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•교신저자: 이길호, 단국대학교 의과대학 비뇨기과학교실
충남 천안시 안서동 산 29
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만성전립선염 진단에 광범위한 세균 유전자증폭법의 유용성과 그 한계
단국대학교 의과대학 비뇨기과학교실
이 길 호
[Abstract]
The Usefulness and Limitation of Bacterial Genetic Amplification Method for Diagnosis of Chronic Prostatitis
Gilho Lee
From the Department of Urology, Dankook University College of Medicine, Cheonan, Korea
Some urologists have insisted that fastidious and nonculturable microorganisms may be important in the etiology of idiopathic chronic prostatitis. The bottom-line is that the diagnosis of infectious causes which only detected by genetic amplification methods have theoretically serious defects and incurs determinant misinterpretations if not used by an appropriated method. In Korea, the amplification method to detect fastidious bacteria has been widely used in out-patient clinics without criticism, which phenomenon is unusual or can not understand in the eyes of foreign scientists. Moreover, many urologists who care the patients, even patients, can not believe the PCR results. Under some situations, because the amplification results from some commercial companies make the situations in a mess or more complicating to understand idiopathic chronic prostatitis, so many people have a question that “Is it a right result or is our approach right?”. Herein, I will discuss what the real problems are, and why the results are contradictious in Korea.
Finally I will give a suggestion about “we are on the right way”. (Korean J UTII 2008;3:37-42)
Key Words: Chronic prostatitis, Diagnosis, Organism, Polymerase chain reaction
서 론
만성전립선염으로 많은 환자가 비뇨기과에 방문
하여 치료 받지만 환자나 치료를 담당하는 의사 모 두 그 치료결과에 만족하지 못하는 경우가 많다. 환 자들이 치료에도 불구하고 질병은 만성화로 진행되 며, 질병 또한 높은 유병률을 보이고, 많은 환자들 이 인내하기 힘든 심한 증상을 보여, 그런 환자를 방치할 수도 없다.1
치료를 위해서는 그 원인 규명이 필수적이다. 만성
전립선염의 원인에 대하여 많은 논란이 있어 왔다.
특발성만성전립선염 (idiopathic chronic prostatitis, NIH 분류 category III, 이하 만성전립선염)의 원인은 세균에 의한 염증, 골반 신경근육이상, 화학적 물질 에 의한 자극, 혹은 면역체계의 이상 등이 알려지고 있다.2 많은 환자들이 항생제 치료 후 증상의 호전 을 보이고, 전립선액 검사에서 다수의 염증 세포가 관찰되며, 전립선염은 성행위가 시작된 후에 발생 한다는 점을 고려한다면 세균 감염이 이 질병의 유 력한 원인으로 간주할 수 있다. 하지만 세균에 의해 질병이 발생한다면 코호의 3원칙에 합당하여야 한 다. 즉 병든 부위에서 원인균 추출이 가능하여야 하 고, 이를 외부에서 배양하여 다시 인위적인 접종을 시행한다면 일정한 시간이 경과 후 접종한 조직에 서 동일한 균을 동정할 수가 있어야 한다. 하지만 이러한 원칙을 전립선염에 대입하면 매우 난감한 문제에 봉착하게 된다. 먼저 인간 전립선은 설치류 등의 실험동물과 다르게 특이한 해부학적 혹은 발 생학적 특징을 가져 실험동물을 이용한 만성전립선 염 증명이 불가능하고, 또한 전립선은 방광과 요도 및 직장과 매우 근접해 있어 이들 조직에 존재하는 균들에 의한 교차오염을 인위적으로 완전하게 배제 할 수가 없다는 점이다.3 설령 오염이 안된 전립선 액을 추출하였다고 하여도 이 전립선액이 배양기에 자랄 가능성 또한 확실하지 않다. 하지만 배양을 할 수 없으면 균이 없는 것인가? 1980년도에 유전자 증 폭법을 발견한 후 생태계에서는 배양되지 않지만 존재가 알려진 많은 원핵생물들이 있음을 알게 되 었으며, 배양하고 동정의 과정을 거쳐 그 실체가 규 명된 균은 동정되지 않는 균과 비교하면 극히 일부 에 불과함을 알게 되었다. 결론적으로 균이 배양되 지 않는다고 균이 없다고 하는 것은 올바른 추론이 아니고, 그 균은 아직 적당한 배양조건을 찾지 못해 그 윤곽만이 보일 뿐이다.4
1996년 Krieger 등5은 만성전립선염 환자의 전립 선조직에서 DNA를 추출하고, 유전자 증폭법을 이 용하여 전립선염 환자에서 발견되는 26개의 균 염 기서열을 발표하였다. 또한 이들 염기서열을 분석 한 후 만성전립선염의 주요 원인균은 기존의 배양 가능한 클라미디아, 마이코플라즈마, 트리코모나스
가 아니고 배양되지 않는 미생물 (cryptic organism) 이라고 보고하였다. 많은 과학자들 및 비뇨기과 의 사들은 이제 만성전립선염의 판도라 상자가 열렸다 고 평가하였다. 하지만 우리가 알고 있는 것처럼 판 도라 상자란 매우 복잡한 의미를 가지고 있는 단어 로 판도라 상자가 열린 후 신은 인간에게 희망을 주 었지만 동시에 좌절을 선물하였다.
국내에서는 일부 연구자에 의해 상기 주제에 관 해 연구되고 있었으나, 최근 들어 이를 상업적으로 이용하여 만성전립선염을 유전자 증폭법으로 진단 하는 연구기관이 생기고 있다. 하지만 저자가 전술 한 것과 같이 유전자 증폭법을 이용한 전립선염 진 단은 판도라 상자를 여는 것과 같아 그 방법, 그리 고 결과의 한계점을 이해하는 것이 매우 중요하다.
본 론
유전자 증폭법의 유용성과 한계점을 이해하기 위 해서는 Krieger 등5의 검사 방법을 이해하는 것이 중 요하다.
1. Krieger 방법5
1) 전립선검체 채취
만성전립선염 증상을 호소하는 환자에게 동의를 받고 오염 방지를 위해 double sheath technique를 이용 하여 회음부를 통한 전립선 조직검사를 시행하였다.
2) 전립선 조직에서 genomic DNA 추출
추출한 전립선조직에는 숙주의 genomic DNA와 균이 있다면 균의 genomic DNA가 있다고 가정할 수 가 있다. 이를 proteinase K를 이용하여 조직을 완전 용해 후 sodium acetate 및 95%, 70% alcohol을 이용 하여 DNA를 정제한 후 genomic DNA를 추출하였다.
3) 추출된 genomic DNA에서 균 유전자 증폭 이 과정을 이해하기 위해서는 약간의 생물정보학 (bioinformatics) 지식과 분자생물학 지식이 필요하 다. 먼저 모든 균의 genomic DNA를 증폭할 수 있는 공동 염기서열 (universal primer)를 설계하는 것이
본 방법의 핵심이라고 할 수가 있다. 사실 Krieger방 법의 핵심이라고 할 수 있으며 그 또한 이를 이용하 여 많은 논문을 발표하였지만 아직까지도 91E, 13B 로 명명하고 그 염기서열은 발표하지 않고 있다. 이 에 저자는 저자 독자적으로 universal primer를 설계 하였으며 그 결과를 2003년 대한비뇨기과학회지에 발표하였다.6 저자의 결과를 Krieger의 염기서열과 비교하면 두 염기 서열은 거의 일치함을 알 수 있으 며, 또한 Krieger의 증폭부위와 저자의 증폭 부위가 같음을 알 수가 있다.6 저자의 방법은 매우 간단한 논제에서 시작하였다. 즉 진화론적으로 보면 구조 가 간단한 세균에서 장구한 세월을 거쳐 더욱 복잡 하고 다양한 기능을 하는 세균으로 진화되어 가는 데 이 중 특정 염기서열은 억겁의 진화 과정에도 거 의 변화하지 않는다고 알려지고 있다. 그 염기서열 은 종에 따라 매우 유사한 것으로 알려지고 있으며, 대표적인 유전자가 단백질 생성에 관여하는 16S rDNA이다. 이에 저자는 기존에 배양이 가능하여 동 정된 균의 염기서열 뿐만 아니라 배양되지 않는 세 균의 16S rDNA 염기서열 약 150개를 모았으며 이 를 여러 생물정보학을 이용하여 universal primer를 찾았다.6 이 염기서열은 약 470bp를 증폭할 수가 있 으며 증폭되는 공동 염기서열 사이에는 서로 염기 서열이 일치하지 않아 나중에 유전자 증폭법 및 자 동염기서열 분석장치에 쉽게 염기서열을 알 수 있 게 하였다.6
4) Sequencing vector cloning
Krieger는 자신이 개발한 universal primer와 환자 에서 추출한 genomic DNA를 주형으로 이용하여 유 전자 증폭법을 시행하였다. 이 때 증폭되는 산물 안 에는 이론적으로 존재할 수 있는 모든 다양한 균의 염기서열이 혼합되어 있어 그 실체를 규명하기 위 해 direct sequencing 방법으로는 염기서열을 해독할 수가 없다. 이를 해결하기 위해 즉 균의 이름을 알 기 위해서는 sequencing vector에 유전자 증폭산물을 결합시켜야 한다. Ligation 과정을 거쳐 증폭된 유전 자를 plasmid 형태로 만들고 이를 competent cell (세 균)에 넣고 항생제가 들어있는 배양배지에 키우면 다음 날 배양판에 여러 개, 경우에 따라서는 무수한
집락이 발견된다. 한 집락에는 한 개의 plasmid가 들 어있어 즉 하나의 DNA만 있어 이를 배양액에 넣고 세균을 진탕 배양을 시행하면 세균 안에 들어있는 DNA량 또한 증폭된다. 이들 배양된 세균에서 plasmid 형의 DNA를 추출하고 이를 agarose gel에 주행 시켜 vector만 들어간 집락은 배제 시키고 유 전자 증폭산물을 찾아낸다.
5) 자동염기서열를 이용한 세균의 특성
Vector의 염기서열을 이용하여 삽입된 균 유전자 를 해독하고 이를 미국국립보건원 server에 접속하 여 균의 이름을 확인하였다.
2. Krieger연구 결과5
Krieger 등의 결과에 따르면 많은 비뇨기과 의사 들이 전립선에서 발견될 것으로 추정하였던 특이적 원인균 즉, Mycoplasma genitalium, Chlamydia tracho- matis, Trichomonas vaginalis은 단지 8%에서만 검출 되었으며, 특히 많은 문헌에서 원인균으로 주장되 어 왔던 Chlamydia는 3%에서만 검출되어 상기 특이 균들은 특발성만성전립선염의 원인이 아니라고 추 정하였다. 반면에, 비특이적인 유전자인 원핵생물의 16S rDNA가 특발성만성전립선염 환자의 77%에서 양성으로 검출되었다. 이러한 소견은 기존의 전립 선염 진단에 쓰이는 전립선액에서의 백혈구 수와 일치되는 상관관계를 보여, Krieger 등은 여러 가지 이유로 배양되지 않는 원핵생물이 특발성만성전립 선염의 원인이라고 주장하여 이들 염기서열을 발표 하였다 (Fig. 1).
3. 오염 방지 대책5
Krieger 등5은 오염에 대한 많은 반론을 생각해서 철저한 항오염처치를 시행하였다. 전립선조직검사 도 회음부를 통하여 double sheath 방법으로 시행하 여 항문으로부터 오염을 방지하였으며 또한 회음부 피부에서 검출한 16S rDNA 염기서열과 S. epider- midis의 16S rDNA의 염기서열이 98% 일치하고, 환 자의 전립선에서 검출한 16S rDNA와는 50% 이하
gi: 4633104 gi: 4633096 gi: 4633090 gi: 4588121 gi: 4588126 gi: 4633101 gi: 4633088 gi: 4588124 gi: 4588122 gi: 4633099 gi: 4588123 gi: 4633100 gi: 4633097 gi: 4633098 gi: 4633093 gi: 4588127 gi: 4633103 gi: 4633102 gi: 4633089 gi: 4633095 gi: 4633091 gi: 4633092 gi: 4633105 gi: 4588125 gi: 4633094 gi: 4588128 Fig. 1. Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences.
Table 1. 16S rDNA sequence alignments showing Kriegr's sequence of A. hydrophilia and other prokaryotic sequences from NCBI's public database. A267 means position 276 of Krieger's sequence of A. hydrophilia. All sequences were well aligned
A267
↓
5'-GA--- GCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCACGTN-3' A. hydro 5'-GA--- GCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCG-ATT-3' SEQ1 5'-GA--- GCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCACGTA-3' SEQ2 5'-GA--- GCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCG-GTC-3' SEQ3 5'-GACGAGCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGG-GTT-3' SEQ4 5'-TA--- GCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGC-GTT-3' SEQ5 Bold characters are miss matched nucleotides
로 일치도가 낮아 그들의 결과가 피부로부터의 오 염이 아니라는 것 또한 증명하였다.
4. Krieger 발표 이후 다른 사람의 연구
Krieger 등5의 발표가 있고 난 후 Keay 등7은 만성 전립선염 과거력이 없었던 국소전립선암 환자가 brachytherapy를 받을 때 상기 Krieger의 방법으로 회 음부를 통해 조직검사를 시행하여, 9명 중 8명에서 16S rRNA를 검출하였다. Keay 등7의 결론은 전립선
암의 원인으로 염증이 중요한 역할을 하였거나 아 니면 상기 Krieger의 실험5이 오염이라고 생각하였 다. 그러나 Hochreiter 등8이 28명의 장기이식환자에 서 추출한 전립선에서 16S rRNA가 검출되지 않았 으며, 염증세포를 동반한 전립선비대조직과 암조직 에서 16S rRNA에서 양성으로 검출되었다. 또한 Keay 등7의 환자군이 brachytherapy 받기 전에 경직 장으로 전립선조직검사를 받은 기왕력이 있어 Keay 등7의 16S rRNA 검출은 오염으로 추정하고 Krieger 의 실험이 옳다는 것을 반증하였다. 또한 Hochreiter
등8의 실험에 의하면 전립선비대증으로 두 달간 항 생제를 치료받은 환자에 있어서도 16S rRNA가 양 성으로 검출된 것으로 보아 16S rRNA는 예민하게 염증을 검출 할 수 있으며, Keay 등7의 경우와 같이 일정한 시간 전에 경직장으로 전립선암검사를 시행 하거나, 감염으로 지속적으로 항생제를 사용하여도 16S rRNA는 양성으로 검출될 것으로 생각한다.8 국내에서 시행 발표된 저자의 결과6를 Krieger 등 이 발표한 A. hydrophilia 염기서열과 비교하였는데 본 저자의 염기서열이 우연히도 일치함을 발견하였 다 (Table 1). 특히 본 연구의 염기서열 SEQ2의 경우 발표된 부분적인 A. hydrophilia 염기서열과 100% 일 치하였으며 이 군에 속하는 대표적인 원생생물은 Aeromonas가 있었다. SEQ3의 경우 A. hydrophilia와 비교하면 267번 위치의 A가 G로 변이되고 C가 소실 되었다. SEQ3군의 대표적인 원생생물은 대장균 등 이 있다.9
5. 판도라 상자
1) 유용성
전립선염 치료를 위해서는 그 질병의 실체를 이해 하는 것이 매우 중요하다. 하지만 과거에는 실체가 없고, 실체가 있더라도 그 이론적인 기반이 매우 취 약한 방법에 의존하여 전립선염을 진단하고 치료 하 였다. Krieger 연구의 가장 큰 임상적인 의의는 우리 가 싸워야 할 실체를 드디어 본 것이다. 왜 만성전립 선염에서 항생제가 효과가 있는가? 왜 만성전립선염 환자의 전립선액에서 염증 소견을 암시하는 백혈구 가 관찰되는가? 항생제 치료 후 왜 백혈구 수치가 호전되는가 등 많은 물음에 명쾌한 답. 그것은 잘 배 양되지 않는 cryptic organism에 의한 감염에 의한 것 즉, 그 실체를 명확하게 볼 수 있게 한 것이 Krieger 의 가장 큰 업적이라 할 수 있다. 하지만 우리는 아 래의 제기되는 문제점으로 힘들게 열었던 판도라 상 자를 다시 닫아야 하는 현실에 직면하게 된다.
2) 문제점
Krieger 방법의 가장 큰 문제점은 그 접근 방법이 광범위하게 쓰이기에는 비현실적이라는데 있다. 그
문제점을 하나 하나씩 짚어보자.
(1) 검체
Krieger 방법에 의거하면 검체는 회음부를 통한 전 립선 생검 조직이다. 회음부를 통한 전립선 생검은 경직장생검 보다 어렵고, 환자에게 더 많은 인내를 요구한다. 우리나라에서 편법으로 사용되고 있는 방 법 즉 전립선액을 사용하는 것은 외부로 통한 요도 입구의 오염으로 정확한 검사를 기대할 수는 없다.
검사에서 양성으로 나온다고 해도 이것은 요도에 정 상적으로 상주하는 균에 의한 것인지 아니면 전립선 에서 유래되었는지 알 수가 없다는 점이다.
Universal primer의 문제점: 모든 균을 증폭시킬 시 동염기서열이 본 연구에 가장 중요한데 문제는 Krieger가 아직까지도 그 염기서열을 발표하지 않고 있다. 편법으로 기존에 발표되었던 염기서열 즉 대 장균의 염기서열을 기초로 만든 시동염기서열이 많 이 사용하는데 이들 염기서열을 가지고는 배양되지 않는 cryptic organism이 증폭 가능한 지를 확인할 수 가 없다는 점이다. 즉 대장균을 기초로 한 universal primer 염기서열은 대장균과 그 계통수가 비슷한 균 만을 선택적으로 증폭시킬 가능성이 많고, 계통수가 멀리 있는 세균에 대해서는 증폭이 불가능할 가능성 이 매우 높기 때문이다.
(2) 균을 확인할 때의 문제점10
Krieger는 균의 이름을 확인하려고 증폭된 DNA를 sequencing vector에 결합하는 과정을 거치고 이를 배양판에 성장 시키고 자란 균주를 다시 액체배양 액에 성장을 시키고, 여기에서 DNA를 추출하고, agarose gel에 주행시켜 올바른 균주인가를 확인한 후 자동염기 서열 분석장치에 걸어 균주의 이름을 확인하였다.
상기 과정 가운데 시간절약을 위해 여러 가지 편 법이 있을 수가 있겠지만 기본적으로는 이 과정은 매우 복잡하여 능숙한 솜씨를 가지는 연구원이라고 해도 3∼4일 정도 시간이 소요된다. 또한 배양판에 서 집락을 확인하는 과정에서 얼마나 많은 집락을 확인 하여야 올바른 진단법이 되는 가에는 많은 논 란이 있을 수가 있다. 물론 모든 집락을 다 확인한 다면 이론적으로 완벽하겠지만 시간과 경제적인 측
면을 고려한다면 이 또한 불가능하다. Krieger가 논 문에 발표한 것처럼 한 검체에서 여러 개의 세균이 동정될 수 있다는 점을 고려한다면 오염이 심각한 전립선액에서 추출된 검체에서는 많은 수의 집락이 자랄 것으로 것이고 이 모든 과정에 많은 시간과 돈 이 필요하다.
시중에 상용되고 있는 방법은 정확하게 알 수는 없지만 위와 같이 저자가 기술한 고전적인 방법을 사용하지 않고 만성전립선염의 원인균으로 추정되 는 10∼15개의 균주를 대상으로 선택적인 증폭을 시 행하여 그 결과를 보고하는 것 같다. 하지만 아직까 지 비교적 잘 알려진 만성세균성전립선염의 원인균 조차 확실하게 정립되지 않는 현실에 만성세균성전 립선염 환자에서 발견되는 균주를 특발성만성전립 선염 진단에 이용하는 것은 올바른 접근 방법이 아 니며, 특히 Krieger의 주장 즉 특발성만성전립선염의 원인균은 배양되지 않는 cryptic organism이라는 사실 에 의거하면 선택적인 균주 증폭은 특발성만성전립 선염 진단이나 이해에 혼선만을 가져올 수가 있다.
만성세균성전립선염 진단은 VB1, VB2 요의 배양 결과와 EPS, VB3 요의 배양결과를 비교하여 정량적 인 개념 즉 10배 이상 집락이 많이 자라는 경우에만 진단이 가능한 점을 고려한다면 정성적으로 단순하 게 매우 민감한 유전자증폭법을 사용하여 전립선액 에서 그렇고 그런 균이 검출된다고 하여 그 균이 특 발성만성전립선염의 원인이라고 단정할 수가 없다.
또한 실험적인 오류로 균이 배양판에서 자라지 않으 면 이를 증명할 수가 없는 것 또한 큰 문제이다.
결 론
Krieger의 발표는 매우 매력적이기는 하지만 상기 의 한계점으로 우리는 다시 판도라 상자를 닫아야 할 시점에 도달하였다. 하지만 그 이론은 매우 매력 적이고 Stamey및 Mears의 4 glass test 이후 전립선염 연구에 획기적인 사실임은 누구도 부인할 수가 없 으며, 향후 이어지는 연구에 중요한 발판이 될 것이 라고 생각한다. 하지만 방법에서의 문제점이 해결 하지 않고 환자에게 적용하는 것은 윤리적 문제를 내포할 수도 있다.
향후 나아가야 할 연구는 과연 한국인에서 만성 전립선염의 cryptic organisms은 과연 무엇이겠는가?
과연 서양의 결과와 일치하는가? 아니면 다른 균주 가 발견되는가?를 아는 것이 급선무이며, 요도의 오 염을 고려하여 real-time PCR 기법 등을 이용하여 정량적인 진단 또한 꼭 필요할 것으로 생각한다.
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