Fabrication of Collagen Type I Microfiber based on Co-axial Flow-induced Microfluidic Chip

학 술 논 문

186

동심축류가 유도되는 미세유체 소자 기반 Collagen Type I 미세섬유의 제작

이수경·이광호

강원대학교 공과대학 신소재공학과

Fabrication of Collagen Type I Microfiber based on Co-axial Flow-induced Microfluidic Chip

Su Kyoung Lee and Kwang-Ho Lee

Department of Advanced Materials Science and Engineering, College of Engineering, Kangwon National University, 1 Kangwondaehak-gil, Chuncheon 24341, Republic of Korea

(Manuscript received 30 September 2016; revised 12 November 2016; accepted 13 November 2016)

Abstract: In this study, a co-axial flow induced microfluidic chip to fabricate pure collagen type I microfiber via the control of collagen type I and Na-alginate gelation process. The pure collagen type I microfiber was generated by selective degradation of Ca-alginate from ‘Core-Shell’ structured hydrogel microfiber. To make ‘Core-Shell’ structure, collagen type I solution was introduced into core channel and 1.5% Na-alginate solution was injected into side channel in microfluidic chip. To evaluatethe ‘Core-Shell’ structure, the red and green fluorescence substances were mixed into collagen type I and Na-alginate solution, respectively. The fluorescence substances were uniformly loaded into each fiber, and the different fluorescence images were dependent on their location. By immoblizing EpH4-Ras and C6 cells within collagen type I and Na-alginate solution, we sucessfully demonstrated the co-culture of EpH4-Ras and C6 cells with ‘Core-Shell’ like hydrogel microfiber for 5 days. Only to produce pure collagen type I hydrogel fiber, tri-sodium citrate solution was used to dissolve the shell-like Ca-alginate hydrogel fiber from ‘Core-Shell’ structured hydrogel microfiber, which is an excellent advantage when the fiber is employed in three-dimensional scaffold. This novel method could apply variousapplication in tissue engineering and biomedical engineering.

Key words: microfluidic chip, collagen type I, alginate, hydrogel, co-axial flow

I. 서 론

최근 조직공학(Tissue Engineering) 분야에서는 체내의 세포 및 조직에 적합한 3차원 구조의 지지체(Scaffold)를 인 공적으로 제작하여 사전 배양된 세포를 제작된 지지체에 이

식 및 배양 후 다시 체내에 이식하거나 또는 지지체만을 체 내에 이식하여 주변 세포 이동 유도를 통해 손상된 조직을 수복 또는 재생시키자 하는 많은 연구가 시도되고 있다[1,2].

3 차원 세포 지지체의 기본 요건으로는 높은 기공도, 우수한 세포 점착성, 세포와 상호작용 할 수 있는 생리화학 물질의 고정 등의 물성이 필수적이다. 또한 세포와 세포 또는 세포 와 지지체 간의 적합한 3차원의 미세환경을 제공해주어 효 율적인 세포의 성장 및 증식을 유도하고 이를 통해 조직의 수복, 보완 및 대체를 목적으로 하고 있다[3-5]. 이러한 연 구 중에서 세포 외 기질(Extracellular matrix, ECM)과 형 태학적으로 유사한 나노섬유를 활용한 세포 지지체가 우수 한 연구 결과들을 보여주고 있다. 하지만 지지체용 나노섬유 제작시 고분자 용액을 전기적으로 하전 시킨 후 방사해야 Corresponding Author : Kwang-Ho Lee

Department of Advanced Materials Science and Engineering, College of Engineering, Kangwon National University, 1 Kangwondaehak-gil, Chuncheon 24341, Republic of Korea TEL: +82-33-250-6269 / FAX: +82-33-259-5545

E-mail: [email protected]

이 연구는 보건복지부 의료기기기술개발 사업(과제번호-HI14C0522)

과 2014 년도 강원대학교 학술연구조성과제(과제번호-C1011619-

01-01) 의 지원을 받아 수행하였음.

187 고 있다[8,9]. 또한 세포 친화적인 수화젤(Hydrogel)을 활

용한 3차원인 구조체를 마이크로 시스템 및 광 기술과 접목 하여, 3차원인 구조체에 세포를 고정화 하거나 다량의 세포들 을 패터닝하는 효율적인 기법들이 많이 제시되고 있다[10,11].

수화젤 기반의 세포 친화적인 3차원 지지체를 활용한 많은 연구 기법이 제안 되고 있으며[12,13], 수화젤은 친수성을 기반으로 우수한 세포점착성과 더불어 외부 자극에 의한 젤 형성 시 구축되는 망상 구조 내에 주변 세포 및 조직에 제 공할 수 있는 다량의 수분, 산소, 약물 및 영양분 등을 함 유 및 전달할 수 있는 기능성이 가장 우수한 장점으로 알려 져 있다. 또한 선택적으로 생분해성을 제어할 수 있고, 주변 세포들에게 물리적으로 우수한 미세환경도 함께 제공 할 수 있다고 알려져 있다[14,15]. 이러한 수화 젤 중에서는 폴리 에틸렌글라이콜(Polyethyleneglycol), 콜라젠(Collagen), 젤 라틴(Gelatin), 알긴산(Alginic acid), 아가(Agar), 키토산 (Chitosan), 히알루론산(Hyaluronic acid) 등이 미세유체 공정과 함께 대표적으로 사용되고 있는 재료이며[16], 수화 젤 기반의 3차원적인 지지체를 이용한 패터닝(patterning) 등의 연구에서는 세포의 증식과 거동 및 주변 자극에 의한 반응 등의 관찰, 줄기세포(stem cell) 성장, 분화, 제어 등 의 연구에 혁신적인 연구기법을 제공하고 있다[17]. 하지만 상기와 같은 연구 결과에도 불구하고, 대부분 체내와 같은 완전한 3차원적인 환경을 제공해 주지 못하고 있어 수화젤 을 활용한 다양한 세포 및 물질의 탑재 및 3차원 배양 환 경을 제공해 줄 수 있는 미세섬유 기반의 3차원적인 연구 기법이 좋은 대안으로 제시될 수 있을 것이다. 미세유체 소 자를 이용한 미세섬유 제작을 위해서는 선택된 재료의 점도 및 유량 등의 제어를 통해서 주입 후, 미세유체 소자 내에 서의 합성 조건을 수립해야 하며 합성된 미세섬유는 안정적 인 기계적 강도의 확보를 비롯해 우수한 세포 적합성이 필 수적이라 할 수 있을 것이다.

다양한 수화젤들 중에서 생체적합성 및 세포친화성이 우수 한 재료 중에 하나인 Collagen type I은 미세 섬유의 제작

형광입자의 고정을 통하여 제작된 미세섬유의 ‘Core-shell’

구조 형태를 관찰하였다. 또한 주입되는 두 종류의 수화젤 에 쥐 상피세포인 EpH4-Ras 세포와 신경교종세포인 C6 세 포를 각각 고정 및 배양하여 세포 적합성을 검증하였으며, Alginate 수화젤의 선택적인 분해를 통해서 순수한 Collagen type I 의 미세섬유를 얻은 후, 표면에 EpH4-Ras 세포를 3 차원적으로 5일동안 성공적으로 배양하였다. 본 연구를 통 해, 다양한 수화젤 중에서 세포에게 세포 외 기질과 체내와 가장 유사한 같은 미세환경을 제공 할 수 있는 Collagen Type I 수화젤을 3차원 구조체 형상을 유지하면서 수화젤 의 특유의 물성을 그대로 확보할 수 있는 기법을 개발하여 Collagen Type I 수화젤의 조직공학 분야로의 다용한 활 용 가능성을 제시하였다.

II. 연구 방법

1. 동심축류가 유도되는 미세유체 소자의 제작

본 연구에서 동심축류가 유도되는 미세유체 소자는 선행

연구 결과를 참고로 하여 제작 되었다(그림 1(a))[13]. 가교

조건이 다른 두 종류의 수화젤(Collagen type I와 Alginate)

을 이용하여 3차원적인 순수한 Collagen Type I 수화젤 미

세섬유를 제작하고자 동심축류가 유도되는 미세유체 소자를

그림 1(e)와 같이 제작하였다. 동심축류의 중심채널을 만들

기 위해 아크릴 가공을 이용하여 각 5 mm의 크기를 갖는

아크릴 정육면체를 투명 플라스틱 사각 접시 하단 부에 접

합 후, 접합된 정육면체 상부에 테프론 봉(직경: 1 mm, 길이

: 70 mm) 을 고정하여 관 형태가 제작 될 수 있게 하였다. 광

학적으로 투명한 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane

(PDMS), SYLGARD 184, CORNING, USA) 을 경화제와

각각 10:1의 비율로 혼합 및 기포 제거 후 준비된 사각 접

시 위에 고정된 테프론 봉이 잠길 수 있게 주입하여 80

C 의

실험용 오븐(BF-50C, BioFree, Korea)에서 2 시간 동안

열 경화 처리를 하였다. 경화 후, 사각 접시에서 고형화된

188

폴리디메틸실록산을 분리하고 고정되었던 아크릴 봉은 가공 된 칼을 이용하여 한 쪽 끝부분을 PDMS 몰드와 함께 절단 후, 아크릴 봉만을 핀셋으로 제거하여 중심채널이 확보된 소 자(폭: 20 mm, 길이: 30 mm, 직경: 1 mm)를 제작하였다.

중앙채널과 연결되는 측면채널을 형성시키기 위하여 중앙채 널을 기준으로 약 45

의 각도로 중심채널까지 직경 1 mm 의 주사바늘을 밀어 넣어 측면채널에서 유입되는 유체와 중 앙채널에서 유입되는 유체가 만날 수 있도록 제작하였다(그 림 1(a)). 그림 1(b, c)와 같이 각각의 채널의 유입되는 유 체가 중심부에서 동심축류를 형성 할 수 있도록 Puller (P- 97, Sutter Instrument, USA) 와 Microforge (MF-900, Narishige Scientific Instruments Lab, Japan) 장비를 이용하여 가공된 말단 직경이 0.09 mm인 유리관을 전면 부 에서 중심부 부분까지 삽입하였으며, 후면 부에서는 소자 중

심부까지 직경 0.8 mm의 유리관을 삽입하여 소자 중심부 에서 각 측면에서 유입되는 유체가 만날 수 있도록 고정하 였다.

2. 이중구조를 지니는 Collagen type I-Alginate 미세섬유 제작 제작된 동심축류 미세소자의 중앙 채널과 측면 채널에는 표 1과 같이 Collagen type I (354236, Merck Millipore, Germany) 과 Na-alginate (A2033, Sigma-aldrich, USA) 를 가교 전 수화젤 형태의 조성으로 준비하여 중앙 채널에 는 Collagen type I 수화젤 용액을 실린지 펌프(LEGATO 100, Kd Scientific, Korea) 를 이용하여 20 µL/min의 속 도로, 측면 채널에는 Na-alginate 용액을 500 µL/min의 속 도로 각각 주입하였다. 이 때 Collagen type I 수화젤 용 액은 얼음 팩을 이용하여 상온에서의 가교를 방지한 상태로

Fig. 1. (A) Fabrication process of co-axial flow microfluidic platform (B-D) Schematic image of co-axial flow microfluidic platform and process for ‘Core-shell’ structured hydrogel microfiber fabrication, and (E) Optical image of microfluidic device.

189 와 같이 수직상태로 100 mM의 농도로 맞추어진 37 C 의 염

화칼슘(CaCl

, 10830-0301, JUNSEI, Japan) 용액에 잠 기게 하였다. 소자에서 형성된 미세섬유는 Collagen Type I 의 가교를 위해 30분 동안 37

C 의 항온기에서 보관하였으 며, 제작된 섬유를 수월하게 관찰하기 위해 염화칼슘 용액 을 제거한 뒤, 제작된 미세섬유가 배양접시 바닥 면에 닿지 않도록 사전 제작된 창문형태의 PDMS 구조체(가로: 10 mm, 세로: 15 mm, 두께: 3 mm)를 배양 접시에 고정하여 미세섬유가 3차원적 형상을 지속적으로 유지 할 수 있도록 한 상태에서 광학현미경(AX-10, Carl Zeiss, Germany)으 로 그 형태를 관찰하였다[13]. 또한 미세섬유 제작 시에 2 mL 의 Collagen type I 수화젤 용액과 Alginate 용액에 각 각 40 µL의 Rhodamine B (83689, Sigma-Aldrich, USA) 와 FITC-BSA (FD10S, Sigma-Aldrich, USA) 형광물질을 첨가하여 형성된 미세섬유의 구조를 형광현미경(AX-10, Carl Zeiss, Germany) 으로 분석하였다.

3. 선택적인 Alginate 분해를 통한 Collagen type I 미세섬유 의 제작

동심축류 미세소자에서 형성된 ‘Core-Shell’ 이중구조의 Collagen type I-Alginate 미세섬유로부터 순수한 Collagen type I 미세섬유만을 얻고자 Ca

에 의해 빠르게 경화된 Ca-Alginate 만을 선택적으로 제거하기 위해 구연산소다 (Tri-sodium citrate (TSC), S0504, Samchun Chemical, Korea)를 5%, 10%, 20%의 농도로 제작된 이중구조의 미 세섬유 위에 파이펫으로 도포 후, 분해 결과를 비교하였다.

분해되는 형상을 추적하기 위해 미세섬유 제작 시 직경 10 µm 크기를 지니는 적색 형광 입자(Sicastar®-redF, Rostock, Germany) 를 Collagen type I 수화젤과 혼합하여 주입하 였으며, Na-alginate 용액에는 직경 5 µm 크기의 녹색 형 광 입자(Sicastar®-greenF, Rostock, Germany)를 각각 미세섬유 제작 전 5분간 교반하여 주입된 형광입자가 수화 젤 용액 내에서 효과적으로 분산되게 하였다. 미세섬유 제

앙 축의 Collagen type I 성분이 포함되지 않은 순수한 Ca- Alginate 미세섬유를 대조군으로 제조하였으며, 방사된 미 세섬유의 Ca-Alginate 부분은 구연산소다 용액으로 제거 후 3 차 증류수로 10차례 세척하여 Collagen type I 미세섬유 만이 남도록 하였다. Alginate가 제거된 Collagen type I 미세섬유는 동결건조를 위해 15 mL 원뿔형 관에 2 mL의 3 차 증류수와 함께 투여 하여 냉동시킨 후, 2일동안 동결건 조(FDB-5503, OPERON, Korea)를 수행하였다. 동결 건조 된 미세섬유는 적외선 분광기(Attenuated total reflection (ATR), Frontier FT-IR, PerkinElmer, UK) 장비를 사용 하여 표면 분석된 적외선 스펙트럼을 얻었다.

5. 미세 섬유를 이용한 3차원 세포 배양

제작된Collagen Type I-Alginate 미세섬유의 세포 적합

성 시험을 위해 쥐 상피 세포(EpH4-Ras cell)와 신경교종

세포(C6 glioma cell)를 이용하여 3차원적인 세포 배양을

시행하였다. 미세섬유 제작 시에 Collagen Type I 용액에

EpH4-Ras 세포를 2 × 10

cells/mL 의 농도로 Collagen

Type I 용액 1 mL에 40 µL를 혼합하였으며, 같은 농도의

C6 세포를 Na-Alginate 용액에 혼합하여 세포 고정과 함께

미세섬유를 제작하였다. 3차원적인 미세섬유의 형상을 유지

하기 위해 앞서 언급된 창문 형태의 PDMS 틀을 이용하였

으며, 세포의 배양을 위해 Dulbecco’s Modified Eagle’s

Medium (DMEM, LM001-05, WELGENE, Korea), Fetal

Bovine Serum (FBS, 26140-079, GIBCO, Korea), Peni-

cillin-streptomycin (LS202-02, WELGENE, Korea) 을

90:10:1 의 비율로 혼합한 세포 배양액을 사용하여 3차원적

인 환경에서 공동배양 하였다. 또한, 대조군으로 세포의 혼

합 없이 제작된 미세섬유 구조체에서 Alginate 만을 제거

후, EpH4-Ras cell를 순수한 Collagen Type I 미세섬유 위

에서 세포를 배양하여 관찰했다. 각각의 실험군과 대조군은

37

C/5% CO

환경의 세포 배양기(MCO-18AC, SANYO,

Japan) 내에서 5일동안 배양되면서 관찰되었다. 배양 5일 후

190

에 세포들은 LIVE/DEAD assay kit (L-3224, Life Tech- nologies, USA) 를 통해서 방사된 미세섬유에서의 세포생존 율을 총 5회의 평균값과 표준오차 값을 토대로 평가하였다.

III. 연구 결과 및 고찰

1. 동심축류에 의한 이중구조의 수화젤 미세섬유의 제작 1.5 wt% Na-alginate 용액의 농도가 중심부의 Collagen type I 섬유 형성에 영향을 미치지 않으면서 외부에서만 빠 른 시간에 경화되는 최적 농도였으며, 함께 시도되었던 1 wt%, 2 wt% 와 3 wt% 농도의 경우에는 Collagen type I 의 섬유 형성을 유도할 수 없었다. Collagen type I 용액 은 온도에 의한 가교를 위해 표 1의 조건으로 가교 전의 pH 를 7.2~7.4로 유지하였다. 미세유체에 유입된 두 용액은 각 각 소자에서 나온 뒤 염화칼슘 용액에 잠기게 되는데, 이때 순간적으로 Collagen type I 용액의 외부을 둘러싸고 있는 Na-alginate 용액은 Na

과 Ca

간의 빠른 이온교환에 따 른 Alginate 수화젤의 가교화가 표면에서 확산에 의해 우 선적으로 진행되며, 이로 인해 Collagen type I 용액은 가 교화가 진행되는 동안 외벽형태로 둘러싸고 있는 Ca- Alginate 수화젤의 지지 및 보호를 받게 되어 3차원적인 섬 유 형태를 유지할 수 있었다. 항온항습기 내에서 30 분간의 가교시간 후, 그림 2(a)와 같이 ‘Core-Shell’ 이중구조의 섬 유 중심부에서 Collagen type I의 미세섬유가 형성되었음 을 확인 할 수 있었다.

2. 미세섬유 내 선택적인 물질의 탑재

그림 2(b)는 ‘Core-Shell’ 구조로 형성된 이중 구조의 미 세섬유 형태를 관찰하기 위해 각각 다른 형광물질을 고정 후 관찰한 사진이다. Collagen Type I 미세섬유는 Rhodamine B 용액에 의해 TxRED 파장대(590~630 nm)에서 붉은 색 의 발현으로 중앙 축에 형성되었고, 반면 Ca-Alginate 미 세섬유는 BSA-FITC 형광용액에 의해 FITC 파장대(460~

491.2 nm) 에서 녹색의 발현으로 Collagen Type I 에워싸 고 있는 형태를 확인 할 수 있었다. 이러한 ‘Core-Shell’ 형 태의 이중구조는 Na-alginate 용액을 미세유체 소자의 측 면에서 주입 시 중심채널에서 나오던 Collagen Type I 용 액과 만나면서 두 용액간의 층류 형성에 기인한다. 미세유 체 소자 채널안에서 Collagen Type I 용액의 외부를 Na- Alginate 용액이 감싸면서 나온 두 수화젤 용액은 우선 염 화칼슘 용액에 잠기면서 순간적으로 Na

-Ca

간 빠른 이 온교환에 의해 Ca-Alginate의 가교화가 우선적으로 진행되 며, 이로 인해 Collagen Type I 용액은 가교화된 Ca- Alginate 외벽에 의한 보호를 받으며 서서히 온도에 의한 가교 반응을 안정적으로 유도 할 수 있었다. 그림 2(c)에서 는 가교반응 전, Collagen Type I 용액에 고정한 10 µm 크 기의 형광입자는 TxRED 파장대에 의해 붉은색을 나타내 며 중앙 축에 형성되었음을 확인 할 수 있었고, Na-Alginate 용액에 고정한 5 µm 크기의 녹색 형광입자는 FITC 파장 대에서 녹색을 띄며 Ca-Alginate 부분에서만 관찰되었다.

‘Core’ 부분인 Collagen Type I 미세섬유와 ‘Shell’ 부분인 Ca-Alginate 미세섬유에 동시에 각각 다른 물질의 고정이

Fig. 2. Fluorescence image of the Collagen type I-Alginate hydrogel microfiber. (A) ‘Core-shell’ structured hydrogel microfiber, (B) Rhodamine B solution was mixed in collagen type I hydrogel microfiber and BSA-FITC solution was mixed in alginate hydrogel fiber, (C) red beads (10µm) were encapsulated in collagen type I hydrogel microfiber and green beads (5µm) were encapsulated in alginate hydrogel microfiber.

191 가능하였다. 녹색 및 적색 형광 입자를 포함하고 있는 ‘Core-

Shell’ 형태의 미세섬유를 3차원적으로 확인하기 위해 공 초 점 현미경을 통하여 재검증하였으며, 그림 3에서는 동심 축 미세섬유의 깊이에 따라 발현된 형광 입자를 통해서 Collagen Type I 및 Ca-Alginate 미세섬유의 위치와 ‘Core-Shell’ 특 징을 3차원적으로 검증하였다. 수화젤 미세섬유의 약 200 µm에 달하는 깊이를 Z-stacking 을 통해 0~100 µm깊이 에서는 녹색 형광 입자만이 관찰되었으며(그림 3(a, b)) 100~150 µm깊이에서는 적색 형광 입자(그림 3(c)), 150~

200 µm깊이에서는 다시 녹색 형광 입자가 관찰되었다(그림 3(d, e)).

3. 제작된 미세섬유의 표면 분석

Collagen Type I과 Na-Alginate의 가교반응에 따른 동 심 축류 미세소자 내의 중앙채널을 통해 형성된 Collagen Type I 미세섬유와 측면채널을 통해 형성된 Ca-Alginate 미세섬유의 표면 화학조성을 적외선분광 분석을 통해 비교 관찰하였다. 그림 4(a)는 Collagen type I 미세섬유와의 대 조를 위하여 Alginate 미세섬유의 화학조성을 분석한 결과 이며, 결과를 통해 Alginate 화학조성의 히드록시기 및 C- H 결합이 각각 3241 cm

, 2927 cm

파장대의 최고점과의 일치하는 조성분석을 나타냈었으며, 1595 cm

와 1404 cm

파장대의 최고점은 카르복실염 이온으로부터 기인하였음을 확인하였다. 마지막으로 1025 cm

와 948 cm

파장대 최 고점은 C-O결합을 나타내어 Alginate 섬유의 표면조성이 일치됨을 확인되었다. 반면, 그림 4(b)는 미세유체소자의 중 앙채널로부터 추출된 Collagen type I 미세섬유의 화학조 성이 1454, 1405, 1342, 1287, 1240, 1208 cm

파장대 의 최고점은 CH

, CH

, C-N, 그리고 N-H결합으로부터 기 인한 것과 일치함을 나타내었고 Collagen Type I의 화학 조성과 동일함을 확인하였다. Collagen type I의 외곽을 에 워싸며 형성된 Ca-Alginate 는 구연산소다를 이용한 분해 로 Collagen Type I의 물성에는 영향을 주지 않고 Ca- Alginate 만을 선택적으로 분해가 가능하였음을 증명하였다.

4. 미세섬유의 분해성 평가

그림 5(a)는 구연산소다가 처리되지 않은 동심 축 미세섬 유로, 중앙 축의 Collagen Type I 부분에서는 직경 10 µm 크기의 적색 형광 입자가 함께 혼합되어 형성되었기 때문에 TxRED 파장대로부터 형광 입자가 붉은색으로 발현됨에 따 라 중앙 축에 형성된 미세섬유의 위치 및 경계 면이 나타났 으며, 중앙 축의 Collagen Type I을 에워싸며 형성된 Ca- Alginate 부분에서는 직경 5 µm크기의 녹색 형광 입자가

미경 사진, (A-E) Z-stacking 분석, (F) 제작된 Collagen type I- Alginate 미세섬유의 3차원 사진.

Fig. 3. Confocal micrograph of Collagen type I-Alginate hydrogel fiber, (A-E) analysis of Z-stacking, (F) 3-dimensional image of fabricated Collagen type I-Alginate hydrogel microfiber.

그림 4. 적외선 분광기 분석 결과. (A) Alginate 미세섬유의 적외선 분광기 분석 결과, (B) Collagen type I 미세섬유의 적외선 분광기 석 결과.

Fig. 4. Analysis by FT-IR (A) spectra of alginate hydrogel microfiber, and (B) spectra of Collagen type I hydrogel microfiber.

192

혼합되어 형성되었기에 FITC파장대로부터 동일하게 Ca- Alginate 위치 및 경계 면이 녹색 형광입자에 의해 나타났 다. 그림 5(b)는 구연산소다 용액 처리 10분 후 동심 축 미 세섬유의 형광현미경 사진으로 붉은 색 형광 입자로 나타난 중앙 축의 Collagen type I 미세섬유에는 변화가 없으나, 녹색 형광 입자로 나타난 측면 축의 Ca-Alginate 미세섬유 는 처리하지 않은 상태에 비해 무너진 섬유형태를 관찰 할 수 있었다. 또한, 구연산소다 용액을 20분 처리한 후의 형 태를 관찰한 그림 5(c)에서는, Ca-Alginate 부분의 녹색 형 광 입자가 초기의 형태에 비해 수직적 길이대비 약 300%

이상 증가 및 퍼져나가는 현상이 관찰 되었으며 상대적으로 중앙 축의 Collagen Type I 부분에는 변화가 없음이 관찰 되었고 그림 5(d, e)를 통하여 순수한 collagen type I 미 세섬유를 광학현미경으로 확인하였다. 이를 통해 설계했던 Ca-Alginate 미세섬유만의 선택적인 분해가 성공적으로 진 행되었음을 확인할 수 있었다. 추가적으로 진행한 구연산소 다 용액의 농도에 따른 동심 축 미세섬유의 분해 속도의 의 존도를 그림 5(f)의 그래프를 통하여 분석하였다. 구연산소 다 농도가 5%, 10%, 20% 일 때, Ca-Alginate 미세섬유가 선택적으로 분해되는 데 소요되는 시간은 각각 대략적으로 20 분, 9 분, 4 분으로 측정되었으며, 총 5회의 평균값과 표

준오차 값을 토대로 분석하였다.

5. 3차원적인 공동배양 및 세포 적합성 평가

‘Core-Shell’ 구조의 특성을 이용해서 ‘Shell’의 위치인 Ca-Alginate 에는 C6 세포를 배양하였으며, ‘Core’ 위치인 Collagen type I 섬유에는 EpH4-Ras 세포를 고정하여 공 동배양을 하였다. 5일 간의 공동배양을 통해서 평균적으로 1 일 후에는 약 92.6%, 3일 후에는 87.4%, 5일 후에는 81.4% 로 세포 생존율이 나타났으며(그림 6(d)), 시간이 경 과될수록 세포의 사멸이 진행되었으나 배양 후 5일까지 세 포 생존율이 약 80% 이상으로 나타나 두 종류의 수화젤 내 부에 세포를 안정적으로 고정 및 배양 할 수 있음을 검증할 수 있었다(그림 6(a-c)). 또한 제작된 ‘Core-Shell’ 구조의 미 세섬유에서부터 Ca-alginate 만을 분해시켜 Collagen type I 미세섬유만을 준비하였으며, 섬유가 제공해 줄 수 있는 3 차원적인 환경을 유지하고자 PDMS로 제작한 창문 틀에 섬 유를 감은 상태로 바닥에서부터 부양시켰다. EpH4-Ras 세 포를 Collagen type I 표면에 도포하여 5일간 배양하였는 데(그림 7(a-c)), 배양 1일 후에는 평균적으로 약 94%, 3일 후 85%, 5일 후에는 72%의 세포 생존율을 나타내었다(그림 7(d)). EpH4-Ras 세포의 생존율은 공동배양시 보다 Collagen

Fig. 5. Observation of ‘Core-shell’ structured hydrogel microfiber and pure collagen type I hydrogel microfiber by fluorescence beads and TSC treatment (A) before the TSC treatment (B) TSC treatment for 10 mins., (C) TSC treatment for 20 mins (D) ‘Core-shell’ structured hydrogel microfiber, (E) pure Collagen type I hydrogel microfiber, and (F) degradation time with TSC concentration.

193

type I 미세섬유에서 상대적으로 약 10% 정도 감소되었으 나 이는 5일간의 배양기간 동안 배양액 교환시 수화젤 내부 보다는 표면에서 받게되는 외부 환경의 영향을 받은 것으로

판단된다. 하지만, 공동배양된 Collagen typ I-Alginate 미 세 섬유와 순수한 Collagen type I 미세섬유에서 모두 세 포가 고정, 생존 및 성장 할 수 있는 적합한 환경을 제공하

Fig. 7. EpH4-Ras cell culture on collagen type I fiber for 5 days (A) 1 day, (B) 3 days, (C) 5 days, and (D) graph of viability.

그림 6. Collagen type I 미세섬유 안에 배양된 EpH4-Ras 세포와 Ca-alginate 미세섬유 안에 배양된 C6 세포의 5일간 공동배양 (A) 1 일차, (B) 3 일차, (C) 5 일차, (D) 세포 생존율 그래프.

Fig. 6. Co-culture of EpH4-Ras cells in Collagen type I hydrogel microfiber and C6 cells in Ca-alginate hydrogel microfiber for 5 days (A), 1 day, (B) 3 days, (C) 5 days, and (D) graph of viability.

194

였음을 입증할 수 있었다.

IV. 결 론

Collagen type I 용액만을 미세유체 칩에 주입하여 용액 의 주입조건 및 가교조건을 제어하여 3차원적인 순수한 Collagen type I 미세섬유를 제작하고자 다양한 연구를 시 도하였다. 하지만 동심축류 소자에서 나온 Collagen type I 용액이 안정적인 가교전에 주변 환경에 의해 구조가 무너 지게 되고, 가교 후에도 물성의 저하로 3차원적인 섬유형태 가 쉽게 변형이 되었다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위 해 이온교환으로 단순하면서 빠른 가교가 가능한 Alginate 수화젤을 동심축류가 유도되는 미세유체 소자의 측면부에 함께 주입하여, Collagen type I 용액을 둘러싸면서 외벽 에서 일차적으로 가교를 유도한 후, Collagen type I 용액 이 가교가 되기 전까지 보호막 역할을 할 수 있도록 조건을 수립하였다. 또한 형성되는 ‘Core-Shell’ 형태의 미세섬유 구 조를 확인하기 위해, 형광입자를 미세섬유 제작시 함께 고 정하여 물질 고정 및 전달 가능성을 함께 검증하였으며, EpH4-Ras와 C6 세포를 Collagen type I과 Alginate에 고정하여 5일간 공동배양을 하여 약 80% 이상의 높은 세포 생존율과 함께 우수한 세포 적합성을 입증하였으며, Alginate 의 선택적인 분해를 통해 순수한 Collagen type I 만을 남 긴 후 표면에 EpH4-Ras 세포를 5일간 배양하여 Collagen type I 미세섬유 내부 및 표면에 물질 및 세포를 고정, 전 달 및 배양 할 수 있는 조건을 성공적으로 수립 할 수 있었 다. 이를 통해 Collagen type I 수화젤이 지니는 우수한 생 체재료적인 특성을 보존하면서도 3차원적이고 연속적인 미 세섬유로 생체의공학 및 조직공학 분야에서 손상된 조직의 치료 및 수복을 위한 우수한 세포 지지체등의 다양한 활용 분야에 적용 될 수 있을 것으로 예상한다.

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