 최근에는역학분야에서항생제내성을지닌병원성세균 간의유연관계를확인하여원인적연관성추적에중심을두 고있다^.유연관계를확인하기위해서다양한방법이사용되 나실험방법이어렵고결과해석에어려운단점이있다^.그 러나^rep-PCR법을이용한 DiversiLab은최종결과를얻는 데소요되는시간이⁴시간이내로매우짧으며자동화된결 과의분석으로실험자간의오차가적고데이터를저장분석 하기가용이하며높은재현성을가지고있다^[1].

본연구는조리과정없이바로섭취하는식품에서분리한 황색포도상구균의항생제내성을연구하고그결과를토대 로^MRSA의심균주에대한확인을하였으며^,다제내성균 주에대한분자유형별상관관계분석하여황색포도상구균 의특성을파악하고자하였다^.또한분리된황색포도상구균 의균막형성과항생제내성과의상관관계를알아보고자하 였다^.

재료 및 방법

실험 재료

2006년부터²⁰⁰⁸년까지대형유통매장에서판매되고있는

초밥^,김밥^,크림이포함된빵이나케이크^,가열식육제품^,

냉면의총^5,186건의시료에서분리한황색포도상구균²⁷⁵

주를 대상 균주로 하였다(Table 1). 분리균은^{VITEK 2} Compact(Biomeriux, Marcy I' Etoile, France)로확인동정 하였다^.

항생제 감수성 검사

분리된 황색포도상구균 균주에 대해서 Nutrient agar

(Merck, Dermstadt, Germany)에서³⁷^o^{C 24}시간 배양 후 0.45% sodium chloride inhalation 용액^{3 ml}에^{0.6 Mac-} Faland로탁도를 맞춘후시험균액²⁸⁰µ^l를새로 준비된 0.45% sodium chloride inhalation 용액^{3 ml}에혼합하여균의 탁도를 조절하였다^.탁도를 맞춘 시험 균액은^AST-P601 card(biomeriux, France)에 채운 후 VITEK 2(biomeriux, France)를사용하여항생제감수성검사를하였다^.검사결과 는 Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI 2011) 에따라판정하였다^.각항생제별농도는 benzyl penicillin(P) 0.125, 0.25, 1(µg/ml), cefoxitin screen(OXSF) 6(µ^g/ml), ciprofloxacin(CIP) 1, 2, 4(µg/ml), clindamycin(CM) 0.5, 1, 2(µg/ml), erythromycin(E) 0.25, 0.5, 2(µg/ml), fusidic Acid (FA) 0.5, 1, 4(µg/ml), gentamicin(GM) 8, 16, 64(µ^g/ml), habekacin(HAB) 8, 32, 64(µg/ml), inducible clindamycin resistance(ICR), CM 0.5, CM/E 0.25/0.5(µg/ml), linezolid (LNZ) 0.5, 1, 2(µg/ml), mupirocin(MUP) 2, 4(µ^g/ml), nitrofurantoin(FT) 16, 32, 64(µg/ml), oxacillin(OX) 0.5, 1, 2(µg/ml), quinupristin/dalfopristin(QDA) 0.25, 0.5, 2(µ^g/ml), rifampicin(RA) 0.25, 0.5, 2(µg/ml), teicoplanin(TEC) 1, 4, 8, 16(µg/ml), telithromycin(TEL) 0.125, 0.5, 2(µg/ml), tetracycline (TE) 0.5, 1, 2(µg/ml), trimethoprim/sulfamethoxazole(SXT) 2/38, 8/152, 16/304(µg/ml), trigecycline(TGC) 0.25, 0.5, 1(µg/ml), vancomycin(VA) 1, 2, 4, 8, 16(µ^g/ml)이며 항생제 내성을 위한 표준 균주로는 Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213을 사용하였다 [15].

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus(MRSA) 의 유전자 검출

Oxacillin에 내성을 지니고 MIC(Minimum Inhibition Concentration)가⁴µ^g/ml이상(CLSI 2011)인¹¹개의분리 주에 대해 genomic DNA extraction kit(RBC, Taipei, Taiwan)를사용하여주형^DNA를분리사용하였다^.사용한 primer는^{mec A}유전자를 확인하고자 제작하였다^[17].

Oligonucleotide sequence는 mec A1 GTAGAAATGACT- GAACGTCCGATAA와 mec A2 CCAATTCCACATTG- TTTCGGTCTAATCTAA이다^.중합효소연쇄반응을위한반 응액은 1U Taq DNA polymerase, 250µ^M의 각각의 dNTP, 10 mM Tris-HCl(pH 9.0), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂(Bioneer, Daejeon, Korea)에 20 pmol primer, 주형 DNA 3µ^l를첨가하여총반응액²⁰µ^l로하였고^{, DNA}증폭 은 T gradient(Biometra, Geottingen, Germany) PCR을이 용하였다. PCR 반응조건은 94ôC 5분간초기반응, 94ôC에서 30초 denaturation, 64ôC에서³⁰초간 annealing, 72ôC에서 45초간êxtention하는것을^{1 cycle}로하여 10 cycles 반응시키 Table 1. Distribution of Staphylococcus aureus isolated

from various foods.

Source No. of samples positive for S. aureus

2006 2007 2008

Sushi 35 71 36

Kim bab 23 15 12

Cream cake 9 13 13

Ice-noodle 9 15 11

Hot meat 4 7 2

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고^,조건을바꿔⁹⁴ô^C에서⁴⁵초 denaturation, 50ôC에서⁴⁵ 초간 annealing, 72ôC에서¹분간êxtention을^{1 cycle}로 25 cycles 반복하여총^PCR을 35 cycles 반응시켰다^.마지막 으로⁷²ô^C에서¹⁰분연장하고^PCR을종결하였다^.증폭된^DNA 의확인은 2.0% Seakem agarose(Dakara, Kyoto, Japan) gel 에서^{100 V 25}분간전기영동한후 ethidium bromide (1µ^g/

ml)로염색한후^UV로^{310 bp}를확인하여^{mec A}유전자를 확인하였다^.

Automated Repetitive Sequence Based PCR(Rep PCR)을 이용한 분자 유형별 판독

Repetitive Sequence Based PCR(Rep-PCR) 반응:

분리된 균주를 ultra clean TM microbial DNA isolation kit(MO Bio Laboratories Inc, USA)를사용하여^DNA를추 출하여^{25~50 ng/}µ^g으로농도를조절해서사용하였다^.추출 한^DNA를이용한^rep-PCR은 DiversiLab staphylococcus kit(Bacterial Barcord, USA)를이용해서 master mix 반응 액을 만들었다^. 반응액 조성은 rep-PCR MM1 18.0µ^l, geneAmp 10X PCR buffer 2.5µl, primer Mix 2.0µ^l, ampliTaq DNA Polymerase 0.5µ^l를전체^23.0µ^l로만든후 template DNA를²µ^l가한후^rep-PCR반응을시켰다^.반응 은 T gradient(Biometra, Germany) PCR 기기를이용하였 으며반응조건은초기 denaturation으로⁹⁴ô^C에서²분간반 응 시킨 후⁹⁴ô^{C 30}초간 denaturation, 45ôC에서³⁰초 annealing, 70ôC에서¹분³⁰초간êxtention하는것을^{1 cycle} 로하여^{35 cycles}을반응시키고⁷⁰ô^C에서³분간반응시 켰다^.

Agilent Bioanalyzer를 이용한 DNA lab chip의 결과 판독 DNA lab chip에^ladder와^marker가혼합된 gel-dye mix 를⁹µ^l주입하고 starting syringe를 이용해서^{DNA lab} chip에고정을시켰다^.고정후에각^well에⁵µ^l의^marker 를넣고^rep-PCR을산물을¹µ^l주입한후¹분동안^vortex 를 이용하여 잘 혼합한 후 agilent bioanalyzer(Agilent, USA)를 이용하여 결과를 판독하였다^{. PCR}산물은^150~

5,000 bp 사이에서해석하였다^. 결과 해석

결과는 DiversiLab Analysis Tool for Typing Reports 24529를이용하여판독하였다^[25].

균막(Biofilm) 형성 시험

Congo Red agar(CRA) Method를 이용한 Slime assay:

식품에서분리한²⁷⁵균주를 tryptic soy agar(Difco, Detroite, MI, USA)에 sucrose(Daejung, Gyronggi-do, Korea) 50 g/

L, congo red(Sigma, USA) 0.8 g/L를넣고¹²¹^o^{C 15}분멸 균한뒤사용하였으며^CRA배지에서³⁷^o^{C 24}시간배양후 에실온에서⁴⁸시간방치후검붉은색의점액층집락을양 성으로판정하였고분홍색인집락은음성으로판정하였다 [4, 6].

Plate를 이용한 균막(Biofilm) assay:식품에서분리한 275균주를 tryptic soy broth(Difco, USA)에³⁷^o^C에서²⁴시 간배양한균주를 0.25% glucose(Daejung, Korea)가포함된 tryptic soy broth로^1/40으로희석하여 이를 96 well flat- bottom polystyrene microculture plates에²⁰⁰µ^l넣고 37^oC에서²⁴시간배양하였다^.배양후에²⁰⁰µ^{l PBS}로³회 세척후에실온에서건조시킨후 1% crystal violet(Sigma- Aldrich, St Low's, MO, USA)으로¹⁵분간염색하였다^.염색 후에증류수로³회세척한후²⁰⁰µ^l의^PBS로채운뒤^{570 nm} 에서 multi detection microplate reader(BioTek, Vermont, USA)를이용하여흡광도를측정하였으며^blank의값을제 외수치가^0.15이상일때균막형성으로보았다^.각각의균 주는³회반복실험을해서평균값을선택하였다^[23].

분석 및 통계처리

SPSS version 12.0(SPSS inc, USA) 프로그램을이용하여 분석하였다^.비연속변수에대해서는χ^-제곱으로유의확률 p < 0.05 신뢰도구간으로통계학적유의성을해석하였으며 p < 0.1(경계역⁾인경우는유의한차이를인정하였다^.

결과 및 고찰

황색포도상구균의 항생제 내성 연구

2006년부터²⁰⁰⁸년사이에분리한황색포도상구균의항

생제에대한내성률(resistant)을^{Table 2}에나타내었다^.식 품에서분리한황색포도상구균²⁷⁵균주중에서²⁵⁹균주가 하나이상의항생제대해내성을보였으며이는전체균주 중^94.2%로^Rhee[19]의^90.9%보다는높은수치였다^{. 2006} 년분리균⁸⁰균주에대한내성률은 benzyl penicillin(P)에대 한내성률이^90.0%로가장높았고 fusidic Acid(FA) 17.5%, tetracycline(TE) 13.8%, gentamicin(GM) 7.5%, trimethoprim/

sulfamethoxazole(SXT) 6.3%, erythromycin(E) 3.8%, clindamycin(CM) 2.5%, ciprofloxacin(CIP) 1.3%였고^mupirocin (MUP)은 intermediate로^5.0%의내성률을보였다^{. 2007}년 분리균¹²¹균주에대한내성률은 benzyl penicillin(P)의내 성은 90.9%, fusidic acid(FA) 12.4%, gentamicin(GM) 8.3%, oxacillin(OX) 7.4%, erythromycin(E) 5.8%, tetracycline(TE) 1.7%로항생제내성을보였다^{. 2008}년분리균⁷⁴균주에대 한내성률은 benzyl penicillin(P)의내성은 95.9%, fusidic acid(FA) 13.5%, gentamicin(GM) 8.1%, clindamycin(CM)

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6.8%, erythromycin(E) 5.4%, tetracycline(TE) 5.4%, oxacillin (OX) 2.7%를나타냈다^.

2006년부터²⁰⁰⁸년까지의전체분리균주의항생제내성

은결과는^{Table 3}과같다. Benzyl penicillin(P)이^92.0%로 가장 높은 내성률을 보였으며 fusidic acid(FA) 14.2%, gentamicin(GM) 8.0%, tetracycline(TE) 6.2%, erythromycin (E) 5.1%, oxacillin(OX) 4.0%, clindamycin(CM) 2.5%, trimethoprim/sulfamethoxazole(SXT) 1.8%, ciprofloxacin(CIP) 0.4%이며중간내성(intermediate)은 fusidic acid(FA) 13.8%, erythromycin(E) 3.6%, clindamycin(CM) 1.5%, mupirocin (MUP) 1.5%, gentamicin(GM) 1.1%를나타냈다^.실험에사 용된나머지항생제에대해서는^100%감수성(susceptible) 을나타냈다. 국내유통식품에서분리한황색포도상구균의 주요항생제내성실태는^[7]김밥에서 benzyl penicillin(P)에 대한내성률이 100.0%, gentamicin(GM)이^0.0%로본실험

은 benzyl penicillin(P)의 내성이 김밥 88.8% gentamicin (GM) 8.0%로 gentamicin에서약간높은항생제내성을나 타냈다^.즉석섭취식품은특별한조리과정을거치지않고 섭취를하며^,제조과정에서사람에의해황색포도상구균이 오염될가능성이높고이로인해지역사회까지항생제내 성균이확대될우려가있다^[9].

2006년에서²⁰⁰⁸년동안의항생제내성패턴을보면²⁰⁰⁶ 년에는 ciprofloxacin(CIP)과 trimethoprim/sulfamethoxazole(SXT)에서항생제내성이있는균주가분리되어²⁰⁰⁷년

~2008년과는 다른 항생제 내성 양상을 보였다^{(Table 2).}

Benzyl penicillin(P)의 항생제 내성률은^90%이상으로

Hwang 등^[5]의유통축산물에서분리한황색포도상구균의

페니실린내성률^80%보다높은수준으로가공조리된식품 에서분리된황색포도상구균에서의페니실린항생제내성이 심각한 수준으로 생각된다^. 특히²⁰⁰⁶년의^mupirocin (MUP)의 intermediate인 균의 검출^(5.0%)과²⁰⁰⁷년과 2008년에 oxacillin(OX)에 대한 내성을 가진 균의 검출은 MRSA(Mechicillin Resistant Staphylococcus aureus) 내성 균주로유추되었다^{(Table 2).}

Table 3. Antibiotic resistance (%) of Staphylococcus aureus isolated various foods from 2006 during 2008.

Antimicrobial agents^a

Susceptibility (2006-2008) Susceptible

(%)

Intermediate (%)

Resistant (%)

P 8.0 0.0 92.0

CIP 99.6 0.0 0.4

CM 96.0 1.5 2.5

E 91.3 3.6 5.1

FA 72.0 13.8 14.2

GM 90.9 1.1 8.0

HAB 100 0.0 0.0

LNZ 100 0.0 0.0

MUP 98.5 1.5 0.0

FT 100 0.0 0.0

OX 96.0 0.0 4.0

QDA 100 0.0 0.0

RA 100 0.0 0.0

TEC 100 0.0 0.0

TEL 100 0.0 0.0

TE 93.8 0.0 6.2

SXT 98.2 0.0 1.8

TGC 100 0.0 0.0

VA 100 0.0 0.0

aAbbreviations as in Table 2 Table 2. Antibiotic resistance of Staphylococcus aureus

isolated from various foods from 2006 to 2008.

Antimicrobial agents^a

Antibiotic resistance(%)

2006 (N=80) 2007 (N=121) 2008 (N=74)

P 72 (90.0) 110 (90.9) 71 (95.9)

CIP 1 (1.3) - (0.0) - (0.0)

CM 2 (2.5) - (0.0) 5 (6.8)

E 3 (3.8) 7 (5.8) 4 (5.4)

FA 14 (17.5) 15 (12.4) 10 (13.5)

GM 6 (7.5) 10 (8.3) 6 (8.1)

HAB - (0.0) - (0.0) - (0.0)

LNZ - (0.0) - (0.0) - (0.0)

MUP - (0.0) - (0.0) - (0.0)

FT - (0.0) - (0.0) - (0.0)

OX - (0.0) 9 (7.4) 2 (2.7)

QDA - (0.0) - (0.0) - (0.0)

RA - (0.0) - (0.0) - (0.0)

TEC - (0.0) - (0.0) - (0.0)

TEL - (0.0) - (0.0) - (0.0)

TE 11 (13.8) 2 (1.7) 4 (5.4)

SXT 5 (6.3) - (0.0) - (0.0)

TGC - (0.0) - (0.0) - (0.0)

VA - (0.0) - (0.0) - (0.0)

aAbbreviations; Benzyl penicillin (P), Ciprofloxacin (CIP), Clin- damycin (CM), Erythromycin (E), Fusidic Acid (FA), Gentamicin (GM), Habekacin (HAB), Linezolid (LNZ), Mupirocin (MUP), Nitrofurantoin (FT), Oxacillin (OX), Quinupristin/Dalfopristin (QDA), Rifampicin (RA), Teicoplanin (TEC), Telithromycin (TEL), Tetra- cycline (TE), Trimethoprim/Sulfamethoxazole (SXT), Trigecy- cline (TGC), Vancomycin (VA)

(5)

식품별로분리한황색포도상구균의항생제내성은¹⁹가지 시험한항생제중초밥은 P, OX, GM, CM, TE, FA, MUP, SXT에내성이 있었으며김밥은 P, OX, GM, CIP, E, TE,

FA, SXT의⁸가지 종류의 항생제에서 내성을 나타냈다^.

MRSA의내성과관련있는^oxacillin이나^mupirocin에내성 이 있는 균주는 초밥^,김밥^,냉면에서 검출되었다^.특히

MRSA 균주가검출된초밥과김밥은주로작업자의손을많

이거치는식품이며^{, Wei}등^[24]에의하면황색포도상구균 식중독은주로작업자에의해발병한다고하였다^.그러므로 황색포도상구균에의해식품이오염되지않도록작업자가 개인위생을철저하게하여식중독을예방하여야하며항생 제내성과황색포도상구균의관계에대한지속적인연구를 통해항생제내성을감소시킬수있는방안을모색할필요 성이있다^.

황색포도상구균의 다제 내성 유형

식품에서분리한황색포도상구균의다제내성의유형은시 험에사용된¹⁹가지항생제에대해내성을보인균주중에 6균주^(2.3%)에서⁵가지항생제에서내성을보였으며⁴가지 항생제에내성을보인균은³균주^{(1.2%), 3}가지항생제에내 성을보인균은²⁷균주^{(10.4%), 2}가지항생제에내성을보 인균은⁷⁰균주^(26.9%)이며전체균주중³개이상의항생 제에내성을보인균은³⁶균주^(13.8%)며²가지이상항생제 에 다제 내성을 보인 균은¹⁰⁶균주^(40.7%)로 나타났다^. oxacillin이나^mupirocin에내성을가진균주는다제내성을 보였다^{. Park}등^[16]에의하면 methicillin 내성균주의경우 는다른항생제에도내성률이함께증가하는경향을보인다 고하였다^.

Benzyl penicillin과 fusidic acid에내성을가진균은⁴³균 주^(16.5%)로가장높은검출률을나타내었다(Table 4). 식품 에서검출된황색포도상구균이이미다제내성을획득했으 며다제내성균에의해식중독이발생하였을때는진단과 치료의어려움이예상된다^.또한지역감염이나병원내² 차감염의원인균으로전이될가능성이있다^.그러므로황 색포도상구균으로부터의오염에의한식품의안전성확보가 필요하며식품에서분리된항생제내성황색포도상구균과 지역사회나병원에서분리된황색포도상구균의항생제내성 에대한비교^,분석연구를통해서오염경로의파악및오 염원의사전차단이필요하다고생각된다^.

Oxacillin 내성 균주에 대한 mec A 유전자 확인 Oxacillin(OX)에대한내성을가진균중^MRSA로유추되 는¹¹균주에대해서^PCR을이용해^{mec A}유전자를확인한 결과¹¹균주에서유전자가검출되었다^{. Kim}등^[4]에의하면 oxacillin(OX) 내성균주에^{mec A}유전자가모두양성으로

검출된것과동일한결과를얻었다^.이들 균주는^cefoxitin screen에서모두양성을나타냈으며 penicillin에내성이있 으며^seg유전자를모두가지고있었다(data not shown). 특 히²가지이상항생제에다제내성이있었다. Oxacillin 내 성과다제내성과는 p < 0.01 이하로유의성이매우높았다^. Lim 등^[14]에의하면^MRSA에의한오염은사람이나작 업표면^,주방도구등으로도확산되고^Kwon등^[12]에의하

면지역사회일반인손에서^MRSA의분리률이^18.1%였고

항생제에많이노출되어있을수록높은분리률을나타낸다 고보고하였다^.또한^Lee등^[13]에의하면한국과일본에서 주로발생하는식중독은식품을손으로다루는과정에서주 로발생한다고하였다^.그러므로김밥^,초밥등의즉석섭취

식품에서^MRSA에의한노출빈도가높으며오염된식품은

여러가지경로로확산될우려가있다^.만일^MRSA에의해 식중독이발생하였을때는치료등의여러가지심각성을야 기할우려가있다^.그러므로정확한오염원추적을통해서 황색포도상구균에의한식품의오염을사전에방지해야하 며황색포도상구균의항생제내성에대한심각성을인지하 고이에대한확산을방지하여야한다^.

Table 4. Patterns of multidrug-resistance to of Staphylo- coccus aureus isolated from food samples from 2006 to 2008.

No. of antimicrobial

agents

Resistant patterns No. of isolates

Total (%)

5

P OX GM E FA 1

6 (2.3)

P GM E TE FA 1

P TE FA MUP SXT 4

4 P OX E FA 1 3

(1.2)

P OX GM E 2

3

P OX E 4

27 (10.4)

P GM FA 15

P GM E 1

P E FA 6

CIP E TE 1

2

P OX 3

70 (26.9)

P GM 4

P TE 11

P SXT 1

P FA 43

P E 7

GM FA 1

1 P 149 154

(59.2)

FA 5

(6)

Automated Repetitive-Sequence-Based PCR(Diversi- Lab)에 의한 다제 내성균에 대한 유형별 패턴 비교

4가지이상항생제에서다제내성이있거나^oxacillin에내 성이있는²⁰균주에대해서 automated Repetitive-Sequence- Based PCR(DiversiLab)을이용하여균주의유형별패턴을 비교하였다(Table 5). 비교균주는²⁰⁰⁶년⁶균주^{, 2007}년⁹ 균주^{, 2008}년⁵균주를사용하였다. DiversiLab에의한유전 학적 상동성을 비교한 결과 DiversiLab analysis tool for typing reports 24529에 의해^90%이상의 상동성으로⁶ Cluster로구분되었다(Fig. 1). Cluster I은 kfri 15, kfri 17, kfri 14, kfri 8, kfri 10, kfri 19, kfri 20, kfri 11, kfri 12, kfri 9(10균주⁾로^99%이상의유전자상동성을가지고있으 며 Cluster II는 kfri 1, kfri 2, kfri 3, kfri 4, kfri 5, kfri 6(6균주⁾으로^99%이상의유전자상동성을가지고있으며 Unique type I~Unique type IV(kfri 7, kfri 13, kfri 16, kfri 18)은각하나의균주로분리되었다^.특히^{Cluster I}은^oxacillin

내성이있는균주거나^{mec A}유전자를포함하고있는균주

이고 Cluster II는 oxacillin 내성이없는균주이며²⁰⁰⁶년에 분리된균주였다^.특히^{Cluster I}에포함되어있는^{kfri 17}은 항생제시험에서는^oxacillin에내성이없었으나^{mec A}유전 자를보유하고있었다. Unique type I로구분되는^{kfri 7}균 주는 oxacillin 내성을가지고있으나^{Cluster I}과는다른패

턴을가지고있었다^.그러나전체적인유사도는^90%이상으

로유사한오염원에서분리된균주라추측된다. Unique type II로구분되는^{kfri 13}은분리된균주중에서가장높은다 제내성을지니고있는균주였다. Unique type III와^Unique

type IV는같은항생제내성패턴을지녔으나다른시료에서

분리되었다^.

기존연구에서유전학적상동성연구는식중독이발생시 역학조사를위해임상균주와식재료에분리된균주에대 해단편적인조사목적으로사용하거나^MRSA와같이특정 항생제에내성이있는균주들에대한연구를하거나^,병원 에서감염되는균주에대한연구는활발히진행되고있다^. 그러므로다년간시중유통중인식품에서분리한황색포도 상구균에대한독소유전자^,항생제내성등에따른유전학 적상동성분류에대한연구는미흡한실정이다^.최근에개 발된 DiversiLab을이용한유전자상동성분석^profile에대 한연구가많이되고있으며, DiversiLab을이용한분석은 PFGE(pulsed field gel electrophoresis)에 비해^intra-, interlaboratory 간의재현성이매우높은[20, 21, 25]장점 이있다^.그러나고가의분석비용으로인해서많은^profile 을 보유하고 있지 않다는 단점이 있다^. 따라서 향후

DiversiLab을통한식품에서분리된황색포도상구균에대

한유전자상동성에대한 많은^profile을수집하여서오염

원의추적과분리된균의독소및항생제내성등의생화학

적특징과의연관성에대한연구를통해식중독을미연에 방지할수있는연구가필요하다고 생각된다^.

황색포도상구균에 의한 균막 (Biofilm) 형성

식품군별 congo red agar에의한 slime production assay 로균막형성에대한양성결과균막양성균주는²⁷⁵균주중

67균주로^24.4%였으며크림이포함된빵이나케이크에서분

리한균주에서^34.3%로가장많은균막형성균주를검출하

였다. Biofilm assay로균막양성인균주는^30.5%이며초밥 에서분리한균주가^34.5%로가장많이형성되었다^{. (Table} 6) 항생제내성과균막형성률과의상관관계를분석해보면 slime 형성균주는 fusidic acid(FA), mupirocin(MUP)의단 일 항생제의 내성과 통계적 의미를 확인 할 수 있었고 (p < 0.05) tetracycline(TE)에서유의한차이(p < 0.1)가인정 되었다. Biofilm assay에 의한 균막 형성은^mupirocin (MUP)과 oxacillin(OX)에서유의한차이(p < 0.1)가인정되었 다^.그러나^,다른단일항생제내성과다제내성균의수에있 어서균막형성은상관관계가없었다(Table 7). Kwon 등^[11]

은다제내성항생제의수가많을수록균막형성을잘하는 Table 5. Characterization by DiversiLab of Staphylococ- cus aureus.

Test

strain Resistant patterns Source Year

kfri 1 P TE FA MUP SXT Sushi 2006

kfri 5 P GM ICR^aE Kim bab 2006

kfri 6 P GM E TE FA Ice-noodle 2006

kfri 7 OXSF^bP OX Sushi 2007

kfri 8 OXSF P OX E Sushi 2007

kfri 11 OXSF P OX Kim bab 2007

kfri 12 OXSF P OX Ice-noodle 2007

kfri 13 OXSF P OX GM ICR E FA Ice-noodle 2007 kfri 14 OXSF P OX GM ICR E Kim bab 2007

kfri 16 P ICR E FA Sushi 2008

kfri 17 P ICR E FA Sushi 2008

kfri 18 P ICR E FA Cream cake 2008

kfri 19 OXSF P OX ICR E FA Sushi 2008

kfri 20 OXSF P OX GM ICR E Sushi 2008

aAbbreviations; Inducible Clindamycin Resistance (ICR)

bAbbreviations; Cefoxitin Screen (OXSF).

(7)

것을확인한연구와는다른결과를나타났다^.이는^Kwon등

[11]은임상균주에서³⁰가지항생제에대한다제내성률을

비교하였고임상균주는식품균주보다항생제내성률이높 기때문에이와같은결과가나왔으리라생각된다^{(Table 8).}

Fig. 1. Rep-PCR generated dendrogram for the 20 Staphylococcus aureus isolates form 2006-2008.

An SI cutoff 95% was used for interpretation of relatedness as depicted by the vertical line.

(8)

Table 8. Frequency of biofilm formation according to the number of antimicrobial agents.

No. of antimicrobial agents

Slime production assay (%)

Biofilm assay (%)

0 3 (20.0%) 6 (40.0%)

1 26 (17.0%) 43 (28.1%)

2 23 (37.1%) 18 (29.0%)

3 10 (37.0%) 11 (40.7%)

>4 5 (27.8%) 6 (33.3%)

Total 67 (24.4%) 84 (30.5%)

Table 6. Biofilm formation of Staphylococcus aureus from various foods.

Source Slime production assay (%)

Biofilm assay (%)

Sushi 39 (27.5) 49 (34.5)

Kim bob 11 (22.0) 10 (20.0)

Cream cake 12 (34.3) 12 (34.3)

Ice-noodle 4 (11.4) 9 (25.7)

cooked meat 1 (7.7) 4 (30.8)

Total 67 (24.4%) 84 (30.5%)

균막은식품재료나작업환경에부착된세균이완전히제 거되지않았을경우형성되고균막이형성된균은생물학적 전이가일어나게된다^.이렇게전이가일어나면항생제나항 균제에내성이지닌균주가생성된다^.균막을형성한균주가 식품이나작업환경등에존재하게되면항균제에내성이생 겨서식품의보존성이떨어지게되며최종적으로식품의위 생적인문제를야기하게된다[2, 6, 10]. 또한항생제내성을

지닌균주가균막을형성하여질병을일으킨다면치료가어 려워질수있다^.그러므로식품환경및식품에서분리된균 주에대한균막형성과의상관관계에대한연구및균막이 형성된균주에대한효과적인제어방법에대한연구및식 품을취급하는환경에서황색포도상구균의균막형성을억 제하기위해균막형성과정이나조건^,메카니즘등의연구 가필요하다고생각된다^.

요 약

2006년부터²⁰⁰⁸년까지다양한식품에서분리한황색포

도상구균²⁷⁵균주에서하나이상의항생제에내성을보인 균주는²⁵⁹주^(94.2%)이며 benzyl penicillin(P)이^92.0%로 가장높은내성률을보였다. 106(40.7%) 균주가²가지이상 의항생제에대하여내성을나타났으며³가지이상항생제 에내성을보인균도³⁶주^(13.8%)였다. Vancomycin에대해 서는내성을보인균주는없었다^.

식품별로는초밥과김밥에서검출된균주는⁸종류의항생 제에각각내성을나타냈으며^MRSA균주는¹¹주⁽전체²⁷⁵ 주⁾가^4%검출되었다. Oxacillin 내성균은다제내성균주였 다. Automated repetitive sequences based PCR microbial typing system(DiversiLab)으로 oxacillin 내성이있거나다 제 내성인²⁰주에 대해 유형을 분석한 결과 DiversiLab Analysis Tool for Typing Reports 24529에의해^90%이상 의상동성은²개의^Cluster과⁴개의 unique type으로구분되 었다^.

Congo red agar에 의한 slime production assay로균막 형성에대한양성결과균막형성양성은²⁷⁵균주중⁶⁷균 주로 24.4%, biofilm assay로균막양성인균주는^30.5%이며

초밥에서분리한균주가^34.5%로가장많이형성되었다^.

항생제내성과균막형성율과의상관관계를분석해보면 slime 형성균주는 fusidic acid(FA), mupirocin(MUP)의단

일항생제의내성과통계적의미를 확인할수있었다(p <

0.05). 다제내성균의수와균막형성은상관관계가없었다^. Table 7. Correlation between antimicrobial agents and

slime production.

Antimicro- bial agents

Slime production

assay (%) Biofilm assay (%) Resistant Signifi-

cance Resistant Signifi- cance P 63/253 (24.9) NS 76/253 (30.0) NS CIP 0/1(0) NS3 0/1 (0)0.0 NS

CM 3/11 (27.3) NS 4/11 (36.4) NS

E 6/24 (25.0) NS 5/24 (20.8) NS

FA 33/77 (42.9) p< 0.05 28/77 (36.4) NS

GM 7/25 (28.0) NS 10/25 (40.0) NS

HAB 0/0 (0) NS 0/0 (0)0.0 NS

LNZ 0/0 (0) NS 0/0 (0)0.0 NS

MUP 4/4 (100) p< 0.05 4/4 (100) p< 0.1

FT 0/0 (0) NS 0/0 (0)00 NS

OX 1/11 (9.1) NS 0/11 (0)0.0 p< 0.1

QDA 0/0 (0) NS 0/0 (0)0.0 NS

RA 0/0 (0) NS 0/0 (0)0.0 NS

TEC 0/0 (0) NS 0/0 (0)0.0 NS

TEL 0/0 (0) NS 0/0 (0)0.0 NS

TE 7/17 (41.2) p< 0.1 8/17 (47.1) NS

SXT 4/5 (80.0) NS 4/5 (80.0) NS

TGC 0/0 (0) NS 0/0 (0)0.0 NS

VA 0/0 (0) NS 0/0 (0)0.0 NS

bNS: not significant