녹차 폴리페놀에 노출된 Imipenem 내성 Pseudomonas aeruginosa의 항균효과 및 세포반응
송유진·조윤석·오계헌*
순천향대학교 생명공학과
Antibacterial Effects and Cellular Responses of Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa Exposed to Green Tea Polyphenols. Song, You-Jin, Yun-Seok Cho, and Kye-Heon Oh*. Department of Biotechnol- ogy, Soonchunhyang University, Asan 336-745, Korea − The aim of this work was to investigate the synergi- cally bactericidal effects and cellular responses of tea polyphenols (TPP) and imipenem on imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. Imipenem-resistant Ps. aeruginosa was isolated from patient in hospital. The bac- tericidal effects of TPP and imipenem were evaluated on the basis of its minimum inhibitory concentrations (MIC). The combined use of TPP and imipenem resulted in 16-fold and 8-fold reductions in the MICs of imi- penem for the imipenem-susceptible and imipenem-resistant Ps. aeruginosa, respectively. The bactericidal effects of the imipenem and TPP against the Ps. aeruginosa was evaluated using the time-kill assay. The syn- ergetic effects of the combinations of TPP and imipenem against Ps. aeruginosa were confirmed. Western blot using anti-DnaK and anti-GroEL monoclonal antibodies was performed to investigate the expression of stress shock proteins (SSPs) in imipenem-susceptible and imipenem-resistant strains exposed to TPP. The amount of SSPs were induced as the exposure time increased and decreased. The molecular weights of DnaK and GroEL were 70 kDa and 60 kDa, respectively. SDS-PAGE with silver staining revealed that the amount of lipopolysaccharides (LPS) increased or decreased in the strain treated to different concentrations and exposing periods of TPP. Scanning electron microscopic analysis demonstrated the presence of umblicated and wrin- kled surfaces for cells treated with TPP or imipenem.
Key words: Green tea polyphenols, imipenem, Pseudomonas aeruginosa, synergic effect
서 론
베타락탐(β-lactam)계 항생제는 일반적으로 잘 알려진 항 생제로서 페니실린(penicillin)계와 세팔로스포린(cephalos- porin)계로 구성되어 있다. 기존에 사용되고 있는 페니실린 계 항생제의 내성이 출현함에 따라 새로운 베타락탐계열의 항생제인 카바페넴 항생제가 개발되었다. 카바페넴(carba- penem)은 Streptomyces cattleya에서 생산되는 thienamycin 의 유도체이며, 베타락탐 항생제와 같이 세균의 세포벽 성 분인 펩티도글리칸(peptidoglycan) 합성을 억제하는 기능을 한다. 카바페넴 계열의 항생제인 imipenem, meropenem, faropenem, doripenem 등은 페니실린계나 세팔로스포린계와 는 달리 약효가 광범위하고, 친화력이 우수하여 항생제 내 성 세균의 감염치료에 유일하게 사용되어 왔으며, 다른 항 생제에 내성을 가진 균주에도 탁월한 치료효과를 보여 관 심이 집중되고 있다. 특히 imipenem은 그람양성과 그람음
성 세균 모두에 강력한 살균력을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 imipenem 항생제에 내성으로 특히 문제가 되 는 세균 종은 Pseudomonas aeruginosa와 Acinetobacter baumannii이다[10, 21].
Ps. aeruginosa는 호기성 그람음성의 주요 병원내 감염 세 균으로서 주로 인공호흡기를 사용하는 호흡기계 감염, 화상 감염, 낭포성 섬유증 환자의 폐렴, 요로 감염 등을 유발하는 원인균이며, 여러 종류의 항생제에 대해 내성을 가지므로 세 균 감염증의 치료가 매우 어려운 것으로 알려져 있다[13].
항생제 내성균의 출현 빈도는 전 세계적으로 증가하는 양상 을 보이고 있으며, 내성균에 의한 병원내 감염은 현재 심각 한 문제로 대두되고 있다. 이러한 양상은 부적절한 항생제 의 사용과 항생제의 오남용이 그 원인이며, 항생제의 부작 용을 해결하기 위한 대책으로 항생제 간 또는 항생제와 천 연물질의 병용효과에 대한 관심이 늘고 있다. 천연물과 항 생제와의 병용 투여는 항생제 내성균주의 발현 빈도를 현저 히 감소시킬 수 있을 뿐 아니라 투여량을 줄일 수 있으므로 독성을 감소시킬 수 있다[20].
Ps. aeruginosa와 같은 그람음성 세균은 특징적인 외막 (outer membrane)을 가지며, 외막은 lipopolysaccharide
*Corresponding author
Tel: 82-41-530-1353, Fax: 82-41-530-1350 E-mail: [email protected]
(LPS)의 외층과 인지질(phospholipid)로 구성된 내층의 이중 층으로 되어 있다. 외막에 존재하는 LPS는 내독소(endoto- xin)라고도 불리며, 체내에 과량이 존재할 경우 발열, 구토, 고지혈증, 저혈압, 빈맥, 설사 등을 유발한다[1]. LPS는 O- 항원(O-antigen), 핵심다당류(core polysaccharide), 지질 A (lipid A)의 3부분으로 구성되어 있으며, 서로 결합된 복합체 형태로 존재하며, 세포막의 음전하를 증가시킴으로써 외막 의 안정화를 돕고, 담즙, 소화 효소 및 항생제와 같은 외부 유해 물질들의 유입을 막아 세포를 보호하는 장벽 역할을 하 며, 세균의 표면에 위치하므로 숙주와의 상호작용을 매개하 고 숙주세포의 방어기작을 회피시키는 기능을 한다[19].
천연물질인 차 폴리페놀(tea polyphenols, TPP)은 여러 가 지 카테킨(catechin)을 포함하며, TPP에 포함된 카테킨은 epigallocatechin gallate(EGCG), epigallocatechin(EGC), epi- catechin gallate(ECG), epicatechin(EC), gallocatechin gallate (GCG) 등으로 항산화 효과, 노화 방지, 혈중 콜레스테롤 억 제, 혈압상승 억제, 혈소판 응집 억제, 충치 예방, 항암 효과, 항균 효과 등의 다양한 효과가 있는 것으로 알려져 있다[2].
본 연구실에서는 녹차 폴리페놀이 항생제 내성세균인 methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)에 대해 우 수한 항균효과를 나타내는 것을 확인하였으며, MRSA 균주에 대해 MIC 농도보다 낮은 농도의 oxacillin과 녹차 폴리페놀을 혼합하여 투여했을 때, 항균효과가 높게 나타났음을 확인하였 다[5]. 또한, nalidixic acid 항생제에 내성을 지닌 Salmonella typhimurium에 녹차 폴리페놀을 단독으로 처리하였을 때와 nalidixic acid와 녹차 폴리페놀을 병용처리 하였을 때의 항균 효과를 비교하여 살균 상승효과를 확인한 바 있다[12].
본 연구에서는 녹차추출물인 TPP를 이용하여 imipenem 내 성 Ps. aeruginosa에 대한 항균효과를 확인하고, imipenem과 TPP를 병용처리 하였을 때의 항균효과를 비교하였으며, TPP 에 의해 유도되는 스트레스 단백질인 DnaK와 GroEL의 유 도를 SDS-PAGE와 Western blot을 통하여 조사하였다. 또 한, 그람음성 세균이 가지는 외막의 주성분인 LPS의 양적인 변화를 관찰하기 위하여 TPP에 노출시킨 세균의 LPS를 추 출하여 SDS-PAGE와 은 염색(silver stain)을 통하여 관찰하 였으며, 세균이 TPP 또는 imipenem에 노출되었을 때 일어 나는 세포의 외부 형태 변화를 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다.
재료 및 방법 균주의 확보와 배양조건
본 연구에서 사용된 imipenem 내성 Ps. aeruginosa 균주 는 국내 종합병원 중환자실의 환자로부터 분리하였다.
Imipenem 내성 Ps. aeruginosa는 Mueller-Hinton 액체배지 (Difco, USA)에 접종하였고, 감수성 검사의 표준 균주로 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입한 Ps.
aeruginosa ATCC 27853을 사용하였다. 이 균주들은 Mueller- Hinton 액체배지에 각각 접종한 후, 분당 160회로 회전하는 37oC 진탕배양기에서 배양 유지시키면서 실험에 사용하였다.
TPP와 imipenem의 최소억제농도(MIC) 측정
TPP와 imipenem의 감수성 시험은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)에서 권장하는 방법에 따라 한천희석법으로 시행하였다[6]. 대상 균주를 Mueller-Hinton 고체 평판배지에 18~24시간 동안 배양한 후, 생장한 세균집 락을 0.5 McFarland의 혼탁도로 세균현탁액을 만들었다.
Imipenem 단독으로 4~512 µg/mL의 농도와 TPP 250~
1,500 µg/mL의 농도를 imipenem과 병용한 Mueller-Hinton 고체 평판배지를 준비하고, 0.5 McFarland의 세균현탁액을 10배로 희석한 후, 2 µL를 취하여 생장 대조군부터 시작하 여 저농도, 고농도의 배지 순으로 접종하였다. 이것을 37oC 에서 24시간 배양한 후 세균의 생장을 관찰하였다. 상기과 정을 3회 반복하여 최소억제농도(MIC)를 확인하였다.
TPP와 imipenem에 대한 균주의 time-kill 조사
세균에 대한 TPP와 imipenem의 살균 상승작용을 조사하 기 위하여 time-kill 조사를 실시하였다. 세균을 Mueller- Hinton 액체배지에 배양시킨 후, 대수생장기를 거치면서 파 장 660 nm에서 혼탁도가 1.0일 때, 원심분리용 튜브에 넣고 4,000×g로 4oC에서 10분간 원심분리하였다. 얻어진 균체는 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 3회 세척하였다.
Mueller-Hinton 액체배지에 각각 TPP와 imipenem을 단독 으로 넣고, 다양한 농도로 희석하여 준비하였다. 최종 균 농 도가 106~107 CFU/mL가 되도록 균체를 접종한 후, 3시간 간격으로 고체배지에 100 µL씩 평판 도말하여 37oC에서 배 양한 후 형성된 집락을 계수하였다. 또한, 위와 동일한 방법 으로 TPP와 imipenem을 혼합하여 넣고, 3시간 간격으로 관 찰하였다. TPP와 imipenem을 병용 사용하였을 때의 상승효 과는 time-kill 조사에서 단독 투여 항균제 중 효과적인 항생 제와 비교하여 병용투여 시 집락수가 2 log CFU/mL 이상 감소한 경우로 판단하였다.
TPP에 대한 세균의 스트레스 충격반응 및 단백질 획득 TPP에 의한 세균의 스트레스 충격 실험을 위하여 imipenem 감수성 균주와 내성 균주 배양액을 각각 4,000×g 로 4oC에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 얻어진 균 체를 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 3회 세척 하였고, 세척 후 다시 원심분리하여 얻어진 균체를 각각 2,000 µg/mL 농도의 TPP에 동일한 양을 접종하여 현탁하 였다. 분당 160회로 회전하는 37oC 배양기에서 배양하면서 3시간 간격으로 18시간 동안 시료를 채취하였다. 시료를 각 각 4,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 균체를 PBS로 3 회 세척하였고, 10 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 균체를
현탁하여 4oC상에서 초음파 분쇄기(Model M-300, fischer Scientific, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 5 W에서 30초 씩 10회 반복하면서 세포를 파쇄하였다. 세포를 파쇄한 후 4oC를 유지하면서 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 단 백질을 추출하였다[7].
스트레스 충격단백질 발현 분석
추출한 단백질은 Bollag 등[3]의 방법에 따라 SDS-PAGE 를 실시하였다. Separating gel은 12%의 gel을 사용하였으며, stacking gel은 5%의 gel을 사용하였다. 전기영동 후 gel은 gel-staining solution(0.1% Coomassie brilliant blue R-250, 45% 메탄올, 10% 아세트산)으로 2시간 동안 염색하였고, gel-destaining solution(10% 메탄올, 10% 아세트산)과 gel- destaining solution(5% 메탄올, 7% 아세트산)으로 탈색하였 다. TPP를 세균에 처리하였을 때 유도되는 스트레스 충격단백 질(stress shock proteins, SSPs)을 조사하기 위하여 Sambrook 등[15]의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다. 본 실험 에 사용한 1차 항체는 anti-DnaK와 anti-GroEL 단일항체 (StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, Canada)를 사 용하였으며, 2차 항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate (Promega, Madison, USA)를 사용하였다. 항원-항체 반응 을 검출하기 위해 West-Q chemilluminescent substrate kit (GenDEPOT, USA)를 사용하여 X-선 필름(AGFA, Belgium) 에 현상한 후 스트레스 충격단백질의 발현을 분석하였다.
TPP에 노출된 세균의 LPS 추출
TPP의 농도와 노출시간에 따른 세균의 LPS 변화를 관찰 하기 위하여 TPP를 농도별(0, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500 µg/mL)로 세균에 12시간 동안 노출시킨 후, 13,000 rpm에 서 1분간 원심분리하여 농도별로 균체를 얻었다. 그리고 2,000 µg/mL의 동일한 농도의 TPP를 처리하고 노출시간의 변화를 주어 최대 18시간까지 노출시킨 균체를 얻었다. 얻 어진 모든 균체를 PBS로 각각 3회 세척하여 준비하고, phenol-water 추출법에 근거한 LPS extraction kit (Intron, Korea)를 사용하였다. Lysis buffer를 넣어 완전히 현탁시킨 후, chloroform을 첨가하여 현탁시키고 실온에서 5분간 방 치하였다. 10분간 원심분리하여 상등액을 새로운 튜브에 옮 기고, 정제 완충용액(purification buffer)을 넣고 혼합한 후, -20oC에서 10분간 반응시키고, 4oC에서 15분간 원심분리 하 였으며 균체를 70% 에탄올로 세척하고 완전히 건조시켰다.
균체에 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)를 넣고, 2분간 가 열하여 LPS를 추출하였다. 추출한 LPS는 단백질 정량법을 통해 순도를 측정하였다.
LPS 변화 관찰
LPS의 양적인 변화를 Hitchcock 등[8]의 방법에 따라 SDS-PAGE와 은 염색 방법을 통하여 확인하였다. Separating
gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 5% acrylamide gel을 사용하였으며, 전기영동 후 gel은 은 염색하였다. 고정용액(10% 아세트산, 40% 에탄올)에 1시간 동안 고정시키고, 감광용액(30% 에탄올, 6.8% sodium acetate, 0.02% sodium thiosulfate)에 30분 동안 gel을 반응 시킨 후 증류수로 5분간 3회 세척하였다. 세척 후 gel을 은 염색 용액(0.25% silver nitrate, 0.04% formaldehyde)에 30 분간 반응시키고, 증류수로 1분씩 2회 세척하였다. 현상용액 (2.5% sodium carbonate, 0.04% formaldehyde)에서 band 가 뚜렷하게 나타날 때까지 반응시키고, 정지용액(1.46%
EDTA)을 넣어 반응을 정지시킨 후 증류수로 세척하여 세균 의 LPS 변화를 관찰하였다.
주사전자현미경을 이용한 세포 외부 형태 관찰
TPP와 imipenem에 노출된 세균의 세포 외부 형태의 변화 를 알아보기 위하여 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다.
Imipenem 내성 균주 배양액을 원심분리하여 얻어진 균체를 각각 2,000 µg/mL 농도의 TPP, 64 µg/mL 농도의 imipenem, 500 µg/mL 농도의 TPP와 4 µg/mL 농도의 imipenem 혼합 액에 접종하여, 37oC에서 12시간 동안 노출시켰다. 원심분 리하여 균체를 회수하고, PBS로 3회 세척하였다. 1%
osmium tetroxide를 균체가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 1 시간 동안 고정하였다. 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 50~95%의 에탄올을 준비하여 저농도에서 점차 농도를 높여가면서 10분씩 연속적으로 탈수시켰다.
100%의 에탄올에서 30분씩 2회 최종 탈수하고, 100%
hexamethyl disilazane에 20분간 2회 반응시켜 공기 중에서 건조하였으며, sputter coater(IB-3, Giko Engineering Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 2 mA로 3분간 gold coating한 후 주사현미경(LEO 1455VP, ZEISS, Germany)으로 관찰하였 다[4].
결과 및 고찰 TPP와 imipenem의 최소억제농도(MIC) 측정
TPP와 imipenem의 농도에 따른 imipenem 감수성과 내성 균주의 최소억제농도를 알아보기 위해, 다양한 농도의 화합 물로 최소억제농도를 측정한 결과, imipenem 감수성과 내성 균주는 1,500 µg/mL의 TPP 농도에서 최소억제농도가 측정 되었으며, imipenem의 최소억제농도 실험 결과, imipenem 감수성 균주는 2 µg/mL, imipenem 내성 균주는 32 µg/mL 의 imipenem 농도에서 측정되었다. 또한 TPP와 imipenem 을 병용하여 imipenem 감수성과 내성 균주의 최소억제농도 를 측정한 결과, imipenem 감수성 균주는 500 µg/mL의 TPP와 0.125 µg/mL의 imipenem에서, imipenem 내성 균주 는 500 µg/mL의 TPP와 4 µg/mL의 imipenem에서 최소억 제농도가 측정되었다. TPP와 imipenem을 병용하여 최소억
제농도를 측정한 결과, imipenem 감수성과 내성 균주는 TPP 500 µg/mL일 때, imipenem 농도는 각각 16배, 8배가 감소 되어 병용효과가 매우 높은 것을 확인하였다(Table 1).
TPP와 imipenem에 대한 균주의 time-kill 조사
Imipenem 감수성 균주와 내성 균주는 각각 1,500 µg/mL
의 TPP 농도에서 생존율이 점차적으로 감소하였으며, 감수 성 균주는 18시간 이후에 집락이 관찰되지 않았으나, 내성 균주에서는 약간의 집락이 관찰되었다(Fig. 1). Imipenem에 노출시켰을 때, imipenem 감수성 균주는 8 µg/mL의 농도에 서 점차적으로 감소하여 12시간 이후에는 집락이 형성되지 않았으나, 동일한 농도에서 내성인 균주는 18시간이 지난 후 에도 완전히 살균되지 않았다(Fig. 2). 또한, TPP와 imipenem 을 병용하였을 경우, imipenem 감수성 균주는 TPP 2,000 µg/mL와 imipenem 2 µg/mL의 농도에서 생존율이 점차적 으로 감소하여 9시간 이후에는 모든 세균이 완전히 사멸되 었으며, 내성 균주는 TPP 1,500 µg/mL와 imipenem 16 µg/mL의 농도에서 점차적으로 감소하여 12시간 이후에 완 전히 사멸되었다(Fig 3). 이를 통해 동일한 imipenem 농도 의 항생제를 처리하였을 경우라 할지라도, 노출시킨 TPP의 농도가 증가함에 따라 더 효과적인 항균효과를 나타내는 것 Table 1. MIC values of TPP and imipenem against 2 strains of
Pseudomonas aeruginosa.
Strains
MIC (µg/mL)
TPP Imipenem Combination TPP Imipenem Imipenem-susceptible
Ps. aeruginosa 1,500 2 500 0.125
Imipenem-resistant
Ps. aeruginosa 1,500 32 500 4
Fig. 1. Time-kill curves for imipenem-susceptible (A) and imipenem-resistant (B) Ps. aeruginosa after TPP shock. The cells were maintained at TPP concentrations of 0 µg/mL (△/▲), 1,000 µg/mL (○/●), 1,500 µg/mL (□/■), 2,000 µg/mL (◇/◆), 2,500 µg/mL (▽/▼).
Fig. 2. Time-kill curves for imipenem-susceptible (A) and imipenem-resistant (B) Ps. aeruginosa after imipenem shock. The cells were maintained at imipenem concentrations of 0 µg/mL (△/▲), 1 µg/mL (○), 2 µg/mL (□), 4 µg/mL (◇), 8 µg/mL (▽/▼), 16 µg/mL (◆), 32 µg/mL (■), 64 µg/mL (●).
으로 확인되었으며, TPP의 농도가 증가하고 imipenem의 농 도는 낮아져도 동일한 항균효과를 나타내었다.
TPP에 대한 세균의 단백질 변화 및 스트레스 충격 단백질 조사
Imipenem 감수성 균주와 내성 균주를 2,000 µg/mL 농도 의 TPP에 각각 노출시켰을 때 나타나는 총 단백질 변화를 SDS-PAGE로 관찰하였으며, TPP에 의해 유도되는 스트레스 충격단백질(SSPs)인 DnaK와 GroEL의 발현 정도를 알아보 기 위하여 Western blot을 통하여 조사하였다. Imipenem 감 수성과 내성 균주 모두 TPP에 노출시켰을 때 SDS-PAGE한 gel에서 여러 종류의 단백질이 증가하거나 감소하는 변화가 관찰되었다(Fig. 4A, 5A). 동일한 단백질을 anti-DnaK와
anti-GroEL 단일항체에 특이적으로 반응하는 스트레스 충격 단백질 발현양의 변화를 관찰한 결과, imipenem 감수성 균 주에서 DnaK의 발현은 TPP 노출 3시간 후에는 발현양이 증가하다가, 노출 6시간부터는 발현양이 급격히 감소하였으 며, 15시간 이후부터는 발현되지 않았다(Fig. 4B). GroEL은 노출 3시간 이후부터 발현양이 급격히 증가하다가 점차 감 소하였으며, 12시간 이후에는 발현되지 않는 것을 확인하였 다(Fig. 4C). 또한, 내성 균주의 DnaK의 발현은 노출 3시간 부터 발현되는 양이 점차 증가하였고, 6시간 이후에 점차 감 소하다가 18시간이 경과한 후에는 DnaK의 발현이 관찰되지 않았으며(Fig 5B), GroEL의 경우, 3시간 이후부터 유도발현 양이 증가하여 9시간까지 유지하다가 노출 12시간 때부터 감소되어 18시간 이후 발현이 나타나지 않는 것을 확인하였 Fig. 3. Time-kill curves for imipenem-susceptible (A) and imipenem-resistant (B) Ps. aeruginosa after TPP and imipenem shock.
The cells were maintained at imipenem concentrations of 0 µg/mL (△/▲), TPP 500 µg/mL + imipenem 0.5 µg/mL (○), TPP 1,000 µg/mL + imipenem 1 µg/mL (□), TPP 2,000 µg/mL + imipenem 2 µg/mL (◇), TPP 500 µg/mL + imipenem 4 µg/mL (●), TPP 1,000 µg/mL + imipenem 8 µg/mL (■), TPP 1,500 µg/mL + imipenem 16 µg/mL (◆), respectively.
Fig. 4. Induction of stress shock proteins in imipenem-susceptible Ps. aeruginosa treated with 2,000 µg/mL TPP for different times.
The SSPs were analyzed by SDS-PAGE (A), and western blot with anti-DnaK (B), and anti-GroEL (C) monoclonal antibodies, respec- tively.
다(Fig. 5C). TPP에 의한 스트레스 충격 실험 결과, 약 70 kDa의 DnaK와 60 kDa의 GroEL이 관찰되었으며, TPP에 노출된 시간이 증가할수록 DnaK와 GroEL의 발현양이 증가 하다가 감소하였으며, 일정시간이 경과하면서 유도되는 양 이 점차 사라지는 것으로 나타났다. 일반적으로 DnaK와 GroEL은 열충격 이외에 다른 스트레스 요인들에 의해서도 생성되는 것으로 알려져 있다. Mogens 등[14]은 43oC의 온 도와 2.5%의 NaCl이 존재하는 배양조건에서 생장한 Lactococcus lactis에서 DnaK와 GroEL이 유도되는 것을 확 인하였으며, Song 등[18]은 천연물질인 장미추출물에 노출 된 Salmonella enteritidis가 스트레스 단백질인 DnaK와
GroEL을 유도한다는 결과를 발표한 바 있다. 따라서 imipenem 감수성과 내성 균주에서 TPP에 의해 발현되는 DnaK와 GroEL과 같은 스트레스 충격 단백질은 여러 가지 물리화학적 충격에 의해 발현되는 단백질과 동일한 것으로 확인되었다.
TPP에 대한 세균의 LPS 변화 관찰
세균에 다양한 농도의 TPP를 노출시켜 시간 경과에 따른 LPS의 양적인 변화를 SDS-PAGE와 은 염색을 통하여 조사 하였다. 추출한 LPS가 순수하게 LPS만을 함유하고 있는지 여부를 확인하기 위하여 Bradford 방법으로 LPS에 함유된 Fig. 5. Induction of stress shock proteins in imipenem-resistant Ps. aeruginosa treated with 2,000 µg/mL TPP for different times.
The SSPs were analyzed by SDS-PAGE (A), and western blot with anti-DnaK (B), and anti-GroEL (C) monoclonal antibodies, respec- tively.
Fig. 6. Silver stained SDS-PAGE gel profiles of LPS extracted from imipenem-susceptible Ps. aeruginosa, (A) cells treated with dif- ferent concentration of TPP for 12 hrs, (B) cells treated with 2,000 µg/mL TPP for different exposure time.
단백질을 정량한 결과, 모두 0.3 µg/mL 이하로 극히 적은 양이 존재하였으므로 추출된 LPS가 비교적 순수한 상태임 을 확인하였다. Imipenem 감수성 균주에 TPP를 다양한 농 도로 노출시켰을 때, 농도가 증가함에 따라 LPS의 양은 감 소하였으며, 고농도인 2,500 µg/mL의 TPP에 노출되었을 때, 55 kDa 이하의 band가 완전히 사라지는 것이 관찰되었다 (Fig. 6A). 그리고 2,000 µg/mL의 동일한 농도의 TPP에 노 출시켰을 때의 LPS의 변화는 노출시간이 증가함에 따라 LPS 의 양이 점차 감소하여 18시간 이후에는 완전히 사라지는 것이 확인되었다(Fig. 6B). 또한, imipenem 내성 균주에 다 양한 농도의 TPP를 노출시켰을 때, 1,000 µg/mL의 농도에 서부터 LPS band가 급격히 감소하는 것을 확인하였으며 (Fig. 7A), 노출 시간에 따른 LPS의 변화를 관찰한 결과, 시 간이 증가함에 따라 LPS의 양이 급격하게 감소하여 9시간 이후에는 LPS의 band가 거의 나타나지 않는 것이 관찰되었 다(Fig. 7B). 앞서 실험한 세균의 time-kill 조사 결과, 2,000 µg/mL의 TPP에 노출시켰을 때, imipenem 감수성 균주는 15시간 만에 사멸하였으며, 내성 균주는 같은 농도에서 18 시간 만에 세균이 완전히 사멸되는 것을 확인하였는데, 이 와 동일한 조건에서 대부분의 LPS가 제거되는 것을 확인하 였다. 이 결과에 근거하여 볼 때, Ps. aeruginosa는 TPP에 의하여 세포 외막에 내재하는 LPS가 감소되며, 이러한 작용 이 살균에 기여하는 것으로 판단된다. Ikigai 등[9]은 녹차추 출물에 있는 카테킨 성분이 지질 이중층에 손상을 주어 세 균의 생존에 영향을 미친다는 결과를 발표한 바 있으며, Shimamura 등[17]은 카테킨의 주성분인 EGCG가 직접적으 로 펩티도글리칸에 결합하여 세포벽을 손상시키고, 세포벽 의 생합성을 방해한다고 보고하였다. 이들 연구에 근거하여
본 연구 결과를 분석하였을 때, Ps. aeruginosa가 TPP에 노 출되었을 때 세포 외막의 LPS가 파괴되어 외부 유해 물질 의 침입을 막는 역할을 제대로 수행하지 못하게 되므로 세 포가 손상되고 결국 사멸되는 것이라 사료된다.
주사전자현미경을 이용한 TPP 노출 세균의 외부형태 관찰 Imipenem 내성 Ps. aeruginosa의 time-kill 조사 결과에 따른 치사 농도의 TPP와 imipenem을 각각 단독으로 처리하 였을 경우와 치사 농도의 TPP와 imipenem을 병용처리 하였 을 때, 세균의 외부 형태 변화를 주사전자현미경을 이용하여 각각 관찰하였다. 정상적인 세포의 표면은 매끄러운 간균 형 태이지만, 2,000 µg/mL의 TPP와 64 µg/mL의 imipenem을 각각 단독 투여하였을 때의 세포는 구멍이 생기거나 움푹 패 이고, 주름진 표면을 가지는 것으로 관찰되었으며, 500 µg/
mL의 TPP와 4 µg/mL의 imipenem을 병용처리한 결과, TPP와 imipenem을 단독으로 투여하였을 때 보다 세포의 표 면이 더 많이 손상되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 8). 이와 관련된 다른 연구 결과들에 의하면, Park 등[15]은 방향족 화합물, 에탄올, 열에 노출된 Pseudomonas sp.에서 세포 표 면이 주름지고, 불규칙한 형태 변화를 보고하였으며, Koyama 등[11]은 편백나무 정유를 처리한 MRSA, E. coli, Candida albicans 등에서 세포가 부풀어 오르고, 세포벽이 파괴되는 것을 관찰한 바 있다. 이러한 각종 화합물이나 천연물질이 세포의 표면에 심각한 변화를 초래하여 세균이 사멸하는데 직접적인 영향을 미치는 것이라고 판단된다. 본 연구를 통해 서 TPP에 의해 imipenem에 내성을 가지는 Ps. aeruginosa를 살균할 수 있었으며, TPP가 기존의 항생제와의 병용으로 뛰 어난 살균 상승효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 천 Fig. 7. Silver stained SDS-PAGE gel profiles of LPS extracted from imipenem-resistant Ps. aeruginosa, (A) cells treated with differ- ent concentration of TPP for 12 hrs, (B) cells treated with 2,000 µg/mL TPP for different exposure time.
연살균제인 TPP가 합성화합물보다 비교적 독성이 적다는 점 에서 활용 가능성이 크며, TPP와 항생제의 병용 사용이 살 균의 상승효과를 가져올 수 있으므로 항생제의 사용을 줄일 수 있어 내성균에 대한 문제 해결에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
요 약
본 연구는 항생제인 imipenem에 내성이 있는 Pseudomonas aeruginosa에 대한 차 폴리페놀(TPP)과 imipenem의 살균 상 승효과와 세포반응을 조사하기 위하여 수행되었다. Imipenem 내성 Ps. aeruginosa는 병원의 환자로부터 분리하였다. TPP 와 imipenem을 단독으로 처리하였을 때와 병용으로 처리하 였을 때의 최소억제농도(MIC)를 측정한 결과, imipenem 감 수성과 내성 균주는 TPP와 imipenem을 병용처리 하였을 때, imipenem 농도가 각각 16배, 8배가 감소되는 것을 확인하였 다. 또한, time-kill 조사를 통해 TPP와 imipenem의 항균효 과를 조사하였으며, 병용처리 하였을 때 낮은 농도의 imipenem에서도 동일한 항균효과를 나타내는 것을 확인하 였다. TPP에 의한 imipenem 감수성과 내성 균주의 스트레 스 충격 단백질 발현을 조사하기 위하여 anti-DnaK와 anti- GroEL 단일항체를 이용한 Western blot을 통해 관찰하였다.
스트레스 충격 단백질인 DnaK와 GroEL은 TPP의 노출시간 이 증가함에 따라 발현양이 증가하다가 감소하는 것을 확인 하였으며, 유도된 DnaK와 GroEL의 분자량은 각각 70 kDa 과 60 kDa으로 나타났다. TPP의 농도와 시간에 따른 세균
의 LPS 증감 변화를 SDS-PAGE와 은 염색을 통하여 확인 하였고, TPP와 imipenem에 노출된 세균의 세포 외부 형태 변화를 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 결과, 움푹 패이 고, 주름진 표면을 가지는 것으로 관찰되었다.
R
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Ps. aeruginosa (A) untreated cells, (B) cells treated with 2,000 µg/mL TPP, (C) cells treated with 64 µg/mL imipenem, and (D) cells treated with 500 µg/mL TPP + 4 µg/mL imipenem for 12 hrs.
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(Received April 27, 2010/Accepted June 7, 2010)
