[특별기획] 생체 물질-당의 중요성 및 응용

특 별 기 획

생체 물질-당의 중요성 및 응용

차형준 POSTECH 화학공학과 교수 해양수산부 해양바이오산업신소재연구단 단장 [email protected]

1. 머리말

2003년 휴먼 지놈이 완벽하게 해독되었으나 생명 현상을 설명하기엔 단백질을 코딩하는 유전자의 수 가 너무 적다는 것이 밝혀짐에 따라 휴먼 지놈 해석

이후의 생명현상을 이해하기 위한 ‘포스트지놈’의 연 구로 당생물학(glycobiology)이 중요한 이슈로 부각 되고 있다. Post translational modification 중의 하나인 glycosylation은 세포내에서 단백질, 지질, 세포 표면

생체물질 중 현재까지 DNA 및 단백질의 중요성은 많이 언급이 되어왔고, 이와 관련된 연구분야들이 genomics, proteomics로 불리면서 다양하게 연구가 진행되어왔다. 하지만, 다른 중요한 생체물질인 당 (glycan) 또는 탄수화물(carbohydrate)은 그 중요성이 상대적으로 덜 부각되었다. 실질적으로 당은 포도당 (glucose) 및 글루코겐(glycogen)의 형태로 생체의 가장 중요한 에너지원으로 사용될 뿐 아니라 렉틴(lectin) 과의 상호작용을 통하여 면역반응에 중추적인 역할을 하는 생체물질이고, 세포벽을 구성하는 데 있어서 필 수적인 요소이다. 또한, 세포벽의 구성성분으로 존재하면서 다른 세포나 단백질 등과 상호작용을 하는 역할 을 하고 있다. 이러한 다양한 형태로의 당에 관한 연구는 glycomics라 불리며 당단백질(glycoprotein), 당지질 (glycolipid) 등과 같이 다른 물질에 결합(conjugation)이 된 형태로 많이 존재를 하게 된다. 최근에 많이 연구 가 되고 이슈가 되고 있는 바이오시밀러(biosimilar)도 인간 유래 당단백질을 의약품으로 사용을 하는 것이다.

이에 당의 기본적인 작용 및 생체 내에서의 기작에 대한 이해 뿐만 아니라 glycan-conjugation, glycosylation pattern 등 당과 관련된 연구는 무궁무진 할 뿐 아니라, 이를 통해서 의약품, 바이오센서 등 활용범위 또한 광 범위하다고 할 수 있다. 본 특별기획에서는 당을 이용한 최근의 연구동향 및 당과 관련된 연구에 관하여 간략 하게 소개하고자 한다. 본 특별기획을 통하여 향후 당의 중요성이 강조됨과 동시에 연구자들의 당 연구에 대 한 관심이 증대되기를 기대한다.

당사슬 특이적 결합 렉틴(Lectin) 이용 기술

김성훈

특 별 기 획 (I)

에 당사슬(glycan)의 부착 및 탈착으로 단백질의 활 성이나 세포 내의 신호 전달, 세포간의 상호 작용 등 과 같은 세포내의 생명현상에 직, 간접적으로 관여 하며 이들 중 특정 반응은 질병을 일으키는 핵심 메 커니즘으로 알려져 있다. 생명자원으로부터 다양한 저분자 및 고분자 천연물에 대한 다양한 생리활성 물질, 단백질, 천연 신약 개발의 연구가 활발히 이루 어져왔으나, 최근 다양한 질병 및 미생물, 바이러스 감염시 당사슬이 매개되는 것이 밝혀짐에 따라, 이 들 천연물 중 당성분 포함하는 당단백질(glycopro- tein), 당지질(glycolipid), 올리고당(oligosaccharide) 등 의 당사슬(glycan) 및 당복합체(glycoconjugate)와 결 합하는 렉틴(lectin) 등의 신규 소재에 대한 관심이 고 조되고 있다.

2. 특이적 당사슬 구조에 결합하는 렉틴

렉틴(Lectin)은 미생물에서 고등동물에 이르기 까지 존재하는 당사슬에 결합할 수 있는 단백질 의 하나로, 생명체에 있어 당사슬과의 특이적인 결합을 통해 protein quality control, host-pathogen interaction, cell-cell communication, inflammation, immune response, cancer progression, development등 다양한 생명현상에 관여한다고 알려져 있다. 렉틴 은 multivalent, 효소의 활성을 포함하지 않고, 항체의 성격을 포함하지 않는 단백질로, 19세기말 러시아의 Sillmark에 의해 최초로 Ricinus communis에서 분리 된 이후, 현재까지 Concanavlain A(ConA)를 비롯하 여 40여종의 렉틴이 연구 및 다양한 용도로 사용되 고 있다[1].

최근 분자생물학 및 생화학의 진보로 염기서열 및 단백질 구조에 따라 렉틴을 다양한 그룹으로 분 류하기 시작했으며, 원천(origin)에 따라 크게는 식물 (plant lectin families) 및 동물(invertebrate/vertebrate lectin families) 렉틴으로 분류하고 있으며, vertebrate lectin은 다시 그 특성에 따라 C-type (만노즈 결합 렉틴: mannose-binding lectin, MBL), S-type (galec-

tin: β-galactoside-binding lectin), P-type (mannose- 6-phosphate bindg lectin), I-type (selectin), 그리고 단백질 구조적으로 cyclic pentameric 형태를 갖는 Pentraxin 으로 분류한다[1].

고등동물에서 외래의 항원이 침입했을 때 면역 반응 시스템에 의해 외래 물질에 선택적으로 작용하 는 항체가 외부의 항원을 인지하고 면역시스템을 발 달시켜 제거하는 것과 같이, 항체 대신에 렉틴이 이 와 같은 유사한 작용을 하는 것으로 추정되고 있는 데, 특히 면역시스템(immunsystem)이 결핍된 무척추 동물(invertebrate)이나 식물, 그리고 버섯 등과 같은 생명체에 면역반응의 대체 시스템에서 잘 발달되어 있다. 비록 미생물에서 고등동물에 이르기까지 모든 종에서 다양한 렉틴이 존재하나, 무척추동물, 식물, 버섯 등에서 주로 많이 발견되기 때문에, 현재 이용 가능한 거의 대다수의 렉틴이 이러한 종에서 분리되 어왔다[1,2].

이중 식물 렉틴은 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 화 분 등 거의 식물체의 모든 부분에 존재하며 수확이 가능한 씨와 구근에서도 발견되기 때문에 용이하게 렉틴을 정제할 수 있는 장점으로 많은 정제가 식물 체를 대상으로 이루어졌다. 식물 유래의 렉틴은 면 역작용(immune function), 해충으로부터 자기방어, 알레르기를 일으켜 동물로부터 자기방어, 항곰팡이 성 작용, 항바이러스 작용, 식물 및 미생물간의 세포 간 상호작용을 통한 공생미생물의 특정부위로 colo- nization, 영양분 및 금속이온의 전달 및 저장, 냉온으 로부터 식물 조직체의 보호, 세포내 효소의 활성 증 대를 위한 파트너로써의 작용, 그리고 당단백질의 trafficking 등 다양한 기능이 알려져 있는데, 이들 모 든 작용은 당사슬과의 선택적 결합을 통한 렉틴의 작용으로 이루어진다고 보고되어 있다[1-3].

3. 렉틴 이용한 당사슬 측정 및 응용 기술 개발 동향

렉틴은 당사슬의 구조를 인지하여 결합하기 때

특 별 기 획 (I)

문에 항체와 같이 다양한 응용기술 개발에 활용될 수 있다. 당사슬과 렉틴의 상호 결합력을 이용하 여 ELISA, mutant cell selection, blood typing, histo- chemical staining, glycosyltransferase/glycosidase assay, cell sorting, glycoconjugate purification 등 다양한 당 복합체가 관련된 생체분자의 인지와 분리 정제에 활 용 가능하다(그림 1). 특히 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb)가 인지하지 못하는 N-결합 당사슬 (N-linked glycan)/O-linked glycan(O-linked glycan) 의 당사슬 구조를 측정할 수 있을 뿐 아니라 mAb에 비해 가격이 저렴하고, 비동물성 유래의 소재로 인 하여 동물윤리적 측면에서 단백질 소재의 이용에 자 유롭다고 할 수 있다[4].

특이적 당사슬 구조 결합을 하는 렉틴 특성을 이 용하여, 특정 질병 발병 시 세포 표면에 존재하는 당 단백질, 당지질, 올리고당의 변화를 다양한 렉틴을 이용하여 조기 측정하고, 질병을 일으키는 핵심 세 포 표면의 당사슬이나 바이러스 및 미생물 표면의 당사슬을 렉틴을 이용해 aggregation 시켜 신체 내에 면역시스템에 의해 질병을 퇴치하는 방법이 현재 동 물 실험을 통해 연구되고 있다[4-7].

스위스연방공과대학교(ETH Zürich) 미생물 연구 소의 Prof. Dr. Abei, M./Dr. Künsler, M. 그룹에서는 버섯 종류인 Coprinopsis 유래의 galectin을 대상으로 연구가 진행되고 있다[8]. Coprinopsis 유래의 galectin family인 CGL-2, CGL-3 등을 발굴하고 생화학적 특 성 및 단백질 구조규명을 통해 당사슬 결합 선택성 을 확인한 후, 이를 꼬마선충(C. elegans) 모델을 통 해 CGL-2가 선충의 장(gut)내 존재하는 당사슬에 결

합하여 대사작용 및 선충의 운동성을 저해시킨다는 것을 규명해냈다(그림 2). 이 결과를 바탕으로 2010 년 5월 ETH Zürich spin-off 기업으로 Malcisbo를 설 립하였으며, 당해 11월에는 스위스 기술 대상(Swiss Technology Award)을 수상하였다. 이 기술은 당사슬 결합 특이적 렉틴을 이용하여 초기에 박테리아 및 바이러스 표면에 결합을 갖는 렉틴을 이용하여 초기 에 항생제 없이 병원체의 감염을 제어하는 기술로 각광받고 있다.

영국 임페리얼컬리지(Imperial college)의 Prof. Dr.

Ten Feizi 교수 그룹은 형광 라벨링된 렉틴을 이용하 여 병원성 미생물, 바이러스, 암세포 특이적인 당사 슬이 포함되어 있는 carbohydrate array를 측정하는 기술을 개발하였다(그림 2)[9]. 이 기술은 질병을 일 으키는 감염성 질환 및 암세포 특이적인 당사슬 마 커를 렉틴의 선택적인 결합력으로 측정하는 방법으 로 glycan array 개발을 위한 최초의 시도로 평가되 고 있다. 이후 미국의 CFG (Consortium for functional glycomics)는 이 기술을 진보시켜 현재 500여개의 당 사슬이 포함되어 있는 mammalian glycan array ver.

5.0을 개발하였다. 향후 다양한 당사슬과 해당 당사 슬 선택적 렉틴 개발에 따라, 이 기술은 빠르게 진보 할 것으로 예상되고 있다.

미국의 조지아 대학교(University of Georgia) 의 복합 탄수화물 분석센터(Complex Carbohydrate Research Center, CCRC)에서는 세포내 당사슬을 포 함하는 당사슬의 당단백질, 당지질, 올리고당에서 선택적 당사슬을 분리하기 위해 렉틴을 특정 레진 에 결합하여 소형 컬럼을 제작하였고, 이를 이용하

그림 1. 당사슬 결합 특이적 렉틴의 생체분자 인지 및 당복합체 정제를 위한 응용 기술[4]

특 별 기 획 (I)

여 소량의 시료에서 당사슬을 농축하여 MS를 이 용해 분석하는 기술을 개발하였다(그림 2)[10]. 현 재 이 기술은 96 well plate 렉틴 컬럼을 이용한 high throughput screening (HTS) 시스템으로 다중 당사슬 분석 기법으로 활용되고 있다.

이러한 렉틴의 이용 기술 이외에도 최근에는 광 학 현미경 기술의 발전과 다양한 형광 probe 합성과 더불어 렉틴의 당사슬에 대한 선택적 결합 특이성 을 이용하여, 특정 세포 및 바이러스, 미생물의 표면 에 존재하는 당사슬을 인지하여 세포를 측정하여 조 기에 암 세포의 발견, 세포내 특정 단백질의 위치 확 인, 세포간의 상호작용, 바이러스 및 미생물의 세포 내 침입 등을 관찰하는 당을 매개로 한 생명체의 이 미지 측정에 광범위하게 사용하고 있다[5-7].

현재까지 개발되어 상용화되어 있는 렉틴은 식 물, 동물, 미생물 등의 다양한 생명체로부터 분리 되어 시알산(Neu5Ac, Neuraminic acid), 갈락토즈 (Gal, galactose), N-아세틸갈락토사민(N-GalNAc, N-acetylgalactosamine), 퓨코즈(Fuc, Fucose), 만노즈 (Man, Mannose), 글루코스(Glc, glucose)의 기본 모노 머를 측정할 수 있는 렉틴 알려져 있다[3]. 하지만, 당 사슬의 구조상 알파(alpha), 베타(beta)-결합(linkage) 의 다양성과 당사슬 체인 구성 시 모노머 간의 결합

조합(combination)의 다양성, 또한 α-/β-linkage 및 combination으로 경우 수백, 수천종 이상의 다양한 당 사슬의 구조가 이론적으로 자연계에 존재하며, 실제 적으로 현재까지 개발된 렉틴의 경우 그 수가 적으 며, 특정 렉틴의 경우 추출된 단백질 형태이기 때문 에 비선택적 결합을 보이는 단점으로 정확한 당사슬 의 구조를 측정하는데 한계가 있다. 따라서 정확한 당사슬의 결합을 구분할 수 있는 신규 렉틴의 발굴과 응용 기술 개발이 필요하다고 할 수 있다.

4. 맺음말

이와 같이 렉틴 및 렉틴과 당사슬을 매개로 일어 나는 생명체의 생화학적, 생리학적 대사 작용뿐 아 니라, 병원성미생물 감염 기작이 당사슬 및 당사슬 결합 렉틴과 직접적인 연관성이 있다는 것이 밝혀짐 에 따라, adhesion 저해를 통한 미생물 감염기작 억 제등과 같은 항생제의 대체 물질 발굴, 당사슬의 분 리 및 분석, glycan microarray 기술, 렉틴기반의 세포 이미징 기술 등의 연구와 응용 기술 개발이 더욱 활 발히 진행될 것으로 예상된다. 특히 현재 관심이 고 조되고 있는 바이오시밀러 의료용 당단백질의 생산, 인체 내에서 당사슬 합성, 당사슬 대사 과정의 문제 로 생기는 질병, 당사슬을 매개로 일어나는 바이러

그림 2. 렉틴의 특정 당사슬을 결합하는 메커니즘을 활용한 농축산 분야 및 메디컬 분야에서의 응용 기술 개발 사례[8-10]

특 별 기 획 (II)

스, 미생물의 감염 기작 등에 광범위하게 사용 될 것 으로 전망한다.

참고문헌

[1] A. Varki, M.E. Etzler, R.D. Cummings, J.D. Esko, Dis- covery and classification of glycan-binding proteins. In Essentials of glycobiology (2nd ed.), Cold Spring Har- bor Laboratory Press, New York (2009).

[2] A. Varrot, S.M. Basheer, A. Imberty, Curr. Opin. Struct.

Biol. 23, 678 (2013).

[3] Y. Kobayashi, H. Kawagishi, Fungal lectins: a growing family. In Hirabayashi, J. ed. Lectins methods and pro- tocols, Methods Mol. Biol. 1200. Humana Press, New York (2014).

[4] R.D. Cummings, M.E. Etzler, Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. Essentials of glycobiology (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (2009).

[5] D.H. Dube, C.R. Bertozzi, Nat. Rev. Drug Discov. 4, 477 (2005).

[6] H. Ghazarian, B. Idoni, S.B. Oppenheimer, Acta Histo- chem. 113, 236 (2011).

[7] H.-J. Gabius, H. Kaltner, J. Kopitz, S. André, Trends Biochem. 40, 360 (2015).

[8] K. Stutz, A. Kaech, M. Aebi, M. Künzler, M.O. Hengart- ner, PLoS One DOI: 10.1371/journal.pone.0129381 (2015).

[9] Y. Liu, A.S. Palma, T.Feizi, Biol. Chem. 390, 647 (2009).

[10] D.F. Cortes, J.L. Kabulski, A.C. Lazar, I.M. Lazar, Electrophoresis 32, 14 (2011)

탄수화물 마이크로어레이(Glycan microarray)의 발전과 응용

김창섭

[email protected]

1. 머리말

게놈프로젝트를 통해 생명체 내의 모든 기능들이 유전체 내에 암호화되어 있지 않다는 것을 깨달은 후 생체 내에 존재하는 고분자 중 하나인 탄수화물 분자에 관심을 가지게 되었다. 생체 내의 탄수화물 은 다양한 생체물질인 지질 및 단백질과 결합된 형 태로 존재하며 단백질과의 상호작용을 통해서 다양 한 역할들을 한다고 알려져 있다 (그림1).⁽¹⁾따라서 생 체 내의 탄수화물과 단백질 간의 상호작용을 분석함 으로써 탄수화물(carbohydrate)의 생물학적인 역할과 생명체 내의 생명현상들을 이해하는 데에 중요한 정 보를 제공할 수 있다.

이 상호작용을 효율적으로 생체 외에서 분석하 기 위해 DNA나 protein 연구에서 사용된 마이크로어 레이 기술(microarray technology)이 제안되었다. 탄

수화물은 DNA나 단백질과 달리 주형(template) 없 이 특정한 효소들에 의해 합성되기 때문에 대량 생산 이 어렵고 생체 내에서 높은 순도로 분리하는 것 또한 쉽지 않다. 이로 인해 소량의 탄수화물을 이용하여 분 석할 수 있는 분석기술이 절실히 필요하다. 마이크로 어레이(microarray) 기술은 작은 양의 샘플을 이용하여 수십 개에서 수천 개의 샘플들의 상호작용들을 빠르 고 동시다발적으로 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 따라서, 탄수화물의 생물학적인 역할을 분석할 수 있는 기술로 탄수화물 마이크로어레이(carbohydrate microarray) 기술이 큰 관심을 받고 있다.

2. 본론

2-1. 탄수화물 고정화(carbohydrate immobili- zation) 방법

특 별 기 획 (II)

탄수화물 한 분자와 단백질을 구성하는 하나의 서브유닛(subunit)과의 결합세기는 DNA-DNA나 protein-protein에 비해 매우 약하다.⁽²⁾낮은 결합력은

탄수화물 마이크로어레이(carbohydrate microarray) 상에서 탄수화물과 관련된 상호작용을 분석하는 것 을 어렵게 한다. 따라서, 탄수화물과 단백질을 구 성하는 서브유닛간의 다가의 상호작용(multivalent interaction)을 통해서 결합세기를 증가시키는 것이 매우 중요하다. 이를 위해 탄수화물 마이크로어레이 (microarray) 상에 탄수화물을 고정시킬 때 탄수화물 의 방향성과 표면과 탄수화물 사이의 거리를 조절하 는 것이 매우 중요한 단계이다. 즉, 적당한 linker를 사용하여 탄수화물과 표면 사이에 적당한 공간을 부 여하여 단백질을 구성하는 서브유닛으로의 접근성 을 높이고 탄수화물을 잘 노출시키는 것이다.

비공유결합 (noncovalent bonding)를 이용한 고정 화 방법과 공유결합 (covalent bonding)을 이용한 고 정화 방법이 이용되어 왔다.⁽³⁾비공유 결합을 이용하 는 것은 소수성 표면에 탄수화물을 소수성 상호작용

그림 1. 세포 내에서의 탄수화물과 단백질 간의 상호작용 (Bertozzi et al., Science, 2001 [1])

그림 2. 탄수화물 마이크로어레이를 제작하기 위한 탄수화물의 공유결합적 고정화 방법 (Park et al., Chem. Soc. Rev., 2013 [3])

특 별 기 획 (II)

을 통해 고정화하는 하는 방법으로 초기에는 이 방 법을 이용하여 탄수화물을 고정화하여 탄수화물 마 이크로어레이(carbohydrate microarray)를 제작하였 지만 이 방법의 탄수화물 고정화는 탄수화물의 크기 및 분자량에 영향을 받는다. 다당류 탄수화물을 니 트로셀룰로오즈(nitrocellulose) 또는 polystyrene으로 변형된 슬라이드에 고정화하는 것이 대표적인 예이 고 작은 분자량의 탄수화물을 사용할 경우 쉽게 떨 어질 수 있는 단점을 가지고 있다.⁽⁴⁾탄수화물의 크기 및 분자량에 영향 없이 다양한 탄수화물들을 효율적 으로 고정화하여 마이크로어레이(microarray)를 제작 할 수 있는 공유 결합을 이용한 고정화 방법이 현재 개발되고 이용되고 있다.

적당한 space와 기능기를 가지는 linker를 이용하 여 탄수화물의 환원당(reducing sugar)을 변형시켜 특 정한 반응기(functional group)을 도입하고 이 반응기 와 결합하는 기능기(functional group)으로 처리된 표 면에 고정화하는 기술이 공유 결합을 이용한 고정화 방법이다 (그림 2).

기존의 공유 결합을 이용한 고정화 방법은 고정 화된 탄수화물이 생체 물질 간의 접근성을 높이기 위해 복잡한 화학 반응들을 이용하여 고정화된 탄수 화물과 표면 사이에 적당한 공간과 탄수화물의 방 향성을 부여하였다. 이 방법은 접근성을 높임으로써 단백질과 탄수화물 간의 상호작용 분석을 용이하게

만들었다는 장점을 가지고 있으나 매우 복잡한 화학 반응 과정을 이용하고 있어서 전문가 이외에는 탄수 화물 마이크로어레이(carbohydrate microarray)를 이 용하여 단백질과 탄수화물간의 상호작용을 분석하 는 데 제한이 있다. 따라서, 생체 물질로의 접근성을 높이면서 제작이 쉬어야만 탄수화물 마이크로어레 이(carbohydrate microarray)가 DNA 마이크로어레이 (DNA microarray)나 protein 마이크로어레이(protein microarray)처럼 다양한 응용분야들에 적용될 가능 성이 높아진다. 이를 위해 몇 가지 방법들이 제안 되고 개발되고 있다. 한 가지 예로, 2개의 primary amine group을 가진 4-(2-aminoethyl)aniline과 환 원성 아미노화 (reductive amination) 반응을 통해 한 번의 단계로 amine group를 가지는 탄수화물 을 만들었으며, 그 탄수화물을 엔-하이드록시석신 이미드(N-hydroxylsuccinimide)를 가진 유리슬라 이드에 고정화함으로써 탄수화물 마이크로어레이 (microarray)를 쉽게 제작하였다 (그림 3).⁽⁵⁾이 방법 은 쉽게 제작할 수 있고 단백질-탄수화물 간의 상 호작용을 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있으나 이 방법 또한 해결하고 최적화해야 할 부분들이 존 재한다.

2-2. 탄수화물 마이크로어레이의 응용

탄수화물 마이크로어레이(carbohydrate microarray)

그림 3. 탄수화물 마이크로어레이 제작을 위한 간단하고 빠른 탄수화물 고정화 방법 (Seo et al., Nanotechnology, 2010 [5])

특 별 기 획 (II)

는 탄수화물과 lectin(당과 결합하는 단백질)간의 상호작 용의 profiling, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)과 성장인자(growth factor) 그리고 시토킨(cytokine) 간 의 상호작용 분석, 병원균 인지하는 항체 및 암을 인 지하는 항체 profiling, 탄수화물과 바이러스(virus)나 박테리아(bacteria)간의 상호작용 분석, 탄수화물 기 반의 약 개발 등 다양한 응용분야에 사용되고 있다 (그림 4).^(6)-(7)한 가지 예로, 병원균이나 병원균에 의 해 분비된 독소가 인간세포 표면에 존재하는 탄수화 물과의 상호작용을 통해 세포 안으로 침입하여 질병 을 일으킨다는 점을 착안하여 탄수화물 마이크로어 레이는 이 독소단백질과의 상호작용을 분석하고 검 출하는 데에 이용되었다. 콜레라는 음식이나 물을 통해 감염되며 병원균 비브리오 콜레라에 의해 생산 된 콜레라 독소에 의해 생기는 질병이다.

콜레라 독소는 세포 표면에 존재하는 지엠원 오 당류(GM1 pentasaccharide; 5가지의 단당류로 이루 어진 탄수화물)와의 상호작용을 통해 세포 안으로 들어와 질병을 일으킨다. 콜레라 독소와 탄수화물 간의 상호작용을 효율적으로 분석하고 이를 검출 하기 위해 지엠원 오당류, 구조적으로 유사한 탄수 화물들, 그리고 지엠원 오당류를 구성하는 이당류 와 단당류 등 7가지의 탄수화물들로 구성된 기능성 탄수화물 마이크로어레이를 제작하여 콜레라 독소

가 결합하는 탄수화물의 선호도와 콜레라 독소의 복합체 형성에 따른 결합하는 탄수화물의 선호도 및 결합력의 차이를 효율적으로 분석하였으며 23 pM의 낮은 농도의 콜레라 독소까지 검출함으로써 탄수화물 마이크로어레이의 응용가능성을 보여줬 다(그림 5).⁽⁷⁾

3. 맺음말

기능성 탄수화물 마이크로어레이의 개발은 질병 과 관련된 상호작용을 분석 및 진단 할 수 있을 뿐만 아니라 탄수화물 기반의 백신의 특성 분석 및 개발, 의약품 개발 그리고 당과 관련된 효소들의 특성 분 석 등 다양한 응용분야들에서 성공적으로 사용될 것 으로 기대된다.

4. 참고문헌

(1) C. R. Bertozzi, L. L. Kiessling, Chemical glycobiology.

Science, 291, 2357 (2001)

(2) M. Mammen, S.-K. Choi, G. M. Whitesides, Polyvalent interactions in biological systems: Implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors.

Angew. Chem. Int. Ed., 37, 2754 (1998).

(3) S. Park, J. C. Gildersleeve, O. Blixt, I. Shin, Carbohy- drate microarrays. Chem. Soc. Rev. 42, 4310 (2013).

(4) D. Wang, S. Liu, B. J. Trummer, C. Deng, A. Wang, Carbohydrate microarrays for the recognition of cross- reactive molecular markers of microbes and host cells.

Nat. Biotechnol. 20, 275 (2002).

(5) J. H. Seo, C. S. Kim, B. H. Hwang, H. J. Cha, A func- tional carbohydrate chip platform for analysis of carbohydrate-protein interaction. Nanotechnology, 21, 215101 (2010).

(6) P.-H. Liang, C.-Y. Wu, W. A. Greenberg, C.-H. Wong, 그림 5. 탄수화물 마이크로어레이 상에서 기질과 콜레라 독소 간 의 상호작용에 대한 정량적인 분석 (Kim et al., Aanl. Chem., 2012 [7])

그림 4. 탄수화물 마이크로어레이의 응용(Liang et al., Curr.

Opin. Chem. Biol., 2008)

특 별 기 획 (III)

Glycan arrays: biological and medical applications.

Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 86 (2008).

(7) C. S. Kim, J. H. Seo, H. J. Cha, Functional interaction

analysis of GM1-related carbohydrates and Vibrio cholera toxins using carbohydrate microarray. Anal.

Chem. 84, 6884 (2012).

당(Carbohydrate)의 생체물질 상호작용 분석기술

서정현

[email protected]

1. 머리말

세포내에서 생체물질은 생물학적 반응을 조절하 고 중재하는 역할을 한다. 일부의 생체물질들은 다 른 생체물질의 도움없이 독자적으로 생체내에서 기 능을 하기도 하지만, 생체내에서 생물학적인 반응의 대부분은 생체물질들간의 상호작용을 통하여 일어 나게 된다. 이러한 상호작용의 과정에서 생체물질들 은 복합체를 형성하게 된다. 때문에 이러한 생체물 질들간의 상호작용에 관한 연구는 생물학적 반응을 이해하는 데 기본적인 바탕이 된다. 생체내에서 당 (carbohydrate)은 단백질의 folding이나 단백질을 안 정화시키는 역할을 할뿐만 아니라 세포와 세포간의 communication 혹은 면역학적 반응에 있어서 중요한 역할을 하는 생체물질로 알려지고 있다. 따라서, 이 러한 당에 관한 연구는 살아있는 유기체의 생물학적 인 과정에 대한 중요한 정보를 제공할 뿐 아니라, 잠 재적인 신약개발에 있어서 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

당과 단백질의 상호작용 연구를 위한 목적 단백 질로 Vibrio cholera toxin protein이 가장 잘 알려져 있을 뿐 아니라 GM1 pentasaccharide와의 상호작용 정도 또한 상당하다고 알려져 있다. 이 독성단백질 은 27 kDa의 CtxA와 12 kDa의 CtxB로 이루어져있 다. CtxB의 경우 pentamer를 형성하여 세포막에 위 치하는 ganglioside GM1과 상호작용을 하게 된다.

Cholera toxin이 ganglioside GM1과 상호작용시 CtxA 와 5개의 CtxB가 복합체를 형성한 후 ganglioside GM1 pentasaccharide와 결합한다. 이러한 상호작 용 후 세포내 감염기작을 일으키게 된다. 상호작용 의 특징을 간단히 살펴보면 CtxB monomer는 GM1 pentasaccharide와 1:1로 결합하는 특징을 가지고 있 지만, 이러한 결합만으로는 세포내 감염을 일으키지 못한다. CtxAB 복합체를 형성한 후 감염기작이 일 어나는 것으로 알려져 있다. Cholera toxin의 감염기 작에 관한 연구는 어느 정도 보고가 되어 있으나, 그 상호작용에 관한 연구는 아직 잘 밝혀지지 않았다.

한 연구그룹에서는 이러한 상호작용에 있어서 CtxB

그림 1. 당의 생체내에서의 다양한 기능 및 활용

(http://www1.gifu-u.ac.jp/~kassei1/iCeMS_Gifu/newpage7.html)

특 별 기 획 (III)

가 GM1과 결합한 것보다 CtxAB 복합체가 GM1과 결합시 결합정도가 더 강하다고 보고하였다. 이러 한 상호작용을 분석하기 위하여 non-labeling system 인 surface plasmon resonance (SPR), electrochemical detection, 그리고 atomic force microscopy (AFM)을 이용한 결과를 소개하고자 한다.

2. 당의 표면 고정화 방법 개발

다양한 분석방법에 당을 이용하기 위하여 새로운 방법의 당 고정화 방법이 개발되었다. 그림 2에서 살 펴볼 수 있듯이 여러 특이적인 화학결합을 통하여 chip으로 사용하는 glass표면에 당을 고정화 하는 연 구들이 많이 보고가 되어왔다 [2]. 하지만, 기존의 보 고가 된 당 고정화 방법들은 당 구조가 복잡하고, 당 의 변형과정중 구조가 깨지는 문제점들 때문에 복잡 한 구조의 당들은 고정화시키기 어려웠다. 또한, 당 지질인 ganglioside GM1을 고체 표면에 고정화시키 기 위하여 복잡한 과정을 거치고, 간접적인 방법들 을 이용하였다 [2-4].

본 특별기고에서 소개하려는 당 고정화 방법은 다양한 종류의 당들은 직접적인 방법을 이용하여 금 표면에 고정화시키기 위한 방법이다. 당의 환원당 부분의 aldehyde group과 aminophenyl sulfide의 아민 (NH2-) 그룹을 결합시켜서 씨올(SH-) 그룹을 가질 수 있도록 변형하였다. 이러한 당은 금표면에 직접 적으로 고정화 될 뿐만 아니라, 환원당부분을 변형 시켰기 때문에 당의 활성부분은 그대로 유지된 상태 로 금표면에 고정화 한다는 특징을 가지고 있다. 따 라서 이러한 당 고정화 방법은 당과 관련된 연구에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

3. 당 단백질의 상호작용 분석

상호작용의 분석결과, 우선적으로 아직까지 보 고가 되지 않은 CtxA와 CtxB간의 상호작용은 세가 지 분석방법을 통하여 얻어진 결과로 볼 때 비록 세 포내 감염기작을 일으키기 위해서 ctxA와 ctxB가 복

합체를 형성해야 하지만, 두 단백질간의 상호작용은 일반적인 ligand-receptor와의 상호작용과 거의 유사 한 값을 구할 수 있었다 (184 pN).

기존의 보고들은 주로 CtxB와 GM1간의 상호작용 을 SPR이나 ITC와 같은 비교적 정성적인 분석방법 들을 이용하여 분석하였다. 본 연구에서는 CtxAB와 GM1간의 상호작용을 분석함과 동시에 상호작용시 GM1 pentasaccharide에서 monosaccharide의 역할을 밝히기 위한 연구를 수행하였다.

CtxB-GM1 상호작용과 CtxAB-GM1간의 상호작 용을 분석한 결과 정성적인 분석방법인 SPR과 전 기화학분석 결과에서는 CtxB-GM1간의 상호작용

그림 2. 공유결합을 통한 당의 고정화 방법(Shin et al, 2005 [2])

특 별 기 획 (III)

이 더 강한 affinity를 나타내는 결과를 보여줬다. 하 지만, AFM을 이용한 force의 값에서는 CtxAB-GM1 간의 상호작용이 약 90 pN 더 큰 결합정도를 나타 냈다. 위의 두 분석방법에서 ctxB-GM1간의 상호작 용이 더 강하게 나타난 이유는 사이즈가 큰 CtxAB 와 GM1상호작용시 steric hindrance때문에 결합의 방해를 일으켰다고 결론지을 수 있다. CtxB의 경우 MALDI-ToF를 이용한 질량의 분석결과 monomer 부터 pentamer까지 존재하기 때문에, 상호작용시 CtxAB보다 결합이 쉽게 이루어질 수 있어서 이와 같 은 결과를 나타냈을 것으로 생각된다. 하지만 이러 한 steric hindrance문제가 적용되지 않은 AFM을 이 용한 분석방법은 직접적인 분석방법이기 때문에 상 호작용에 관한 정확한 정보를 제공하였다고 생각된 다. SPR의 분석결과 sialic acid가 없는 asialo GM1의 association rate값이 가장 낮게 나왔기 때문에 상호작 용시 recognition 역할을 할 것으로 생각되고, terminal galactose가 없는 GM3의 경우 dissociation rate정도 가 크게 나타났기 때문에 stabilization역할을 하는 것 으로 분석되었다. Merritt의 보고에 따르면 X-ray

crystallography분석결과 CtxB와 GM1간의 상호작용 시 “Two fingered grip” model을 제시하였다 [10]. 본 연구의 결과에서도 GM1과 유사한 two finger grip형 태를 가지는 LST-b의 경우 결합정도가 높게 나타남 을 확인하였다. 따라서 CtxAB와 GM1간의 상호작용 시 이러한 형태의 구조가 중요함을 확인하였다. 또 한, 다른 당이 CtxAB와 상호작용시 재배열을 통하여 결합한다는 사실도 확인하였다. 전기화학의 분석방 법에는 다른 방법들과 다르게 potential shift의 변화 를 통하여 상호작용의 specificity를 확인하였다.

4. 맺음말

본 연구에서는 당과 단백질간의 상호작용을 분석 하기 위한 기반기술로 새로운 방법의 당 고정화 기 술을 개발하였다. 이러한 당고정화 방법은 많은 장 점을 가지고 있기 때문에 당과 관련된 생체모방기술 에 다양하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다. Vibrio cholera toxin단백질과 ganglioside GM1간의 상호작

용분석결과에서는 CtxA가 상호작용에 있어서 결합 정도를 강화시킴을 확인하였다. 또한 상호작용에 있

그림 3. 금표면에 당의 고정화를 위한 당의 변형 (Seo et al. 2007, 2011 [5,6])

특 별 기 획 (III)

어서 sialic acid와 terminal galactose가 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 상호작용시 GM1의 two fingered grip형태가 상호작용에 있어서 중요하다는 것을 확인하였다. 본 연구에서 이용한 각각의 분석방법들은 장점과 단점을 동시에 가지고 있으며, 분석방법마다 얻을 수 있는 정보가 다르기 때문에 상호작용의 분석시 다양한 분석방법을 통한 다면 상호작용에 대한 보다 정확한 정보를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.

이러한 당의 고정화에 대한 연구 및 당과의 상호 작용에 관한 연구는 genomics, proteomics 연구에 이 어서, 최근에 각광을 받고있는 glycomics 연구에 대 한 폭넓은 이해를 할 수 있을 것으로 여겨진다.

참고문헌

1. C.R. Bertozzi and L.L. Kiessling, Science , 291, 2357(2001)

2. I. Shin, S. Park and M.R. Lee, Chem-Eur. J. , 11, 2894(2005).

3. S.J. Park, I.J. Shin, Angew. Chem. Int. Edi. 41, 3180(2002).

4. M. Lee and I. Shin, Org. Lett. 7, 4269(2005).

5. J.H. Seo, K. Adachi, B.K. Lee, D.G. Kang, Y.K. Kim, K.R. Kim, H. Lee, T. Kawai and H.J. Cha, Bioconjugate Chem. 18, 2197(2007).

6. J.H. Seo, C.S. Kim, B.H. Hwang and H.J. Cha, Nano- technology 21, 215101(2010).

7. J.H. Seo, C.S. Kim, H.Y. Lee, T. Kawai and H.J. Cha, Anal. Chem. 83, 6011(2011).

8. J.H. Seo, H.Y. Lee and H.J. Cha, Analyst 137, 2860(2012).

9. J.H. Seo, C.S. Kim and H.J. Cha Analyst 138, 6924(2013).

10. E.A. Merritt, S. Sarfaty, F. Vandenakker, C. Lhoir, J.A.

Martial and W.G.J. Hol, Protein Sci. 3, 166(1994).

그림 4. 다양한 당-단백질 상호작용 분석방법 (Seo et al. 2011, 2012, 2013 [7-9])