서론
세포센서(cell-based biosensor) 는 살아있는 세포를 생체감지물 질 (biorecognition molecule)로 이용하여 다양한 계측대상물질 (analyte)들을 검출할 수 있는 바이오센서로서 초고속 신약 진단(high-throughput drug screening) 시스템이나 생화학 무기 및 병원균 의 검출에 대한 잠재적 응용 가능성으로 인해 최근 들어 동물세포를 이용한 바이오센서를 중심으로 활 발한 연구가 진행되고 있다. [그림 1]에서 보이듯, 세포센서는 센서에 고정화된 세포들이 신약과 같은 분석물질과 반응한 후 생기는 세포의 여러 가지 대 사작용(metabolism) 및 생존력(viability)의 변화를 전기화학 혹은 광학적인 방법으로 검출 및 분석하게 된다.
효소(enzyme)나 항체(antibody)를 이용한 바이 오센서와는 달리 세포센서는 특정한 한 물질과만 반 응하는 특이성은 없으나 세포들의 신진대사 및 생존 력의 변화를 모니터링함으로써 다양한 물질들을 고 감도로 검출할 수 있으며, 생명체의 가장 기본단위 인 살아있는 세포를 이용함으로 독성물질, 병원균, 신약 등과 같은 개체대상물질들에 대한 분석적인 정 보 외에도 그들이 실제 생명체의 생리현상에 미치는 영향에 대한 정보를 제공해 줄 있다. 따라서 세포센 서는 독물학(toxicology) 및 신약의 효능을 평가하 는데 있어 실제 동물을 이용한 값비싼 임상실험의
필요성을 최소화시킬 수 있는 잠재력을 지니고 있다.
현재까지 세포센서를 이용한 대부분의 분석은 96 well plate 혹은 384 well plate와 같이 보다 고밀도 로 집적화된 well plate 포맷을 이용해 행하여져 오 고 있으나, 최근 들어서는 소요비용의 절감과 초고 속 진단 및 대량검색의 기능이 강조됨에 따라 생물 학, 화학, 의학, 전자, 물리, 컴퓨터, 기계공학 등 최 첨단 학문의 관련 기술을 복합적으로 융합시켜 세포 센서를 마이크로어레이를 이용한 바이오칩 형태로 제조하고자 하는 연구가 진행되기 시작하였다. 마이 크로어레이 형태의 세포센서를 제조하기 위해 가장 먼저 선행되어야 할 연구는 세포의 상태를 모니터링
cell patterning
고 원 건
연세대학교 화학공학과, [email protected]
Measurement
electric output
Transducer
Analyte in complex medium
physical or chemical signal
Analyte acts on cells Sensing layer
Detection electrochemical optical piezoelectric
그림 1. 세포센서의 검출 메커니즘.
위해 많은 연구들이 “cell patterning”이라는 분야에 서 행하여지고 있다. 세포센서로서의 최종적인 응용 을 위해서, 제조된 세포 마이크로어레이는 분석하고 자 하는 샘플물질의 주입 및 이동을 위해 microfluidic device와 결합되고, 샘플물질과 세포와 의 반응은 광학이나 다른 방법 등을 이용해 분석된 다. 본 강좌에서는 마이크로칩 형태의 세포센서를 제조하기 위해 필요한 여러 기술 중에서 미세가공기 술 (microfabrication technique)을 이 용 한 cell patterning 기술에 중점을 두어 설명하고자 한다.
본론
Cell patterning은 마이크로미터 수준으로 여러 세 포들을 특정한 위치에 고정시키는 작업으로서 세포- 세포, 세포-표면, 세포-매트릭스 사이의 상호작용과 같은 기본적인 세포생물학을 연구하는데 필요한 모델 시스템을 제공해줄 수 있을 뿐만 아니라 세포센서를 제조하는데도 필요한 기술이다. 즉, 최근 들어 세포센 서가 분석, 진단 및 신약개발 시 소요되는 비용의 절 감과 고효율성을 위한 대량검색의 필요성이 강조되면 서 cell patterning을 이용하여 세포센서를 어레이화 (array) 및 소형화(miniaturization)하고자 하는 노 력이 활발히 진행 중이다. 마이크로패턴닝화된 세포 어레이는 기존의 MEMS(micro electro mechanical system)란 반도체 공정기술을 바이오/의료분야의 요구에 맞게 적용하여 제조되는데 현재까지는 금속이 나 플라스틱과 같은 2차원 표면을 photolithography와 soft lithography를 이용하여 마이크로패턴닝한 후 패턴닝된 표면위에서 세포의 선택적 부착(adhesion) 및 성장(growth)을 제어하여 세포 어레이를 만드는 방법이 가장 널리 사용되고 있다.
게 두 방법으로 나누어 질 수 있다. 첫 번째 방법은 감광성 물질(photoresist)과 포토마스크를 이용한 것 으로 [그림 2(A)]에 묘사되어 있다. 우선, silicon 웨이퍼와 같은 기판표면에 코팅된 감광성 물질을 포 토마스크를 통해 자외선에 노출시켜 원하는 패턴을 얻은 후, 제조된 마이크로패턴과 기판표면에 세포의 부착을 유발하는 collagen, fibronectin과 같은 단백 질을 흡착시킨다. 최종적으로 패턴닝된 감광성 물질 을 제거하게 되면 단백질 마이크로패턴이 얻어지고, 그 위에 세포들이 선택적으로 부착하여 원하는 세포 패턴을 얻을 수 있다[그림 2(B)].
두 번째 방법은 Matsuda 그룹에서 개발된 방법으 로, 그들은 phenyl azide 그룹의 광화학적 특성을 이 용하여 다양한 표면을 개질하고 세포들을 마이크로 패턴닝하였다. Phenyl azide 그룹은 특정한 파장의 자외선에 노출되었을 때 매우 반응성이 강한 nitrene 으로 전환되며, nitrene 그룹은 polyurethane, poly(ethylene terephthalate) and polystyrene과 같 은 다양한 고분자 표면과 공유결합을 형성하게 된다.
따라서 단백질이나 다른 고분자 물질에 phenyl
azide 그룹을 커플링시킬 경우, 자외선 노광에 의해
다양한 물질들을 표면에 화학적으로 결합시켜 표면
의 물리/화학적 특성을 원하는 응용목적에 따라 변
화시킬 수 있게 된다. [그림 2(C)]는 이러한 phenyl
azide 유도체의 특성과 포토마스크를 이용하여 단백
질을 패턴닝하는 과정을 보여준다. 첫 번째 단계로
서, 세포의 부착을 돕는 단백질을 phenyl azide 그룹
과 결합시킨 후, 표면에 스핀코팅 시킨다. 표면에 코
팅된 필름에 포토마스크를 통해 자외선을 비추게 되
면, 자외선에 노출된 부분만이 선택적으로 표면과
반응하여 결합된다. 최종적으로 반응하지 않은 부분
을 세척하여 제거함으로써 원하는 단백질 패턴이 얻
어지고, 마찬가지로 그 위에 세포들이 선택적으로
세포센서로의 응용을 위한 cell patterning 기술
부착하여 원하는 세포 패턴을 얻게 된다[그림 2(D)].
2) Soft lithography를 이용한 cell patterning 하버드 대학의 Whitesides 교수 연구팀은 photo- lithography를 대신할 수 있고 바이오분야에 보다 더 적절한 미세가공기술인 soft lithography를 개발 하였다. 이러한 soft lithography는 탄성체인 PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드를 이용하여 표 면을 개질하고 패턴닝하게 된다. PDMS 몰드를 제 작하는 기술은 일종의 플라스틱 가공기술로서 casting, injection, hot-embossing 등의 다양한 방법 으로 원하는 몰딩구조를 얻을 수 있다. 예로서 silicon 웨이퍼 위에 SU-8이라는 감광성의 물질을 코팅하고 포토마스크를 이용해서 패턴닝하게 되면
결과적으로 마스터(master)가 만들어지며, 이것을 주형으로 하여 PDMS를 casting하고 소결시키면 stamp 역할을 할 수 있는 PDMS 몰드를 완성할 수 있다. PDMS stamp를 이용한 soft lithography 방 법에는 micro-contact printing, replica molding, micro-transfer molding, capillaries를 이용한 micro- molding 등이 있다. 또한, 완성된 PDMS 표면을 플 라즈마 처리를 하게 되면 그 표면이 산화되어 친수 성으로 표면 특성이 변화됨과 동시에 유리나 또 다 른 PDMS 재질과 접합시킬 수 있게 되어 미세유체 채널(microfluidic channel)의 제작 등에도 널리 사 용되고 있다. [그림 3]은 이러한 기술 중 micro- contact printing(µ-CP)과 미세유체채널을 이용한 cell patterning 방법을 보여주고 있다. µ-CP은
(C)
Cell adhesion protein
Coupling
Chemicals carrying a photo-reactive group
Coating
UV irradiation
Mask
Substrate surface Crosslinked and
immobilized protein
(D)
그림 2. Photolithography를 이용한 cell patterning.
(A) Light
photoresist photoresist
pattern Protein solution
Desired pattern of the protein Development of
photoresist
Removal of photoresist
(B)
monolayer, SAM) 패턴을 만드 는 방법으로서, PDMS 몰드와 SAM을 유발하는 용액을 이용하 여 마치 도장과 잉크와의 관계처 럼 몰드에 각인된 패턴을 이용하 여 기질 표면에 원하는 SAM 패 턴을 얻을 수 있게 된다. µ-CP을 이용한 세포나 단백질의 마이크로 패턴닝은 금이나 은과 같은 표면 에 자발적으로 결합하여 초박막의 단분자막을 형성할 수 있는 alkanethiols(HS(CH
2)
nX)을 계면 활성물질로 이용하여 행하여진다.
여기서 티올기의 머리부분은 금과 같은 기질표면에 계면활성물질이 자발적으로 결합할 수 있게 해주 며, X로 표현된 말단 부분의 기능 기는 SAM의 표면 성질을 결정 하게 된다.
예를 들어 말단기가 친수성의 oligo(ethylene glycol) 혹은 poly (ethylene glycol)인 alkanethiol은 단백질이나 세포의 부착을 저지하 는 SAM을 형성하게 되고, 말단 기가 소수성인 alkanethiol은 단백 질과 세포의 부착을 촉진시키는
SAM을 형성하게 된다. [그림 3(A)]에 나타나 있 듯이 µ-CP을 이용하여 기질 표면을 세포의 부착을 촉진하는 SAM과 저지하는 SAM으로 패턴닝할 경 우 세포들을 10~100µm 수준으로 패턴닝할 수 있 게 된다. [그림 3(B)]는 미세유체채널을 이용해서 단백질이나 세포들을 패턴닝하는 방법을 보여주고 있다. 미세유체채널은 채널 형태의 패턴을 가진
PDMS를 실리콘이나 유리표면위에 conformal contact를 이용해 제조된다. 제조된 미세유체채널의 입구에 단백질이나 세포용액을 떨어뜨리면 모세관 효과에 의해 용액들이 각각의 채널로 흡입되고 일정 시간이 지나면 세포나 단백질이 표면에 부착된다.
마지막으로 PDMS 몰드를 기질표면에서 제거하게 되면 원하는 단백질 혹은 세포 패턴을 얻게 된다.
(A)
(B)
(C) (D)
Removing stamp
Patterned SAM promoting cell adhesion
Exposure to another alkanethiol (preventing cell adhesion)
PDMS
Solution
Remove the PDMS stamp Fill the microchannel by capillary action with solution containing biomolecules or cells
Patterned protein or cells
Inlet 1
Inlet 2
Inlet 3
그림 3. Soft lithography를 이용한 cell patterning.
세포센서로의 응용을 위한 cell patterning 기술
한 예로서, 하버드 의대의 Toner 그룹은 미세유체채 널을 이용하여 세포의 부착을 돕는 collagen과 fibronectin 단백질을 패턴닝한 후 패턴닝된 표면을 세포와 배양시켜 세포패턴을 만들었다. 미세유체채 널을 이용한 패턴닝 방법의 장점은 각각의 채널이 독립적으로 존재하여 여러 채널에 서로 다른 물질을 주입할 수 있으므로 다양한 종류의 단백질이나 세포 들을 쉽게 한 표면에 패턴닝할 수 있다는 점이다.
또한 각각의 채널들은 아주 적은양의 용액으로 채워 질 수 있으므로 값비싼 생체분자(biomolecule)들의 사용량을 줄일 수가 있다. 미세채널 안에서 유체흐 름의 가장 큰 특징은 매우 낮은 Reynolds 넘버를 가지며 따라서 층류(laminar flow)란 점이다. [그림 3(C)]에 나타나 있듯이 여러 입구에서 주입된 유체 들이 한 개의 미세채널에서 만날 경우, 각각의 흐름 이 서로 섞이지 않고 평행을 이루며 흐르게 된다.
이와 같은 현상을 이용하여 다른 종류의 세포들을 한 미세채널에 동시에 유입시킬 경우 [그림 3(D)]
에 보이듯이 각각의 세포들이 나란히 배열되어 있는 세포패턴을 얻을 수 있게 된다.
3) 하이드로젤 마이크로패턴을 이용한 cell patterning 앞서 설명한 photolithography나 soft lithography 를 이용한 대부분의 cell patterning에서는 세포들이 2차원의 기판 표면위에서 고정되고 성장한다. 하지 만 이러한 2차원 시스템에서는 non-adherent 세포 들을 고정화시키기가 불가능하다. 또한 세포들이 실 제 동물 신체 내에서는 2차원 표면이 아닌 단백질,
다당류 등을 포함한 extracellular matrix(ECM)로 구성된 3차원 구조의 하이드로젤 내부에 고정되어 성장하므로, 2차원 시스템에 고정된 세포들은 실제 와는 다른 부자연스러운 환경에 존재하게 된다. 따 라서 2차원 시스템에 고정된 세포들의 신약과 같은 개체대상물질과의 반응은 실제 신체 내에 존재하는 세포들의 반응과는 크게 다를 수 있어 부정확한 정 보를 제공해 주게 될 가능성이 매우 높아진다. 이와 같은 2차원 시스템의 단점을 보완하고자 필자는 3차 원 구조의 하이드로젤 마이크로패턴 내부에 세포를 고정하는 즉, cell encapsulation 기술과 미세가공기 술을 결합하여 새로운 cell patterning 방법을 개발 하였다. 이를 위해 가장 먼저, 실제 세포들이 존재하 는 ECM의 성질을 가지면서 또한 미세가공기술에 의해 마이크로패턴닝이 가능한 하이드로젤 물질을 만들고자 하였고 그에 대한 해답으로 poly(ethylene glycol)(PEG)를 이용한 하이드로젤 마이크로패턴을 제조하였다. PEG는 친수성의 고분자로서, 단백질이 나 세포의 부착을 방지하고 생체적합성이 매우 뛰어 나 생체재료로서 많이 이용되고 있다. PEG 양쪽에 acrylate 말단 작용기를 결합시키게 되면, UV와 같 은 빛과 광개시제(photoinitiator)에 의해 가교가 일 어나 PEG 하이드로젤을 형성하게 된다. 이때 다양 한 모양을 가지고 있는 photomasks를 이용하게 되 면 [그림 4]에 보이듯 여러 가지 모양과 크기를 지 닌 3차원 구조의 하이드로젤 마이크로패턴을 제조 할 수 있다.
그림 4. Photolithography를 이용해 제조된 PEG 하이드로젤 마이크로패턴.
제조된 하이드로젤의 물함유량은 세포들이 존재하 는 실제 신체조직과 비슷하게 70~80%로 조절될 수 있으며, 다양한 단백질 혹은 생리활성 물질들을 하이드로젤과 결합시켜 세포들이 자랄 수 있는 최적 의 조건을 만들어 줄 수 있다.
세포를 포함한 하이드로젤 마이크로패턴을 제조하 기 위해서는 acrylated PEG과 광개시제를 포함하고 있는 수용액에 세포를 첨가하고, 이 용액을 이용해 실리콘과 같은 기판 표면을 코팅한 후, photomask 를 통하여 UV를 비춘다. 이때 UV에 의한 자유라 디칼 중합(free radical polymerization)에 의한 가교 및 gelation이 일어나면서 하이드로젤이 제조되고 그 와 동시에 세포들이 자연스럽게 3차원 구조의 하이
드로젤 내부에 고정된다. 최종적으로 가교가 일어나 지 않은 부분을 제거함으로써 원하는 세포패턴을 얻 게 된다[그림 5].
[그림 6]은 이러한 방법으로 제조된 원통형 구조 의 하이드로젤 마이크로패턴을 보여준다. [그림 6(A)]는 지름이 600 µm인 하이드로젤 마이크로패 턴 내부에 고정된 세포들의 광학현미경 사진이며, [그림 6(B)]는 세포를 함유하고 있는 지름 50 µm의 하이드로젤 마이크로패턴을 보여주는 SEM 사진이 다. PEG 하이드로젤의 투명한 특성으로 하이드로젤 내부에 고정된 세포는 광학현미경으로 관찰이 가능 하다. SEM으로는 하이드로젤 내부에 세포의 존재 유무를 확인할 방법이 없으나 [그림 6(B)]에서 보 (A) (B) (C)
그림 5. 세포를 함유하고 있는 하이드로젤 마이크로패턴 제조 과정.
(C)
그림 6. 하이드로젤 마이크로패턴 내부에 고정화된 동물세포.
세포센서로의 응용을 위한 cell patterning 기술
듯이 형광현미경으로 세포의 유무를 확인할 수 있었 다. 세포를 포함하고 있는 하이드로젤 마이크로패턴 은 미세유체채널 내부에서도 제조될 수 있으며, [그 림 6(C)]은 PDMS로 제조된 미세유체채널에 세포를 포함하고 있는 하이드로젤의 제조 과정을 보여준다.
이와 같이 세포를 3차원 구조의 하이드로젤 내부 에 고정시킬 때 가장 중요한 점은 UV에 의한 가교 과정 동안 세포가 생존력 및 기능을 유지하고 있어 야 한다는 점이다. 세포의 생존력은 다양한 방법에 의해 측정될 수 있는데, 그중 한 방법이 Live/Dead Viability/Cytotoxicity fluorescence assay이다. 이 assay는 SYTO 10과 Dead Red라는 두가지 형광물 질을 이용하는데, 형광현미경으로 관찰 시에 죽은 세포는 빨간색으로 살아 있는 세포는 녹색으로 나타 나게 된다.
[그림 7(A)]는 600µm 지름을 가진 하이드로젤 내부에 세포들을 고정시킨 후 행한 Live/Dead fluorescent viability assay를 보여주는 그림이다. 그 림에서 보이듯이 대부분의 세포들이 하이드로젤 제 조 후에도 생존력을 유지하고 있음을 알 수 있다.
[그림 7(B)]는 이러한 viability assay를 이용하여 독성물질을 검출하는 예를 보여준다. 하이드로젤 내 부에 고정된 세포를 sodium azide 용액과 반응시킨 후 세포의 생존력을 확인해 보았는데, [그림 7(B)]
에 보이듯이 sodium azide에 의해 대부분의 세포가 하이드로젤 내부에서 죽어 있음을 알 수 있다. 이와 같이 어떤 물질과의 반응에 따른 세포의 생존력 변
화를 이용해 그 물질의 독성 및 인체에 미치는 영향 을 다양한 assay를 이용해 확인할 수 있다.
결론
Cell patterning 기술은 high-throughput, multi- analyte 바이오센서 있어서 필수적인 요소이다. 본 강좌에서는 지금까지 널리 사용된 cell patterning 방법에 대해 간략히 비교, 설명하였다. 세포로부터 정확한 signal을 얻기 위해서는 세포들에게 실제 그 들이 신체 내에 존재하는 환경과 비슷한 환경을 제 공하여야 한다. 하지만 현재까지 개발된 대부분의 cell patterning 기술은 실제 세포들이 존재하는 3차 원 구조의 하이드로젤 matrix가 아닌 2차원 표면에 세포를 고정화시킴으로써 그 한계가 존재했다. 이러 한 문제를 극복하기 위해서는 3차원 구조의 ECM과 같은 하이드로젤 물질을 개발하여 그 안에 세포들을 고정시켜야 하는데, 그 한 예가 여기에 소개된 PEG 하이드로젤을 이용한 cell patterning이다. 최근 들어 서는 세포들을 실제 collagen fiber를 모방한 나노사 이즈의 고분자 fiber로 제조된 scaffold 안에 고정시 키거나, 자기조립에 의해 하이드로젤을 형성할 수 있는 polypeptide 시스템을 이용해 고정화시키는 방 법 또한 개발되었다. 계속해서 세포들에게 보다 더 생체모방형 환경(biomimetic environment)을 제공 하고자 하는 노력이 활발하게 진행되고 있으며, 이러 한 3차원 세포배양 시스템을 다양한 미세가공기술과 결합하여 high-throughput, multi-analyte 바이오센 서로 응용하고자 하는 연구가 활발히 진행 중이다.
(A) (B)
그림 7. Live/Dead Viability/Cytotoxicity fluorescence assay.
저자약력 고 원 건
1997년 연세대학교 화학공학과 학사 1999년 연세대학교 화학공학과 석사
2004년 The Pennsylvania State University 화학공학과 박사 2005년 Stanford University 화학공학과 Postdoctoral Scholar 현 재 연세대학교 화학공학과 조교수
