약 학 회지 제
46
권 제1
호52 ~ 5 7 (2002)
Yakhak Hoeji V ol. 46
，N o. 1
藥 學 舍 확황기 부탄올 분획물이 생쥐의 세포성 면역기능에 미치는 영향
김정훈
# •
문 연 자•
이성원•
이승연•
박정숙* •
우원홍 원광대학교 한의학전문대학원,
*원광대학교 대학원 약학과(Receiced O ctober 22
，2001; R evised N ovem ber 25, 2001)
Effects of the Butanol Fraction of Astragali Radix on the Cellular Immune Function in Mice
Joung Hoon K im #, Yeun Ja M un, Sung Won Lee, Seung Yon Lee, Joung Suk Park* and Won Hong Woo
Department of Newly-Developed Drugs, Professional Graduate School of Oriental Medicine, Wonkwang University and
^Department of Pharmacy, Graduate School of Wonkwang University, Sinyong-dong, Iksan, Chunbuk, 570-749, Korea
Abstract — Effects of the butanol fraction of Astragali Radix (BFAR) on the cellular and nonspecific immune responses were
inve stig ate d in IC R m ice . M ice w ere d ivided in to 4 groups and B F A R a t doses o f 5 ，25 and 125 m g/kg w ere adm inistered o rally to m ice daily fo r 3 w eeks, and th e no rm al anim als w ere given vehicle. T he results o f th is study are sum m arized as follow s; the relative w e ig h t o f thy m us w as g reatly increased by B F A R treatm ent, com pared w ith th a t in no rm al m ice. H o w ever, the body w e ig h t g ain w as no t affected. D elayed-type hyp e rse nsitivity (D T H ) reaction to sheep red blood cells (S R B C ) for ce llu lar im m u n ity w as sig nificantly enhanced b y B F A R tre atm e nt, com pared w ith those in n o rm al m ice. In these m ice, B F A R also dose-dependently increased activ itie s o f phagocyte and natural k ille r (N K ) cells as w ell as th e nu m b e r o f leukocyte re sulte d from nonspecific im m unity. T hus, these re sults dem onstrate th a t B F A R tre atm e n t results in a significant increase in b o th ce llu lar and no nspecific im m u n e responses to an tig e n in concentrations th a t enhance h um o ral im m u n e functio n.
Keywords □ Astragali Radix, delayed-type hypersensitivity reaction, phagocyte activity, natural killer cell activity, leu
kocyte, mice
황기
(Astragali Radix)
는콩과(Leguminosae)
에속하는다년생 초본으로우리나라의 중북부지역에서 자생하며，보기제로써 민 간요법으로널리사용되고있다.1>
한방에서는그뿌리를주로약 재로시용하고있으며,
보중익기,
탁독등의 효능이 있고，내상 노권및모든 기쇠허혈중에 치료효과가있는것으로 알려져 있다
.2>
이에관한주요한약리효능연구로는혈압강하작용,
강심작용
,
간장보호작용，혈당강하작용등이 보고되어 있다.3#
황기의 구성성분.0■■로는
triterpenoide glycoside
계통과flavo
noid
계통이주를이루고있고,7-10)
특히 황기부탄올분획물은그메탄올추출물의 여러 성분 중주로
soyasaponin
과astragalo- sides
가함유하는것으로알려져 있다.11)
황기의 면역학적 보고에 따르면
Purmova
등12>은 황기의saponin
이간이나근육에서 과산화지질형성 억제와cholesterol
*본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 063-850-6942 (팩스) 063-850>6840 (E-mail) [email protected]
농도를감소시켰으며 면역기능을중가시켰다고보고하였고
, Zhao
둥135은방사선에의해억제된T-dependent antigen
에대한항체 반§이 황기에의해회복되었다고보고하였다. Kim
등1 4}
도황기 의 메탄올 추출물이 면양적혈구에 대한 적혈구 응집소가(hemagglutination titer)
및용혈반형성세포등생쥐의 체액성 면역기능을증가시킨다고보고하였다.
더욱이우리는또한이전 의보고에서 황기의 부탄올분획물이 용량에 따라생쥐의 체액 성면역기능을중가시킨다고하였다.15)
앞에서 본바와 같이 황기의 약리작용과 체액성 면역활성에 대한많은연구가진행되어 왔으나
,
황기부탄올분획물이 여러 가지용량과의 세포성 및비특이적 면역반응들과의상관성에대 해서는연구된바없다.
따라서 저자들은황기부틴올분획물의 용량에따라세포성 면역항진작용에 미치는영향을관찰하였다.
실 험 재 료 및 방법
실험동물
-
생후6주령,
암컷ICR
생쥐를실험동물개발(경기도52
황기 부틴올 분획물의 세포성 면역중가 53
오산시)에서 분양받아 시판사료(신촌실험동물사료제품
;
조지 방3.5%
이상,
조섬유7.0%
이하,
조단백질22.5%
이상,
조회분9.0%
이하,
인0.5%
이상)로1
주간급식시켜 적응시킨후,
전체를4
군으로나누어23±20C
에서사육하였다.
황기부탄올조제 및투여
-
우리의 이전의보고15>에서실시한 바와같이,
황기(서울동대문구한익유통)를세말로한다음그50g
을'
추출,
여과및감컵1•농축하여부탄올분획물400 mg
을얻 었다.
이황기부탄올분획물을phosphate-buffered saline(PBS:
Gibco Co., Grand Island, N. Y., USA)
에녹인 다음 생쥐 체중kg
당5, 25
및125 mg
을3
주간1
일1
회동일한시간에 경구투 여하였고,
정상대조군은PBS
를위와같은방법에따라투여하 였다.
체중및흉선의 중량계측
-
실험동물의 체중은시료투여 개시 일과최종일약24
시간전에 절식시킨후동일한시간에측정하 였다.
흉선의 중량은 최종약물투여 1일후에실험동물의 경동 맥을절단하고채혈한후,
흉선을각각적출하여그중량을측정 하여 체중에 대한백분율을구하였다.
항원조제
-
면양적혈구(Sheep red blood cells; SRBC)
를사용 하였는데,
그 방법은웅성 면양의 경동맥으로부터heparin
처리 주사기로채혈한후동량의Alserver’s
액(pH 6.1)
을가하여4°C
에서 보존하여 2주일 이내에사용하였다.
보존중인SR B C *
사용할때에는사용 직전
PBS
로3
회원심세척한후적절한농도로
Hanks’ balanced salt solution(HBSS: Gibco Co.)
에부유시 켜사용•
하였다.
면역
-
원심 세척한SRBC
를Reed
동16>의 방법을참고하여HBSS
에lX 1 0
8cells/m/
의농도로 부유시키고，그 부유액0.1 m l(lX
1 0 7cells)
를생쥐의꼬리 정맥에주사하여 면역을유도하 였다.
비장세포부유액의조제
-
비장을생쥐로부터무균적으로적출 하여minimum essential medium(MEM; Gibco Co.)
으로 조심스럽게 분쇄한후
nylon mesh
로여과하며 세포 덩어리를제거하였으며，빙냉
MEM
으로40C
에서3
회원심세척한후.
비장세 포수가2 X l0 7celWmZ
가되도록HBSS
에부유시켰다.
매실험 때마다비장세포의생존율검사를trypan blue exclusion method
로다음과같이 실시하였다.
시험관에0.3 m/
의세포부유액을 넣은다음0.1 m/
의trypan blue dye
용액을가하여5
분경과후,
백혈구계산관에서무색인 생세포와적색으로염색된사세포수 를측정하여그백분율을계산하였다.
족척종창반응의측정
(Footpad swelling te s t)-
지연형과민반 응(delayed-type hypersensitivitity reaction; DTH)
을즉정하기 위하며Yoshikai
등17)
이기술한방법에준하며 다음과같이실 시하였다.
즉면역4
일후에SRBC 0.05 m/(lX 10
8c e lls ^
생쥐 의좌측후지족척에피내주사하였다.
주사한다음24
시간 경과 한후종창의두께를0.01 mm
눈금microcaliper(Mitutoyo Mfg.
Co., Ltd., Japan)
로측정하였으며,
측정에따른오차를피하기 위 하여3
회측정한수치를평균하였다.
판독기준은Sugimoto
등18>
의판독기준에 따라다음과같이 족척종창지수로표시하였다
.
총창두께 ᅳ정상두께
Footpad swelling index = --- . , ^ .--- x 100
정^ ■께
대식세포활성도의측정
-
대식세포의탐식능력을 측정하고자 본실험에서는Biozzi
등19>이기술한방법에 준하여 다음과 같 이실시하였다.
즉,
최종약물투여2
일후에Rotring ink®
를1%
gelatin
수용액으로 6배희석한현탁액을조제하여37°C
에보관하였다
.
위와같이조제한colloid
상탄소현탁액을생쥐 체중g
당0 . 0 1
m
/씩꼬리정맥내로주사하였다.
그후생쥐의 안와후부정맥혈관총
(retro-orbital plexus)
을heparin
처리된capillary
tube
( 2 0\il: microhematocrit)
로천자히여 2 0\il$\
혈액을 1 0,
2 0및
30
분간격으로채혈하여0.1% sodium carbonate
용액2 m/
가든
test tube
에넣어서 적혈구가용해되도록 잘혼화하였다.
이어서 흡광도를
600 nm
에서 측정하고다음 공식에 따라 계산하였다
.
실험동물의 체중,
간장및비장의 무게를 측정하고,
이 들로부터phagocytic coefficient
와corrected phagocytic index
를계산하였다.
B Corrected phagocytic index = j—j-^x5/K
B : Body weight L : Liver weight S : Spleen weight
K : Phagocytic coefficient
(즉정농도의10
배수를log
로 전환 하고시간에대하여plot
한graph
곡선)
Natural killer cell activity
활성도의 측정-
약물투여 최종 일로부터 2일후에 생쥐를치사시켜 전술한방법으로 비장세포 를분리하여RPMI 1640
배지에2X10
7cells/m/
의농도를 현탁 시켜작동세포로써 이용하였다.
표적세포로는YAC-I cell
을이용 하였으며，Kiesseling
등2 0〉의방법으로sodium chromate 51Cr
(에 너지연구소에서 분양)를labelling
한후，2X
1 0 5cells/m/
의농도 로부유시켜 사용하였다.
이때 세포생존율이95%
이상 되게 하 여,
작동세포와표적세포의 비율은100:1
로하였다. 51Cr
이 표식 된표적세포(2X10
5cells/ml) 100 ji/
와작동세포(IX 1 0
7cells/
ml) 100 !j
/를96 well tissue culture plate(Flow Lab., USA)
의 각well
에혼합한후, 37°C, 5% C0
2incubator(Forma, USA)
에 서5
시간배양하였다.
이tissue culture plate
를500Xg
에서10
분간 원심분리한후,
상증액 1 0 0jo/
씩 취하여gamma counter
(Beckman, USA)
로방4
능을측정하였다.
각실험은3
배수로실 시하였으며, percent specific lysis
를다음의 식에의하여 산출하 였다.
M i l
0 5 25 125
B F A R (m g /k g /d ay )
Fig. 1 - Effects of the butanol fraction of Astragali Radix on the body weight gain in mice. The butanol fractions of Astragali Radix (BFAR; 5, 25 and 125 mg/kg, respectively) were administered orally to mice daily for 21 consecutive days.
Mice were immunized i.v. with 107 SRBC 5 days prior to each measurement. Each column represents the mean
士SE of results obtained from 6 to 7 mice.
% Specific lysis = [(c.p.m. in experiment - c.p.m. spontaneous release)/(c.p.m. maximum release - c.p.m. spontaneous release)]
xlOO
여기에서
c.p.m. experiment release
는실험군의 상중액 1 0 0m
/의방사선량, c.p.m. spontaneous release
는작동세포가들어 있지 않고표적세포만들어있는대조군의 상증액 1 0 0m
/의방 사선량이고, c.p.m. maximal release
는 표적세포(
1 0 4cells in 100 ml) 1% Triton X-100
용액100 |i
/를가하여 얻었으며，표식 된 방사능의95%
이상이 되게 하였다. C.p.m. spontaneous release
는c.p.m. maximal release
의1 0%
이내가되게하였다.
말초순환백혈구수의촉정
-
생쥐의안구정맥총으로부터 말초 혈액을채혈하고Tiirk
액(1% gentian violet
수용액1 m
/를중류수 1 0 0
m
/에녹인용액)으로 희석하여 혈구계산판상에 적하한후백혈구총수를측정하였다
.
통계학적 분석
-
모든자료는mean
土standard error(S.E
.)로 나타냈으며,
유의성 검사는Student’s t-test
로행하였다.
실 험 결 과 및 고 찰
황기부탄을분획물이 생쥐의 세포성 및비특이적 면역반응에 미치는영향에 대한실험의 결과와고찰은다음과같다
.
체중의 변화
-
각군의 체중변화는Fig. 1
과같다.
정상대조군 의체중증가율이26.78±2.30
%인데비해황기부탄올분획물투 여군모두에서 거의변화가없었다.
흉선의중량변화
-
각군의흉선의 중량변화는Fig. 2
와같다.
흉선의 중량비는정상대조군이0.08
土0.01
%인데 비해 황기부탄을분획물
5, 25 mg/kg
투여군에서는흉선의중량변화가없었0.18 0.16 g 0-14 -g 0.12
•g
、0 .1 01 008
| 0.06
>、
fE 0.04 0.02
0 .0 0
B F A R (m g/kg/day)
Fig. 2 - Effects of the butanol fraction of Astragali Radix on the thymus weight in mice. Abbreviations: butanol fraction of Astragali Radix, BFAR. Other legends and methods are the same as described in Table 1. Each column represents the mean
士SE of results obtained from 6 to 7 mice. Asterisks denote a significant difference compared with the values in normal mice not fed BFAR (*p<0.05; **p<0.01).
으나
, 125 m^kg
투여군은0.14±0.01%
로현저한중가를보였다.
이는흉선이중추임파조직으로T
임파구의분화와깊이관여하 고있다고잘알려져 있고,
또한황기의 메탄올엑스투여시 흉 선의중량이중가했다는Kim
등1 4〉의보고와유사한점으로미 루어,
황기부탄올분획물의 용량에따라세포성 면역빈냉•에영 향을미치는것으로사료된다.
지연형과민반응에미치는영향
-
세포성면역반응인족척종창 반응에 의해 측정한 지연형 과민반응은 감작임파구에 의한lymphokine
의화학적 전달인자의유리에 의해서 성립되며특히대식세포가깊이관여하는것으로알려져 있는바
,
본실험에서 정상대조군에비해황기의부탄올분획물5, 25
및125 mglcg
투 여군에서유의성있는증가를보였다(Fig. 3).
이는myocarditis
에 걸린생쥐에게황기투여시 항염작용이 있었다는Yang
^ 의보고 와in w
조ro
에서황기가interferon
의유도를중가시켰다는Hou22)
의보고로미루어,
황기의부틴올분획물투여시lymphokine
의생성과
macrophage
의활성을촉진시킴으로서 세포성면역을중가시킨것으로사료된다
.
대식세포의활성에미치는영향
-
대식세포의활성은항원에의 한면역능의발현및interleukin
의분비에중요한역할을하며,
그 탐식능이ᄆ조상조직내피계에얼마나영향을미치는가를알기위한지표로이용된다
.
본실험에서 황기의부탄올 분획물5, 25
및125 mgAtg
투여군은정상대조군의3.86±0.25
에비해521±0.28, 6>32±035
및6.52±032
로용량에따라의의있는중기를보였다(Fig. 4).
이는황기의물추출물에서 얻은polysaccharide
가생쥐의 복강에있어macrophage
의대식세포의활성을증가시켰다는Fang
등i<»
의보고와생쥐비장에 있어서도또한macrophage
의활성을 촉진시켰다는Chen
등23>의보고와황기 메탄올추출물이 생쥐의 대식세포기능을항진시켜interleukin-1
을중가시켰다는Sugiura
J. Pharm . Soc. Korea
- irk
l i l t
0 5 25 125
54 김정훈
•문연자
•이성원
•이승연
•박정숙
•우원홍
I—
.—
I
——I——.
—I—.
——I——.
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.^
ᅵ ᄀ -
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1
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o )^ O )I0/VV A
pog
황기 부틴올 분획물의 세포성 면역증가 55
등
24
>의보고와유사한점으로미루어，황기의부틴올분획물의주 성분인saponin
둥이직접적으로macrophage
의활성을유의하게 중가시킨것으로생각된다.
N K cell
의 활성에 미치는 영향- NK cell
의활성은 종양의 성장에 대해 저항하는 대과립성 임파구의 일종으로종양면역기능에 중요하며
， 25-30)
특히 숙주의 비특이적 면역능의 부활여14 T
^를 확인하기 위하며 실시하는데
,
본실험에서 황기의 부탄올 분획물5, 25
및125 mg/kg
투여군은 정상대조군의19.08
土1.04
에비해22.33±1.01, 23.33±1.45
및25.00±2.02
로용량에따라 유의한 중가를 보였다
(Fig. 5).
이는 황기의swain-
sonine
을 생쥐에투여시B16-F10 melanoma cell
의전이를억 제하고NK cell
의활성을중가시켰다는Humphries
둥31석 보고 와황기추출물과interferon-ot
이NK cell
의 활성을 현저히 촉 진시켰다는Jing
등3 2〉의보고,
황기의 항종양작용에 대한Sun
니 톨 | 부
■ 우
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」
Fig. 3 - Effects of the butanol fraction of Astragali Radix on the delayed-type hypersensitivity reaction in mice. Abbrevia
tions: butanol fraction of Astragali Radix, BFAR. DTH reaction was determined by footpad swelling test. Footpad swelling is shown as the difference between the thickness of the footpads challenged with SRBC and saline, respectively. Other legends and methods are the same as described in Table l. Each column represents the mean
土SE of results obtained from 6 to 7 mice. Asterisks denote a significant difference compared with the values in normal mice not fed BFAR (*p<0.05).
. 6
Fig. 5
4
125
BFAR (mg/kg/day)
Fig. 4 - Effects of the butanol fraction of Astragali Radix on the phagocytic activity in mice. Abbreviations: butanol fraction of Astragali Radix, BFAR. Corrected phagocytic index is a constant obtained from a formula relating the cube root K to the ratio of liver and spleen weight to body weight.
Other legends and methods are the same as described in Table 1. Each column represents the mean
土SE of results obtained from 6 to 7 mice. Asterisk denotes a significant difference compared with the values in normal mice not fed BFAR (**p<0.01).
BFAR (mg/kg/day)
- Effects of the butanol fraction of Astragali Radix on the natural killer cell activity in mice. Abbreviations: butanol fraction of Astragali Radix, BFAR. The percentage lysis was determined by a standard 4 h 51Cr release assay and effector to target ratio was 100:1. Other legends and methods are the same as described in Table 1. Each column represents the mean
士SE of results obtained from 6 to 7 mice. Asterisks denote a significant difference compared with the values in normal mice not fed* BFAR (*p<0.05; **p<0.01).
1 0 0 0 0
-j — —
9000- **
■ * *★
E 8000-
星 7 0 0 0
- ,,*• • / i f
용 隱
. _
5 4000- : 시 / / O 3000- / ^
0 5 25 125
BFAR (mg/kg/day)
Fig. 6 - Effects of the butanol fraction of Astragali Radix on the number of circulating leukocyte in mice. Abbreviations:
butanol fraction of Astragali Radix, BFAR. Blood samples for measuring leukocyte in mice were collected from the retro-orbital plexus immediately before assay. Other legends and methods are the same as described in Table 1. Each column represents the mean
土SE of results obtained from 6 to 7 mice. Asterisks denote a significant difference com
pared with the values in normal mice not fed BFAR (*p<
0.05; **p<0.01).
56 김정훈 ■ 문연자 • 이성원 . 이승연 ■ 박정숙 • 우원홍
등3 3
3
과Chu
둥34〉의보고가 있으며，또한 황기가in wYro
에서recombinant interleukin
- 2에 의한lymphokine-activated killer cell
의항암효과를 강화시켰다는Wang
등35>의보고로미루어 볼 때,
황기부탄을 분획물이T cell
또는macrophage
활성을 촉진함으로써NK cell
의활성을중가시킨 것으로사료된다.
특히황기 부틴올 분획물에 의한
NK cell
의활성 증가는함종양작용에 대해 다양한 효과가 기대가 되지만
,
이에 대한 정확한 기전을 규명하기 위해서는 더 많은 연구가 진행되어야 할것 으로^
ᅵ•
료된다.
말초순환백혈구수에미치는영향ᅳ 말초순환백혈구수는정상대 조군에 비해황기의 부틴올분획물
5, 25
및125 mg/kg
투여군모두에서 유의성 있는증가를보였다
(Fig.
6).
이는이상의 세포성면역빈응의결과등과종합해볼 때，황기의부탄올분획물이 임파구활성에영향을미쳐 백혈구의생산을촉진하여 백혈구수 가중가한것으로시
•
료된다.
따라서 황기부탄올분획물은감염성 질환이나면역기능의이 상으로 인한질환의 치료에활용할수있을것으로사료된다
.
감사의 말씀
본연구는
BK 21
사업의 연구비 지원으로수행되었으며,
이에감사드립니다
.
결 론
황기 부탄올분획물
(5~125 mg/kg,
경구투여)이 생쥐의 세포성 및비특이적 면역반응에 미치는영향에 관하여실험한결과 는다음과같다
.
1
.
황기부탄올분획물투여군은정상대조군에 비해흉선의중 량비를유의성 있게증가시켰으나,
체중중가율에는영향을주지 않았다.
2
.
황기부탄올분획물투여군은정상대조군에 비해 세포성면역과관계되는
SRBC
에대한지연형과민반응올의의 있게중가시켰다
.
3.
황기 부틴올분획물투여군은정상대조군에 비해 비특이적 면역과 관계되는대식세포의 활성，자연살해세포의 활성 및백 혈구수를용량의존적으로현저히 항진시켰다.
이상의 결과로보아
,
황기부탄올분획물은체액성 면역기능 을증가시키는농도에서 세포성 및비특이적 면역을용량의존 적으로중가시켰다.
문 헌
1) Sun, T, Chang, Y. H. and Uy, G. Q. : Effect of Fu-Zheng therapy
in the management of diseases. Chin. Med. J. 61, 97 (1981).
2) Tu, G. S. : Pharmacopoeia of the People's Republic of China, p.
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