접수일：2010년 8월 2일, 수정일：2010년 8월 14일, 승인일：2010년 8월 20일
책임저자：조 덕 519-809 전남 화순군 화순읍 일심리 160, 화순전남대학교병원 진단검사의학과
Cis-AB 가계에서 발견된 새로운 O02 변이형 - 한 가족 내 3 증례 보고
원은정1ㆍ장민중1ㆍ조 덕1,2ㆍ신동준2ㆍ신명근1ㆍ양동욱1
전남대학교 의과대학 진단검사의학교실1, 화순전남대학교병원 암면역치료센터2
New Variant of O02 Allele Found in the Family of Cis-AB:
Report of Three Cases in a Family
Eun-Jeong Won1, Min-Joong Jang1, Duck Cho1,2, Dong-Jun Shin2, Myung-Geun Shin1, Dong-Wook Ryang1
Department of Laboratory Medicine, Chonnam National University Medical School1, Gwangju, Research Center for Cancer Immunotherapy, Chonnam National University Hwasun Hospital2, Hwasun, Korea
In preoperative ABO typing, we observed an ABO discrepancy in a 61 year-old patient with A2B3 phenotype.
Standard serologic tests for the ABO blood group phenotypes and ABO gene direct sequencing for the exons 6 and 7 were done as part of the patient’s family study. We found that the patient’s genotype was identical to cis-AB01/O02, except for a 703 G＞A polymorphism at exon 7. An allele-separation by cloning and subsequent sequencing of the heterozygote was carried out. We identified a novel O02 variant allele characterized by a 703 G＞A polymorphism in the patient and in her 2 daughters. (Korean J Blood Transfus 2010;21:
148-153)
Key words: ABO discrepancy, O02 variant, Allele-separation
서 론
1990년 Yamamoto 등에 의해 ABO 혈액형 유전 자의 염기서열이 최초로 규명되었다.1) 이후 여러 인종에서 정상 표현형뿐 아니라 항원이 약화된 ABO 아형에서 ABO 대립유전자(allele)의 분석이
이루어졌다.2) 이러한 자료는 인종에 적합한 ABO 유전형 검사를 개발할 때 기초자료로 유용하게 사용될 것이다. 국내에서도 한국인 특성에 맞는 ABO 유전형검사가 개발되어 ABO 아형의 확진, ABO 불일치의 해결 등에 활용되고 있는데,3-5) 계 속 새로운 ABO 대립유전자(allele)가 최근까지도 보고되고 있어, ABO 유전형 검사의 결과 해석에
주의가 필요하다. 그간 국내에 보고된 대부분의 새로운 ABO 대립유전자는 A나 B 아형 특이 대 립유전자였고, O 대립유전자는 드물었다.6,7) 저자들은 61세 여자 환자에서 수술 전 검사로 ABO 혈액형 검사를 실시하였다. 혈청학적으로 cis-AB형이 의심되어 확진을 위해 ABO 유전자의 액손 6과 7을 분석한 결과, 액손 7의 703 G＞A만 을 제외하고는 cis-AB01/O02와 일치한 소견을 보 였다. 이에 cis-AB01과 O02 대립유전자 중 어느 대립유전자에서 703 G＞A의 변이가 기원했는지 를 밝히기 위해 환자의 가계도 조사, 가족들 ABO 혈액형의 혈청학적 분석 및 유전형 분석을 실시 하였고, 환자는 추가로 클로닝 후 직접염기서열 분석을 시행하여 703 G＞A의 변이가 새로운 O02 변이형에서 기원함을 증명하여 보고하는 바이다.
증 례
환자는 61세 여자 환자로 하복부 통증이 있어 2차 병원에서 시행한 초음파 검사상 오른쪽 자궁 부속기 종양이 의심되어 본원으로 전원되었다.
과거력 상 특이소견은 없었으며, 수술이나 수혈 력 또한 없었다. 수술 전 시행한 CBC 검사에서 백혈구 5,200/uL, 혈색소 13.5 g/dL, 혈소판 254,000/
uL이었고, ABO 혈액형 검사는 다음과 같았다.
1. 혈청학적 검사
환자는 ABO 혈구형 검사에서 항-A (Bioscot, Livingston, UK)에 4+, 항-B (Bioscot, Livingston, UK)에 3+, 항-AB (Biotest, Dreieich, Germany)에 4+, 항-A1에 음성, 항-H (Biotest, Dreieich, Germany) 에 3+였으며, 혈청형 검사에서 A1혈구에 음성, B 혈구에 2+ 반응을 보이는 전형적인 cis-A2B3형이 었다. 그리고 환자의 3명의 자녀는 모두 전형적 인 A형이었다.
2. ABO 유전자 액손 6∼7번의 직접염기서 열분석
이에 cis-AB형을 확진하기 위해 환자에게 유전 자검사의 서면 동의서를 획득하고 Cho 등6)에 의 해 보고된 방법과 동일하게 ABO 유전자의 exon 6과 7에 대한 직접염기서열분석을 실시하였다.
간략하게 기술하면 다음과 같다. EDTA 전혈에서 DNA를 추출하여 ABOe6F와 ABOe7R 시발체 쌍 으로 exon 6 및 7을 포함하는 2,080 bp의 증폭산물 을 얻은 후 Qiaquick PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 정제하여, 염기서열분석을 위 한 시발체인 ABOe6R, ABOe7F, ABOe7SF1 및 ABOe7SF2으로 엑손 6 및 7을 분석하였다. 염기 서열은 Big dye terminator cycle sequencing kit (Perkin Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) 를 사용하여 설명서대로 PCR 증폭한 후 ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Perkin Elmer/Applied Biosystems)로 자동분석하였다. ABO 유전자의 염 기서열분석은 SEQUENCHER (Gene Codes Corp, Ann Arbor, USA) software를 사용하였다. 염기서 열 분석 결과 환자의 염기서열은 A101을 기준으 로 할 때 261에 del/G, 297에 A/G, 467에 C/T, 646 에 A/T, 681에 A/G, 703에 A/G, 771에 C/T, 803 G/C, 829에 G/A 소견을 보여 새로운 cis-AB 대립 유전자 혹은 O02 변이형을 의심하였다(Table 1).
3. 가계조사 및 염기서열 분석
새로운 유전자 변이의 유전양상을 확인하기 위 해 환자와 가족들에게서 유전자 검사 동의서와 연구에 대한 서면동의를 획득하고 채혈 후 가계 조사와 혈청학적 검사 및 ABO 유전자의 exon 6 과 7에 대한 염기서열 분석을 시행하였다. 혈청 학적 검사에서 환자는 cis-A2B3였고, 3명의 자녀 는 모두 전형적인 A형의 표현형을 보였다. A형의
Table 1. The phenotypes and genotypes of the patient and her daughters
Phenotype Genotype Exon 6 Exon 7
261 297 467 526 646 657 681 703 771 796 803 829 930 1096 Reference
allele
A A101 G A C C T C G G C C G G G G
A A102 − − T − − − − − − − − − − −
B B101 − G − G − T − A − A C − A A
O O01 Del − − − − − − − − − − − − −
O O02 Del G − − A − A − T − − A − −
Cis-AB Cis-AB01 − − T − − − − − − − C − − −
Patient Cis-A2B3 Cis-AB01/O02varDel/G A/G T/C C/C T/A C/C G/A G/A C/T C/C C/G G/A G/G G/G
Cis-AB01* G A T C T C G G C C C G G G
O02var* Del G C C A C A A T C G A G G
Daughter 1 A A102/O02var Del/G A/G T/C C/C T/A C/C G/A G/A C/T C/C G/G G/A G/G G/G Daughter 2 A Cis-AB01/A102 G/G A/A T/T C/C T/T C/C G/G G/G C/C C/C C/G G/G G/G G/G Daughter 3 A A102/O02var Del/G A/G T/C C/C T/A C/C G/A G/A C/T C/C G/G G/A G/G G/G
*By cloning and sequencing.
Fig. 1. Pedigree demonstrating the inheritance of the novel O02var allele.
표현형을 가진 자녀들 중 딸 2는 cis-AB01/A102이 었고, 다른 두 자녀들은 cis-AB01 대립유전자가 유전되지 않았다. 이들 두 자녀들에 대한 ABO 유 전자 염기서열 분석 결과 703에 A/G가 확인되어 703의 G＞A는 cis-AB01 대립유전자가 아닌 O02 대립유전자에서 발생하였을 것으로 의심할 수 있 었다(Fig. 1).
4. 대립유전자 분리를 위한 cloning 후 직 접염기서열분석
따라서, 이를 확진하기 위해 환자의 검체를 이 용하여 cis-AB01 대립유전자와 O02 대립유전자 를 cloning으로 분리하고자 하였다. ABOe6F와 ABOe7R 시발체 쌍으로 증폭한 2,080 bp의 증폭 산물을 정제한 후 pGEM T easy vector (Promega, USA)에 ligation하고 Escherichia coli DH5α에 transformation하여 생성된 형질전환체 colony들 중 4개를 선별하여 각각 ampicillin이 함유된 액상 LB 배지에서 진탕 배양하였다. 각각의 colony에 서 증폭한 E. coli를 DNA-spinTM plasmid DNA Purification Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)로 plasmid DNA를 추출하여 ABOe7SF1로 직접 염기 서열을 분석하였다. 4개의 colony 중 3개는 cis-AB01 대립유전자를 함유한 것이었고, 한 개는 O02 대 립유전자를 포함한 것이었다. Fig. 2에서 보여주 듯이 703 G＞A는 O02 대립유전자에서 기원했음 을 확인할 수 있었다.
Fig. 2. New variant of O02 allele was identi- fied by cloning and sub- sequent sequencing.
고 찰
O 대립유전자는 261 염기에서 G의 결실로 인 해 frame shift가 일어나 조기에 TAA stop codon을 만나게 되어 117개 아미노산으로 된 비활성 전이 효소를 생성하게 된다.8) A나 B 항원의 표현형에 영향을 미치는 A나 B 대립유전자에 비해 O 대립 유전자의 변이에 관한 연구는 상대적으로 그 보 고가 활발하게 이뤄지지 않았다. 하지만, NCBI의 dbRBC에는 여러 인종에서 대부분의 빈도를 차지 하는 O01, O02 이외에도 60여 개의 O 대립유전자 가 보고되었다.2) 한국인에는 O01, O02가 대부분 의 O 대립유전자로 밝혀졌으며 그 외에도 O04, O13, O20이 보고된 바 있다.9,10) 본 연구에서 규명 한 일가족 3 증례들은 액손 6과 7의 ABO 유전자 분석에서 액손 7의 703 G＞A만을 제외하고는 O02와 일치한 소견을 보여 한국인에서 최초로 확 인된 새로운 O02 변이형 대립유전자로 판단되었다.
한편, 저자들이 본 연구를 통해서 발견한 703 G＞A 변이는 액손 6과 7에서 A101과 B101을 감 별할 수 있는 주요 7개의 염기서열 감별 포인트 중 하나로서, 또한 아미노산의 변화를 유발하는
4개 중 하나이다. 따라서, 703 G＞A 변이는 B101 을 비롯하여 각종 B 아형의 대부분에서 보고되었 는데, 그 외에 A204, cis-AB02, cis-AB03, cis-AB05, cis-AB06, O24, O41, O42에서도 보고되었다.2) 만 약 703 G＞A의 변이를 활용하여 개발된 ABO 유 전형 검사법으로 이와 같은 대립유전자를 함유한 검체를 검사할 경우에는 그 해석에 주의해야 한 다.
일반적으로 새로운 대립유전자의 변이가 이형 접합개체(heterozygous individuals)에서 발견되는 경우에는 그 기원을 규명하기 위해 대립유전자분 리(haplotype separation)가 필수적이다. 이형접합 개체(heterozygous individuals)에서 그 기원을 규 명하기 위한 대립유전자분리의 방법은 가장 고전 적인 방법인 클로닝법, haplotype PCR법, PCR후 allele specific primer로 직접염기서열을 하는 법 이외에도 Dynabeads M-270 Streptoavidin 법이 소 개되었다.9,11,12) 본 예는 가장 고전적인 방법인 클 로닝법을 사용하였다. 환자는 수술 전 시행한 ABO 혈액형 검사에서 혈청학적으로 cis-AB가 의 심되어 확진을 위해 실시한 액손 6과 7의 ABO 유전자 분석에서 액손 7의 703 G＞A만을 제외하
고는 cis-AB01/O02와 일치한 소견을 보였다. 703 G＞A의 변이가 각종 cis-AB형(cis-AB02, cis-AB03, cis-AB05, cis-AB06)에서 보고된 사례가 있어 새로 운 cis-AB 변이형일 것으로 먼저 의심되었다. 하 지만 예상과 달리 환자의 가계도 조사, 가족들의 ABO 혈액형의 혈청학적 분석 및 유전형 분석 그 리고 추가로 환자는 클로닝 후 직접염기서열분석 을 시행하여 703 G＞A의 변이가 O02 대립유전자 에서 기원함을 증명하여 새로운 O02 변이형임을 확인하였다. 저자들은 본 예를 통해서 새로운 O02 변이형을 최초로 한국인에서 발견하였고, 또 한 대립유전자의 변이가 이형접합개체에서 발견 될 경우 대립유전자 분리가 필수적임을 재차 확 인하였다.
요 약
저자들은 61세 여자 환자의 ABO 불일치를 해 결하는 과정에서 혈청학적으로 cis-AB형을 의심 하고 실시한 ABO 유전자의 액손 6과 7 분석에서 액손 7의 703 G＞A만을 제외하고는 cis-AB01/
O02와 일치한 소견을 보여, 가계도 조사, 가족들 ABO 혈액형의 혈청학적 분석, 유전형 분석 그리 고 환자에 대해서는 추가로 클로닝을 실시하여 cis-AB01 대립유전자와 O02 대립유전자를 분리 한 후 다시 직접염기서열분석을 통해 703 G＞A 변이가 새로운 O02 변이형에서 기원하였음을 증 명하여 보고하는 바이다.
감사의 글
저자들은 화순전남대학교병원 혈액은행 검사 실 정충현, 허 진 선생님, 분자유전학검사실 김미지 선생님께 감사드립니다.
참고문헌
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