Effects of Cheunggihwadamhwan Extract on Lowering Lipid, Antioxidation and Production of Proinflammatory Cytokines in Rats Fed on High Fat Diet

淸氣化痰丸 추출물이 비만쥐의 지질강하, 항산화효과 및 전염증성 Cytokines 생산에 미치는 영향

이 한⋅박원형⋅차윤엽

상지대학교 한의과대학 한방재활의학교실

Effects of Cheunggihwadamhwan Extract on Lowering Lipid, Antioxidation and Production of Proinflammatory Cytokines in Rats Fed on High Fat Diet

Han Lee, K.M.D., Won-Hyung Park, K.M.D., Yun-Yeop Cha, K.M.D.

Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Sangji University

RECEIVED March 20, 2014 REVISED April 2, 2014 ACCEPTED April 7, 2014

CORRESPONDING TO Yun-Yeop Cha, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Sangji University, 80, Sangjidae-gil, Wonju 220-717, Korea

TEL (033) 741-9260 FAX (033) 732-2124 E-mail [email protected]

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Objectives The purpose of this study was to investigate the effects of Cheunggihwa- damhwan (CGHDH) extract on lowering lipid, antioxidation and production of proin- flammatory cytokines in rats fed on high fat diet.

Methods 40 Male Sprague-Dawley rats were fed on high fat diet for 8 weeks and 32 rats (above 400 g) were randomly divided into 4 groups (8 mice in each group) : control group, 100 mg/Kg CGHDH group, 200 mg/Kg CGHDH group, 300 mg/Kg CGHDH group. We fed a control group of rats a basal diet and administered normal saline(100 mg/kg, 1 time/1 day) for 4 weeks. And We fed each experimental group of rats basal diet and administered an extract of Cheunggihwadamhwan extracts (100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 1 time/

1 day) for 4 weeks. At the end of the experiment, the rats were sacrificed to determine their chemical composition. We measured lipid in plasma and liver, concentration of proin- flammatory cytokines, antioxidative activity and gene expression. The gene expression level was investigated by the way of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).

Results 1. Concentration of plasma FFA, plasma TG, plasma total cholesterol and plas- ma LDL-cholesterol showed a significant decrement in Cheunggihwadamhwan groups.

However, concentration of plasma HDL-cholesterol showed a significant increment in 200, 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan groups. 2. Concentration of liver total cholesterol and liver TG showed a significant decrement in Cheunggihwadamhwan groups. 3. Concentra- tion of plasma TBARS showed a significant decrement in all Cheunggihwadamhwan groups. Concentration of liver TBARS showed a significant decrement in 200, 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan groups. Concentration of liver GSH-Px, SOD and CAT showed a tendency to decrease in all Cheunggihwadamhwan groups. 4. Concentration of plasma IL-1β, plasma IL-6, TNF-α and NO, showed a tendency to decrease in all Cheunggihwa- damhwan groups. Concentration of plasma IL-10 showed a tendency to increase in all Cheunggihwadamhwan groups. 5. In the analysis of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), the gene expression of Apo-B and Apo-E in the Cheunggihwa- damhwan groups showed a low expression than that of control group. The ratio of Apo-B expression per β-actin expression in the showed a significant decrement in all Cheunggih- wadamhwan groups. The ratio of Apo-E expression per β-actin expression in the showed a significant decrement in 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan groups.

Conclusions According to this study, the extract of Cheunggihwadamhwan showed a positive effect of lowering lipid, antioxidation and a control of producing proinflammatory cytokines. (J Korean Med Rehab 2014; 24(2):1-13)

Key words Cheunggihwadamhwan, Lowering lipid, Antioxidation, Inflammatory

Ingredients (%) Basal diet High fat diet

Casein 20.0 20.0

α-Corn starch 35.0 30.0

Sucrose 11.0 10.0

Lard 4.0 25.0

Corn oil 1.0 5.0

Mineral mix¹⁾ 3.5 3.5

Vitamin mix²⁾ 1.0 1.0

Cellulose powder 23.5 5.2

DL-methione 0.3 0.3

1)Mineral mix. (g/kg diet): CaCO3, 29.29; CaHPO4․2H2O, 0.43;

KH2PO4, 34.30; NaCl, 25.06; MgSO4․7H2O, 9.98; Feric citrate hexahydrate, 0.623; CuSO4․5H2O, 0.516; MnSO4․H2O, 0.121;

ZnCl2, 0.02; KI, 0.005; (NH4)6 MO7O24․4H2O, 0.0025.

2)Vitamin mix. (mg/kg diet): Thiamine-HCl, 12; Riboflavin, 40;

Pyridoxin-HCl, 8; Vitamin-B12, 0.005; Ascorbic acid, 300; D-bi- otin, 0.2; Menadione, 52; Folic acid, 2; D-calcium pantothen- ate, 50; P-aminobenzoic acid, 50; Nicotinic acid, 60; Cholin choloride, 2000 (IU/kg diet); Rethinyl acetae, 5000 (IU/kg di- et); Cholecalciferol, 250 (IU/kg diet).

Table I. Composition of Experimental Diets

서론»»»

비만이란 섭취한 에너지가 신체활동과 성장에 필요한 에너지량보다 많아서 초과된 에너지가 체지방조직으로 과잉 축적되어 대사 장애를 유발하는 질환을 의미한다¹⁾. 비만은 고혈압, 당뇨병, 심혈관계 질환, 퇴행성 질환을 야 기한다고 알려져 있으며²⁾, 지방조직이 과잉으로 축적되면 간의 지방산 출납기능에 이상을 일으켜 간 질환이 유발될 수도 있다³⁾. 최근 과잉으로 축적된 체지방조직의 생리학 적 기능에 대한 연구에서는 tumor necrosis factor alpha (TNF-α), plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1), leptin 및 interleukin-6 (IL-6) 등의 다양한 생리활성물질 들이 체지방조직에서도 생산이 되며^4,5), 이러한 생리활성 물질들은 인슐린 저항성, 염증반응에 관여하여 생체를 질 병상태로 유도할 수 있다고 보고했다^6,7). 또한 비만과 관 련된 대사성 질환들은 생체 내에 각종 cytokine들과 염증 성 매개물질들이 비정상적으로 증가하게 되어 만성 염증 상태가 나타난다고 보고되었다⁸⁾. 결과적으로 비만으로 인 해 과잉으로 축적된 체지방조직은 이미 알려진 각종 성인 병의 병인을 제공함은 물론이고, 생체 염증상태를 유도하 여 전신의 생체기능을 저하시켜 생명활동 전체에 영향을 나타내는 주요 요인이 된다. 따라서 비만은 임상현장에서 보다 적극적으로 다루어져야 할 질환이다. 한의학에서는 비만을 肥, 肥人, 肥貴人 등으로 표현하였으며⁹⁾, 기름진 음식의 과다 섭취로 인한 脾胃運化失調 및 이로 인한 濕 痰瘀血과 七情所傷, 肝氣鬱滯 등을 비만의 원인으로 보았 다¹⁰⁾. 이를 근거로 지속적으로 비만에 대해 한의학적 연구 가 진행되고 있으며, 특히 한약 처방 및 본초에 대한 연구 가 다양하게 이루어지고 있다. 현재까지 太陰調胃湯^11,12), 體減薏苡仁湯¹³⁾, 防風通聖散^14,15) 등의 처방에 대해 연구 가 되었으며, 마황¹⁶⁾, 창출¹⁷⁾, 의이인¹⁸⁾ 등 단미제가 비만 에 미치는 효과에 대해서도 연구가 이루어지고 있다. 淸 氣化痰丸은 『東醫寶鑑』에 수록된 처방으로 일체 痰飮 및 食積, 酒積으로 痰이 생겨 몹시 막힌 것을 치료한다고 기록되어 있다¹⁹⁾. 비만에 대한 한의학적 변증 연구를 살 펴보면 痰飮과 食積이 중요한 비만 유발 요인임을 알 수

있으며^20,21), 이에 淸氣化痰丸이 비만 치료에 임상적 유효

성이 있을 것으로 유추할 수 있으나, 현재까지 淸氣化痰 丸에 대한 연구가 이루어지지 않고 있다. 따라서 본 연구 는 비만의 예방과 치료효과를 개선하기 위한 기초연구의

일환으로 비만을 유도한 흰쥐에게 淸氣化痰丸을 투여한 후, 생체 지질구성 및 농도, 항산화 기능 및 염증반응상태 의 지표가 될 수 있는 전염증성 cytokine의 생산을 조사 했다.

재료 및 방법»»»

1. 실험동물, 실험군 및 비만유도

평균체중이 203.27±5.31 g의 Sprague-Dawely계 수컷 40두에게 고지방식이(Table I)를 8주간 급여한 후, 체중 이 400 g 이상인 32두를 선발하여, 평균체중이 유사하게 대조군 (100 mg/kg 생리식염수), 처리 1군 (100 mg/kg 淸氣化痰丸 추출물), 처리 2군 (200 mg/kg 淸氣化痰丸 추출물) 및 처리 3군 (300 mg/kg 淸氣化痰丸 추출물)으 로 나누어 각 처리군당 8두 씩 임의 배치하였다. 본 실험 은 상지대학교 보건과학대학 제약공학과 연구실에서 진 행되었으며, 실험동물윤리에 관한 규정을 준수하였다.

2. 식이급여

시험기간 4주 동안 기본식이(Table I)를 각 처리군 간 섭취량 차이가 5% 이내가 되도록 균등 급여하였다. 물은

Herbal name Crude drugs name Amount (g)

南星 Arisaematis Rhizoma 50

半夏 Pinelliae Rhizoma 50

神麴 Massa Medicata Fermentata 37.5 麥芽 Hordei Fructus Germiniatus 37.5

陳皮 Citri Unshii Pericarpium 25

枳實 Aurantii Immaturus Fructus 25 白朮 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma 25

白茯笭 Hoelen 25

蘇子 Perillae Semen 25

蘿葍子 Raphani Semen 25

瓜蔞仁 Trichosanthes kirilowii 25

香附子 Cyperi Rhizoma 25

山査肉 Crataegi Fructus 25

白荳蔲 Amomi Cardamomi Fructus 25

靑皮 Citri Unshii Pericarpium 12.5

乾葛 Puerariae Radix 12.5

黃連 Coptidis Rhizoma 12.5

黃芩 Scutellariae Radix 20

海粉 Notarchi Leachii Ovum 17.5

Total amount 500

Table II. Composition of Cheunggihwadamhwan and Amount

자유롭게 마실 수 있도록 했다.

3. 淸氣化痰丸 추출물 및 투여

본 실험에 사용한 淸氣化痰丸의 처방은 『東醫寶鑑』에 준하였고, 약재는 상지대학교 부속한방병원 약제과에서 구입했다. 淸氣化痰丸 500 g (건조중량)(Table II)을 냉각 수 환류 하에 5시간, 3회 추출하고 여과, 감압 농축하여, 에탄올 추출물 109 g을 만들었다. 약물투여는 처리군별 정량을 매일 오후 5시경에 zonde needle을 이용하여 경 구 투여하였다.

4. 채혈 및 간장 채취

실험종료일에 12시간 절식을 시킨 후, 심장천자법에 의 해 약 5~6 ml의 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 분석 항목별로 처리하여 보관하였다. 채혈을 마친 후, 간장을 채취하여 각각의 분석항목별 처리방법에 따라 처리한 후, -80^oC에 냉동 보관하였다.

5. 시료분석

1) 혈장 및 간장의 지질농도 및 구성

혈장의 Total cholesterol, Triglyceride (TG), LDL-cho- lesterol 및 HDL-cholesterol 농도는 혈액자동분석기 (Boehringer Manheim, 독일)에 의해 분석하였으며, 혈장 Free Fatty Acid (FFA) 함량은 V-NEFA Kit (일수제약, 일 본)를 이용한 효소법에 의해 측정하였다. 간장의 Total cholesterol 및 TG량은 정량용 Kit (Wako Co., 일본)를 이용하여 분석하였다.

2) 혈장 및 간장의 Thiobarbituric acid reactive sub- stance (TBARS) 농도

혈장의 TBARS량은 혈장을 분리하여, 37^oC에서 120분 간 배양 후 Buege와 Aust²²⁾의 방법에 의해 정량하였다.

간장의 TBARS량은 간장절편 1~2 g을 0.9% 생리식염수 로 세척, 혈액을 제거한 후, 1.15% KCl 수용액과 혼합하 여 10% homogenate를 만들었다. 0.1 ml의 homogenate 를 8.0% sodium dodecyl sulfate 0.2 ml, 20% acetic acid solution (pH 3.5) 1.5 ml, 0.8% TBA solution 1.5 ml를 첨가하고, 총 4 ml가 되도록 증류수를 넣은 다음 95^oC water bath에서 1시간 동안 가열하였다. 가열한 시 험관을 흐르는 수돗물에서 냉각시킨 후, 증류수 1 ml와 n-butanol과 pyridine (15：1, v/v)혼합용액 5 ml를 가하 고 voltex하였다. 1,500×g에서 10분간 원심분리한 후 상 층액 (n-butanol : pyridine층)을 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 TMP (1,1,3,3-tetraamitoxypro- pane)를 사용하였고, lipid peroxide 수준은 nM MDA (malondialdehyde)로 표시하였다.

3) 간장 Glutathione peroxidase (GSH-Px) 활성치 간장의 GSH-Px 활성은 Levander 등²³⁾ 방법에 준해 분 석하였다. 간장절편을 생리식염수로 세척, 혈액을 제거시 킨 후, 0.15 M Kcl 수용액과 함께 homogenizer로 20%

homogenate가 되도록 마쇄하여 9,000×g에서 15분간 원 심 분리하였다. 상층액을 15,000×g에서 1시간 동안 원심 분리한 후, 상층액을 단백질의 함량이 100~200μg이 되 도록 취하여 분석했다. 원심분리시의 온도는 4^oC를 유지 하였으며, 조제한 시료를 stock solution (K buffer, 40

RNA Primer sequences(5'to 3')

Apolipoprotein B: 170 bp 5'-AGA AAG AGA ACA AAG CAG AGA TTG TGG-3' 5'-CAT GCT CCA TTC TCA CAT GTT TA-3'

Apolipoprotein E: 300 bp 5'-GTG GGC AAA CCT AAT GGA GA-3' 5'-GCT GAA GCT GTG TGG AAT CA-3'

Leptin: 458 bp 5'-GTG GCT TTG GTC CTA TCT GTC CTA TG-3' 5'-TCA GGG CTA AGG TCC AAC TGT TGA AG-3' β-Actin: 348 bp 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA-3'

5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3' Table III. The Primers Used in RT-PCR and the Estimated Size of the Amplified Fragments mM glutathione, KH buffer, ml당 1 Unit의 glutathione

reductase)에 넣어 37^oC에서 10분간 항온시킨 후, 20 mM NADPH를 첨가하여 다시 2분 동안 방치시켰다. 그리고 15 mM t-butyl hydroperoxide를 가하여 그 반응을 340 nm에서 1분간 흡광도가 감소하는 속도를 측정하였다.

GSH-Px 활성도의 unit는 mg protein당 1분 동안 NADPH 가 NADH로 산화되는 nM수로 나타내었다.

4) 간장 Superoxide dismutase (SOD) 활성치

Flohe 등²⁴⁾의 방법으로 측정했다. 본 실험에서는 ferri- cytochrome C의 환원이 방해되는 정도를 550 nm에서 30 초 간격으로 3분간 비색정량한 후 ferricytochrome C의 환원을 50% 방해하는 SOD의 양을 1 unit로 하여 분당 활성정도를 나타내었다.

5) 간장 Catalase (CAT) 활성치

간장 0.2 g을 20배의 25 mM KH2PO4-NaOH buffer (pH 7.0)에 넣어 균질화 시키고 homogenate를 같은 buf- fer로 60배 희석한 후 ice bath 상태에서 ultrasonicator (Heat System Ultrasonics. Inc., Ultrasonic Propessor W-385)로 15초씩 2회 반복하고, 시료를 Spectrophtome- ter (550 nm)에서 흡광도를 측정한 후, formaldehyde를 표준용액의 표준곡선으로 활성을 계산하였다²⁵⁾.

6) 혈장 Glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) 및 Glutamic pyruvic transaminase (GPT) 활성치 혈장 GOT 및 GPT 활성치는 혈액자동분석기(Boehrin- ger Manheim, 독일)로 측정했다.

7) 혈장 Cytokines 농도

혈장 Cytokines 정량용 시료는 채혈 직후, 혈장을 분리

하여 -80^oC에 냉동 보관하였다. Cytokines (IL-1β, TNF- α, IL-6 및 IL-10) 정량은 시판 Kit (Biosource Interna- tional, USA)를 이용했다. TNF-α의 최저 측정농도는 0.7 pg/ml이며, 다른 Cytokines들은 3~8 pg/ml이다.

8) 혈장 Nitric oxide (NO) 농도

혈장 NO 농도는 분석용 Kit (DOJINDO, NO Assay Kit, 일본)를 이용하여 측정했다.

9) RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석

TRI reagent (Sigma alderich Co.)로 total RNA를 추출 하였다. cDNA합성은 M-MLV Reverse transcriptase Kit (Promega)를 사용하여 5 mg/ml total RNA로 하였다. 합 성된 cDNA는 각각의 rat Apo-B, Apo-E, leptin 및 β- actin genes의 primer (Table III)를 이용하여 PCR을 수행 하였다. PCR의 reaction mixture는 3 μl 10× Ex-Taq buffer, 2.5 μl dNTP mixture (2.5 mM each), 0.5 μl Ex-Taq polymerase (5 units/μl, TaKaRa), 2 μl for- ward 및 reverse primers (각각 100 pM/μl), 1 μl cDNA template 및 21 μl의 증류수를 혼합한 30 μl이 며, PCR 반응은 94^oC에서 5분, 94^oC에서 30초간 denatu- ration 35 cycles, 57~60^oC에서 30초간 annealing, 72^oC에 서 45초간 extension, 마지막으로 72^oC에서 10분간 ex- tension을 실시했다. PCR products는 1.5% agarose gel (0.1 mg/ml ethidium bromide)을 이용하여 전기영동을 하였으며, size marker로 GeneRuler DNA ladder mix.

(Fermentas, #SM0333)를 사용하였다.

Triglyceride

Treatment FFA (uEql) (mg/dl)

Control 791.87±20.15^c 261.72±18.67^c 100 mg/kg CGHDH ext. 768.53±25.30^c 232.90±22.76^b 200 mg/kg CGHDH ext. 702.63±19.70^b 204.54±12.71^a 300 mg/kg CGHDH ext. 664.71±32.38^a 193.22±13.28^a

a,b,c

: Means in the same column with different superscripts are significantly different (p＜0.05). CGHDH: Cheunggihwadam- hwan.

Table IV. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma FFA and Triglyceride Concentration in Rat Fed High Fat Diet

Treatment Total Cholesterol (mg/dl) HDL-cholesterol (mg/dl) LDL-cholesterol (mg/dl)

Control 170.34±9.15^c 21.26±2.17^a 38.60±4.44^c

100 mg/kg CGHDH ext. 138.16±8.97^b 23.27±1.94^ab 29.40±2.72^b

200 mg/kg CGHDH ext. 126.70±8.89^ab 24.67±2.95^b 24.25±2.08^a

300 mg/kg CGHDH ext. 121.29±9.76^a 26.44±2.16^b 21.44±1.85^a

a,b,c: Means in the same column with different superscripts are significantly different (p＜0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan.

Table V. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma Total Cholesterol, HDL-cholesterol and LDL-cholesterol Concentration in Rat Fed High Fat Diet

Total cholesterol Triglyceride

Treatment (mg/g) (mg/g)

Control 18.78±1.14^c 18.88±1.50^c

100 mg/kg CGHDH ext. 16.21±1.14^b 16.24±1.71^b 200 mg/kg CGHDH ext. 15.06±2.56^ab 14.14±1.06^a 300 mg/kg CGHDH ext. 13.05±1.28^a 12.57±0.48^a

a,b,c

: Means in the same column with different superscripts are significantly different (p＜0.05). CGHDH: Cheunggihwadam- hwan.

Table VI. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Liver Total Cholesterol and Triglyceride Concentration in Rat Fed High Fat Diet

6. 통계처리

실험결과는 SPSS(ver. 18.0) 통계 프로그램을 이용하여 one-way ANOVA검정을 수행하였으며, 각 처리군 간의 유의성 검정은 Duncan's multiple range test에 의해 p

＜0.05 수준에서 실시했다.

결과»»»

1. 혈장 Free fatty acid (FFA) 및 Triglyceride (TG) 농도

혈장 FFA 농도는 대조군과 비교하여 淸氣化痰丸 추출 물 처리군 모두가 낮은 값을 나타내었으며, 200 mg/Kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군과 300 mg/Kg 淸氣化痰丸 추 출물 처리군에서 통계적으로 유의하게 낮았다. TG 농도 는 대조군보다 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 낮은 값 을 보였으며, 淸氣化痰丸 추출물의 급여량이 증가함에 따 라 감소하였다(Table IV).

2. 혈장 Cholesterol 농도

혈장 Total cholesterol 농도와 LDL-cholesterol 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 대조군보다 유의하게 낮았다. 혈장 HDL-cholesterol 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리군이 대조군보다 높은 값을 나타내었으며, 200 mg/

Kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군과 300 mg/Kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군은 대조군보다 유의하게 높았다(Table V).

3. 간장 Total cholesterol 및 Triglyceride (TG) 농도

간장 Total cholesterol 농도 및 TG 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 대조군보다 유의하게 낮았다(Table VI).

4. 혈장 및 간장 Thiobabituric acid reactive substance (TBARS) 농도

혈장 TBARS 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가

Plasma TBARS Liver TBARS Treatment

(nmoles MDA/ml) (nmoles MDA/g)

Control 30.24±1.87^c 21.06±1.28^b

100 mg/kg CGHDH ext. 27.26±2.36^b 20.00±1.05^b 200 mg/kg CGHDH ext. 23.49±1.98^a 14.73±1.80^a 300 mg/kg CGHDH ext. 21.81±2.18^a 13.59±1.80^a

a,b,c

: Means in the same column with different superscripts are significantly different (p＜0.05). CGHDH: Cheunggihwadam- hwan.

Table VII. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma and Liver TBARS Concentration in Rat Fed High Fat Diet

Treatment GSH-Px

(nmoles/min/mg protein)

SOD (unit/mg protein)

CAT

(μmoles(H2O2)/min/mg protein)

Control 122.95±8.36^a 11.14±0.80^a 56.74±3.58^a

100 mg/kg CGHDH ext. 127.61±4.75^a 11.10±1.79^ab 60.75±2.19^a

200 mg/kg CGHDH ext. 140.41±5.63^b 12.72±1.04^ab 66.36±5.01^b

300 mg/kg CGHDH ext. 144.99±6.11^b 13.51±0.53^b 69.18±3.06^b

a,b: Means in the same column with different superscripts are significantly different (p＜0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan.

Table VIII. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Antioxidase Activity in Rat Fed High Fat Diet

GOT GPT

Treatment

(Karmen unit) (Karmen unit) Control 31.41±3.45^NS 27.78±3.06^NS 100 mg/kg CGHDH ext. 32.90±4.63^NS 28.34±2.60^NS 200 mg/kg CGHDH ext. 33.45±4.46^NS 24.23±2.88^NS 300 mg/kg CGHDH ext. 30.51±2.40^NS 24.90±2.14^NS

NS: Not significantly different (p＞0.05). CGHDH: Cheunggih- wadamhwan.

Table IX. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma Glutamic Oxaloacetic Transaminase (GOT) and Plasma Gluta- mic Pyruvic Transaminase (GPT) Activity in Rat Fed High Fat Diet

대조군보다 유의하게 낮았다. 간장 TBARS 농도는 200 mg/Kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군과 300 mg/Kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군이 대조군보다 유의하게 낮았다(Table VII).

5. 간장 Glutathione peroxidase (GSH-Px), Superoxide dismutase (SOD) 및 Catalase (CAT) 활성치

GSH-Px, SOD 및 CAT 활성치는 淸氣化痰丸 추출물 처 리군 모두가 대조군보다 높은 경향을 나타내었다. GSH- Px, CAT 활성치는 200 mg/Kg 淸氣化痰丸 추출물 처리 군과 300 mg/Kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군이 대조군보 다 유의하게 높았으며, SOD 활성치는 300 mg/kg 淸氣化 痰丸 추출물 처리군만이 대조군보다 유의하게 높은 값을 나타내었다(Table VIII).

6. 혈장 Glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) 및 Glutamic pyruvic transaminase (GPT) 활성치

혈장 GOT 및 GPT의 활성치는 전 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다(Table IX).

7. 혈장 Cytokines 농도

혈장 interleukin-1β (IL-1β) 농도는 淸氣化痰丸 추출 물 처리군 모두가 대조군보다 유의하게 낮은 값을 나타내 었다. 혈장 IL-6 및 TNF-α 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처 리군 모두가 대조군보다 낮은 값을 나타내었으며, 200 mg/Kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군과 300 mg/Kg 淸氣化 痰丸 추출물 처리군이 대조군보다 유의하게 낮았다. 혈장 interleukin-10 (IL-10) 농도는 200 mg/Kg 淸氣化痰丸 추 출물 처리군과 300 mg/Kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군이 대조군보다 유의하게 높았다(Table X).

8. 혈장 Nitric oxide (NO) 농도

혈장 NO 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 대 조군보다 유의하게 낮은 값을 나타내었다(Table XI).

9. Apo-B, Apo-E 및 Leptin gene expression

Apo-B 및 Apo-E는 정상군과 비교하여 비만군이 높은

Treatment IL-1β(pg/ml) IL-6 (pg/ml) TNF-α(pg/ml) IL-10 (pg/ml)

Control 31.48±1.38^c 41.36±3.57^b 35.96±4.76^b 11.67±1.24^a

100 mg/kg CGHDH ext. 27.00±2.96^b 37.80±2.50^b 33.34±3.24^b 12.66±1.31^ab 200 mg/kg CGHDH ext. 23.63±2.05^a 29.91±1.37^a 26.52±2.23^a 14.08±0.69^b 300 mg/kg CGHDH ext. 23.14±2.73^a 26.07±5.50^a 24.52±2.28^a 15.68±1.35^c

a,b,c: Means in the same column with different superscripts are significantly different (p＜0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan.

Table X. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on Plasma Cytokines Concentration in Rat Fed High Fat Diet

Nor Con 100 200 300

Fig. 2. The ratio of Apo-B/β actin in RT-PCR gene expres- sion.

a,b,c,d

: Means with different superscripts are significantly differ- ent (p＜0.05).

Nor: Normal group, Con: Control group, 100: 100 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 200: 200 mg/kg Cheunggihwa- damhwan ext., 300: 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext.

Nor Con 100 200 300

Fig. 3. The ratio of Apo-E/β actin in RT-PCR gene expres- sion.

a,b,c

: Means with different superscripts are significantly different (p＜0.05).

Nor: Normal group, Con: Control group, 100: 100 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 200: 200 mg/kg Cheunggihwa- damhwan ext., 300: 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext.

Treatment NO

Control 31.53±3.20^c

100 mg/kg CGHDH ext. 27.90±2.93^b 200 mg/kg CGHDH ext. 24.03±2.45^a 300 mg/kg CGHDH ext. 22.69±1.65^a

a,b,c

: Means in the values with different superscripts are sig- nificantly different (p＜0.05). CGHDH: Cheunggihwadamhwan.

Table XI. Effects of Cheunggihwadamhwan Ext. on NO Con- centration in Rat Fed High Fat Diet

Fig. 1. RT-PCR analysis for Apo-B, Apo-E and Leptin gene ex- pression.

Nor: Normal group, Con: Control group, 100: 100 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 200: 200 mg/kg Cheunggihwa- damhwan ext., 300: 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext.

gene expression을 나타내었으나, 비만군에서는 대조군 과 비교하여 淸氣化痰丸 추출물 처리농도가 증가함에 따 라 낮은 gene expression을 나타내었다. Leptin gene ex- pression은 정상군보다 비만군 모두가 높은 gene ex- pression을 나타내었으며, 비만군 간에서는 淸氣化痰丸 추출물 처리농도에 따른 확연한 차이를 볼 수 없었다 (Fig. 1). β-actin expression에 대한 Apo-B의 gene ex- pression 비율은 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 대조 군보다 유의하게 낮은 값을 나타내었다(Fig. 2). β-actin expression에 대한 Apo-E의 gene expression 비율은 300 mg/kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군이 대조군보다 유의하

Nor Con 100 200 300 Fig. 4. The ratio of Leptin/β actin in RT-PCR gene expres- sion.

a,b,c

: Means with different superscripts are significantly different (p＜0.05).

Nor: Normal group, Con: Control group, 100: 100 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext., 200: 200 mg/kg Cheunggihwa- damhwan ext., 300: 300 mg/kg Cheunggihwadamhwan ext.

게 낮은 값을 나타내었다(Fig. 3). β-actin expression에 대한 Leptin의 gene expression 비율은 대조군을 비롯한 전 처리군 모두가 일관성 있는 결과를 나타내지 않았다 (Fig. 4).

고찰»»»

최근 체지방조직의 기능에 대한 연구에서 지방조직들 이 생체에너지 축적 기능과 더불어 생체 내분비대사에도 직접적으로 관여하고 있으며, 그로 인해 체지방조직이 기 존의 연구대상이었던 비만관련 질환들의 범주를 초월하 는 다양한 질환들과도 관련이 있음을 시사해 주었다^26-28). 따라서 비만과 질환의 상관관계를 에너지대사는 물론이 고 생체기능 전반과 관련지어 보다 더 광범위하게 고려하 여할 필요성이 인지되었다. 비만에 대해 한의학에서는

『黃帝內經ㆍ素問』「通評虛實論」에서 "肥貴人則膏粱之 疾也"⁹⁾, 『黃帝內經ㆍ靈樞』의 「逆順肥瘦 第三十八」에

"年質壯大 血氣充盈 膚革堅固 因加以邪 刺此者 深而留之 此肥人也", 「衛氣失常 第五十九」에는 "人有肥 有膏 有 肉"²⁹⁾라 하여 비만에 대해 최초 언급이 있었다. 『張氏類 經』에서는 "肥貴之人 每多厚味 夫肥者 令人熱中 甘者令 人中滿 熱蓄于內 多傷其陰 故爲此諸病"이라고 하여 비만

이 기름진 음식을 먹게 되어서 생긴다고 보았으며³⁰⁾, 『脾 胃論』에서 "脾胃俱實 則能食而肥"라고 하였고³¹⁾, 『石室 秘錄』에서는 "肥人多痰 乃氣虛也 虛則氣不能運行 故痰生 之"³²⁾라고 하여 『黃帝內經』이후로도 지속적으로 비만을 질병으로 인식하고 있음을 알 수 있다. 비만의 원인을 한 의학에서는 내적 요인으로는 氣虛, 陽虛, 濕, 痰, 熱, 水, 瘀血, 內傷七情이 있으며, 외적요인으로는 活動減少, 外感 濕邪, 營養過剩, 先天稟賦가 있다고 보았으며³³⁾, 최근 연 구에서는 脾虛型, 痰飮型, 陽虛型, 食積型, 肝鬱型, 瘀血型 으로 크게 구분하고 있다^20,21). 비만에 대한 최근 한의학 연구를 살펴보면 임상연구와 실험연구가 75% 이상을 차 지하였고, 실험연구는 모두 비만이 유발된 실험용 쥐를 이용하여 처방^11-15), 단미제^16-18), 한약추출물³⁴⁾, 약침³⁵⁾, 전 침³⁶⁾ 등의 치료가 쥐의 비만에 미치는 효과를 분석한 것 들이었다³⁷⁾. 실험연구 중 한약물 연구를 살펴보면 오 등³⁴⁾ 은 調胃升淸湯 추출액이 비만을 유도한 쥐의 지질강하, 항산화 및 염증반응 조절에 유의하게 작용한다고 보고하 였으며, 이 등³⁸⁾은 상엽이 혈청 중성지방, 간 조직의 지방 축적 억제 작용이 있다고 보고 하였다. 이 외에도 防風通 聖散^14,15), 輕身解脂丸³⁹⁾ 등의 처방과 마황¹⁶⁾, 홍삼⁴⁰⁾ 등의 단미제가 연구 되었으나 淸氣化痰丸에 관한 연구는 시행 되지 않았다. 淸氣化痰丸은 『東醫寶鑑』에 모든 痰飮 및 食積, 酒積으로 인하여 발생한 질환을 치료한다¹⁹⁾고 언급 된 처방으로 남성, 반하, 신국, 맥아, 진피, 지실, 백출, 백 복령, 소자, 나복자, 과루인, 향부자, 산사육, 백두구, 청 피, 건갈, 황련, 황금, 해분으로 구성되어 있다. 그 중에서 가장 많은 비중을 차지하고 있는 천남성과 반하의 최근 연구를 살펴보면, 천남성은 비만쥐의 당지질 대사에 영향 을 주고 혈액 내 지질의 감소에 효과적이라고 보고되었으 며⁴¹⁾, 반하 역시 비만쥐의 체중과 중성지방을 효과적으로 감소시키고 골격근 내 지방산화에 영향을 미친다고 보고되 었다⁴²⁾. 맥아⁴³⁾, 진피⁴⁴⁾, 지실⁴⁵⁾, 백복령⁴⁶⁾, 산사육⁴⁷⁾, 청피⁴⁸⁾, 갈근⁴⁹⁾ 역시 비만 억제에 유효한 효과가 있다고 보고되었 으며, 이를 토대로 淸氣化痰丸은 임상에서 비만질환의 치 료에 긍정적인 효과가 있을 것으로 사료된다. 문헌상으로 도 淸氣化痰丸은 일체의 痰飮 및 食積, 酒積으로 인하여 발생한 질환을 치료한다고 하였으며, 痰飮과 食積이 비만 의 한의학적 주요 원인임을 고려할 때 淸氣化痰丸의 비만 치료 효과를 충분히 기대해 볼 수 있다. 또한 백출⁵⁰⁾, 과 루인⁵¹⁾, 향부자⁵²⁾, 갈근⁵³⁾, 황련⁵⁴⁾, 황금⁵⁵⁾은 염증 유발인

자에 영향을 미쳐 항염증 효과가 있다는 연구를 근거로 淸氣化痰丸에 항염증 작용도 수반될 것이라 생각해 볼 수 있다. 이와 같이 淸氣化痰丸이 임상적으로 다양한 방면에 서 활용가능한 처방임에도 불구하고 문헌에 淸氣化痰丸 의 효능과 작용기전에 대한 보다 자세한 설명이 없었고, 이에 최근까지도 淸氣化痰丸에 대한 연구가 적극적으로 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구는 비만상태에서 淸氣 化痰丸이 생체 내 지질합성, 항산화능 및 염증반응에 미 치는 영향을 알아보기 위하여 비만을 유도한 흰쥐에게 淸 氣化痰丸을 투여한 후, 생체 지질구성 및 농도, 항산화 기 능 및 염증반응상태의 지표가 될 수 있는 전염증성 cyto- kine의 농도를 조사했다.

FFA, TG, Total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도는 조직 내 지질축적의 정도와 관련이 있는데⁵⁶⁾, 본 연구에 서 혈장 FFA, TG, Total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도는 대조군과 비교하여 淸氣化痰丸 추출물 투여군들 이 하락하는 경향을 보였다. 또한 간장 TG 및 Total cho- lesterol 농도 모두가 대조군보다 淸氣化痰丸 추출물 투여 군들이 낮은 값을 나타내었다. 이러한 결과는 淸氣化痰丸 이 체내 지질의 합성과 분해에 영향을 주고, 비만의 개선 에 긍정적으로 작용하여 당뇨병 및 순환계 질환 등의 성 인병의 발병가능성을 저하시킬 수 있음을 시사한다.

HDL-cholesterol은 체내를 순환하며 세포내 cholesterol을 회수하여 간으로 이동시키는 역할을 하는데⁵⁷⁾, 혈장 HDL- cholesterol 농도는 대조군보다 淸氣化痰丸 추출물 투여군 들이 높은 수치를 나타내었다. 이러한 결과 또한 HDL- cholesterol이 혈액 내 잔여 cholesterol들을 간장으로 재 순환시켜 혈액 내 지질환경을 개선시킨다는 본래의 기능 을 고려해보면 淸氣化痰丸은 비만체질에서 지질 강하에 긍정적으로 작용하여 성인병 예방 및 치료에 효과를 나타 낼 것으로 사료된다. 생체 내 Thiobabituric acid reactive substance (TBARS)농도의 증가는 지질과산화물질의 축적 이 증가하였음을 나타낸다. 생체 내의 지질과산화물질의 대부분은 지질대사 과정에서 생성되며, 세포막파괴에 직 접적으로 관여하여 생체조직의 손상을 일으켜 각종 염증 성질환, 암 및 노화를 촉진한다^58,59). 본 연구에서 혈장 TBARS 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 대조군 보다 유의하게 낮았다. 간장 TBARS 농도는 200 mg/kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군 및 300 mg/kg 淸氣化痰丸 추 출물 처리군이 대조군보다 유의하게 낮았다. 이러한 결과

는 淸氣化痰丸 추출물이 생체 내 지질과산화물질의 축적 을 억제하여 산화장애로 인한 각종 질환의 예방과 치료에 긍정적으로 작용할 가능성을 보여준다. GSH-Px, SOD 및 CAT 활성치는 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 대조군 보다 높은 경향을 나타내었다. GSH-Px, SOD 및 CAT 는 생체 내에서 항산화계 효소들로 분류되며, 이러한 효소들 의 활성이 증가한 경우 생체 내에 증가된 산화물질들의 제거가 활발하게 진행되었음을 의미한다⁶⁰⁾. 본 연구에서 혈장 및 간장의 TBARS 농도의 하락에 부합하여 GSH-Px, SOD 및 CAT 활성치가 증가하였다. 혈장 내 GOT 및 GPT의 활성치는 전 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. GOT 및 GPT의 활성치는 간장의 장애의 유무를 나타내는데, 본 연구의 결과에서 전 처리군 모두가 정상 치의 범위를 나타내어 본 연구에서 처리한 淸氣化痰丸 추 출물의 농도는 간장기능에 이상을 초래하지 않았음을 시사 한다. Cytokine이란 여러 세포에서 생산되는 생리활성 물 질들의 일종이며, 염증에 대한 자기 방어, 세포의 성장, 분 화와 사멸, 혈관형성, 항상성 회복에 관여하는데⁶¹⁾, IL-1β 는 T-cell, B-cell, NK cell의 활동성에 관여하고²⁹⁾, IL-6는 면역기능 및 대사기능의 조절자로 작용하며, 간 및 지방조 직에 작용하여 glucose와 지질대사를 조절한다⁶²⁾. TNF-α 는 지방세포에서 합성되며, 당대사와 지질대사에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다⁶³⁾. IL-1β, IL-6 및 TNF-α는 전염증성 cytokine으로 분류되는데⁶⁴⁾, 본 연구에서 혈장 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리 군 모두가 대조군보다 낮은 경향을 나타내었다. 반면에 이들 전염증성 cytokine들의 생산을 저해하는 혈장 IL-10 농도⁶⁵⁾는 淸氣化痰丸 추출물 처리량이 증가함에 따라 증 가했다. 전염증성 cytokine들은 전염증성물질들을 생산하 여 염증상태를 유도한다. 따라서 생체 내에 전염증성 cy- tokine들의 증가현상은 염증반응이 활발하게 진행되고 있 음을 말해준다^64,65). 본 연구에서는 淸氣化痰丸 추출물 처 리군들에서 전염증성 cytokine농도가 하락하여 염증반응 이 완화되었음을 시사해주며, 이러한 결과는 淸氣化痰丸 추출물 처리군들에서 IL-10의 농도가 증가한 결과와 높은 상관성이 있을 것으로 생각된다. 또한 염증매개물질인 혈 장 NO 농도^66,67)도 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 대 조군보다 낮은 값을 나타내어, 전염증성 cytokine의 농도 경향과 잘 부합되었다. Apolipoprotein (Apo)은 지단백을 구성하는 단백 성분인데, Apo-B는 LDL-cholesterol의 단

백질성분으로 cholesterol의 수송과 세포내 유리 등의 역 할을 하며⁶⁸⁾, Apo-E는 지질대사와 심혈관계질환과 관련 있다고 알려져 있으며, 관상동맥질환의 발생과 관련있다 고 보고된다⁶⁹⁾. Apo-B 및 Apo-E는 정상군과 비교하여 비 만군이 높은 gene expression을 나타내었으나, 비만군 간 에서는 淸氣化痰丸 추출물 처리농도가 증가함에 따라 낮 은 gene expression을 나타내었다. Leptin은 지방조직에 서 분비되며⁷⁰⁾ Leptin gene expression은 정상군보다 비 만군들 모두가 높은 gene expression을 나타내었으며, 비 만군 간에서는 淸氣化痰丸 추출물 처리농도에 따른 확연 한 차이를 볼 수 없었다. β-actin expression에 대한 Apo-B의 gene expression 비율은 淸氣化痰丸 추출물 처 리군 모두가 대조군보다 유의하게 낮은 값을 나타내었다.

β-actin expression에 대한 Apo-E의 gene expression 비 율은 300 mg/kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군이 대조군보 다 유의하게 낮은 값을 나타내었고, β-actin expression 에 대한 Leptin의 gene expression 비율은 대조군을 비롯 한 전 처리군 모두가 일관성 있는 결과를 나타내지 않았 다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 淸氣化痰丸 추출물은 생체 내 지질의 합성과 분해에 긍정적으로 작용하여 지질 의 축적을 억제하고, 항산화 효과를 가지며, 생체 내 염증 반응의 정도를 완화시키는데 긍정적인 효과를 나타내어 각종 질환의 예방과 치료에 이용할 수 있을 것으로 생각 된다.

결론»»»

본 연구는 비만의 예방, 치료 및 비만과 관련되어 나타 나는 생체기능의 이상 현상을 효과적으로 개선하기 위한 기초연구의 일환으로 비만을 유도한 흰쥐에게 淸氣化痰 丸을 투여한 후, 생체 지질합성, 항산화 기능 및 전염증성 cytokine의 생산을 조사했다.

1. 혈장 FFA 농도는 대조군과 비교하여 淸氣化痰丸 추 출물 처리군 모두가 낮은 값을 나타내었다. 혈장 TG 농 도는 대조군보다 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 낮은 값을 보였으며, 淸氣化痰丸 추출물의 급여량이 증가함에 따라 감소하였다. 혈장 Total cholesterol 농도와 LDL- cholesterol 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 대 조군보다 유의하게 낮았다. HDL-cholesterol 농도는 淸氣

化痰丸 추출물 처리군이 대조군보다 높은 경향을 나타내 었다.

2. 간장 Total cholesterol 농도 및 TG 농도는 淸氣化 痰丸 추출물 처리군 모두가 대조군보다 유의하게 낮았다.

3. 혈장 및 간장 TBARS 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처 리군 모두가 대조군보다 낮은 경향을 나타내었다. GSH- Px, SOD 및 CAT 활성치는 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모 두가 대조군보다 높은 경향을 나타내었다.

4. 혈장 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도는 淸氣化痰丸 추 출물 처리군 모두가 대조군보다 낮은 경향을 나타내었다.

혈장 IL-10 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리군에서 높은 경향을 나타내었다. 혈장 NO 농도는 淸氣化痰丸 추출물 처리군 모두가 대조군보다 낮은 값을 나타내었다.

5. Apo-B 및 Apo-E는 정상군과 비교하여 비만군이 높 은 gene expression을 나타내었으나, 비만군 간에서는 대 조군과 비교하여 淸氣化痰丸 추출물 처리농도가 증가함 에 따라 낮은 gene expression을 나타내었다. Leptin gene expression은 정상군보다 비만군들 모두가 높은 gene expression을 나타내었다. β-actin expression에 대한 Apo-B의 gene expression 비율은 淸氣化痰丸 추출 물 처리군 모두가 대조군보다 유의하게 낮은 값을 나타내 었다. β-actin expression에 대한 Apo-E의 gene ex- pression 비율은 300 mg/kg 淸氣化痰丸 추출물 처리군이 대조군보다 유의하게 낮은 값을 나타내었다.

이상의 결과를 종합해보면 淸氣化痰丸 추출물이 생체 지질합성, 항산화 기능 및 전염증성 cytokine의 생산에 있어서 생체기능에 긍정적으로 작용하여 비만억제, 치료 및 비만과 관련된 생체 대사이상의 예방과 치료에 효과적 일 것으로 사료되며, 추후 임상현장에서 보다 체계적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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