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흰 쥐 자 궁 상 피 와 내 막 에 서 기 원 한 세 포 주 의 체 외 배 양

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흰 쥐 자 궁 상 피 와 내 막 에 서 기 원 한 세 포 주 의 체 외 배 양

울산대학교 의과대학 서울중앙병원 산부인과

서울대학교 자연과학대학 분자생물학과*

강 병문, 이 석원*, 채 희동, 강 은희, 추 형식, 김 정훈, 장 윤석, 남 주현

In V itro Culture of N ontran s form e d Ce ll Lin e s D eriv e d F rom R at En dom etrial E pith e lium an d S trom a

By u n g M oon K an g , S uk W on L ee*, H ee Don g Ch a e, E un H ee K an g , H y un g S ik Ch u , Chu n g H oon Kim ,

Y oon S eok Ch an g , Joo H y un N am

D ep artm ent of Obs tetr ics and Gy n ecology , Colleg e of M ed icine, Un iv ers ity of Ulsan, A san M ed ical Cen ter, S eoul, K or ea D ep artm ent of M olecular B iology , Colleg e of N atural S cience,

S eoul N ational Un iv ers ity , S eoul, K orea

*

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= A b str act =

S in ce t h e bla st ocy st is br ok en an d spr ead s ou t on a flat pla st ic cu lt ur e dish (t w o dim en sion al cult ur e ) dur in g in v it r o dev elopm en t , it h a s b een difficult t o st u dy t h e im plant at ion pr oces s . It also h a s b een difficu lt t o an aly se t h e int er act ion s b et w een en dom et r ial epit h elial an d st r om al cells b ecau s e of t h e lack of a lon g - t er m in v it r o m odel w hich can st im u lat e in v iv o ch ar a ct erist ic s , a s t h ese cells ev en t u ally fail t o pr olifer at e or cea s e t o ex pr es s differ ent iat ed fun ct ion s .

Recent ly n on tr an sfor m ed cell lin es , CUE - P an d CU S - V 2, der iv ed fr om r at en dom et r ial epit h elium an d st r om a w er e r ep or t ed . In th is st u dy , m or ph olog y of CUE - P an d CU S - V 2 w a s ex am in ed an d ox y t ocin g en e ex pr es sion by CUE - P cells w a s dem on str at ed by RT - P CR . T h e CUE - P cells h av e a cu b oidal m orph ology an d CU S - V 2 cells r es em ble fibr obla st an d ex hibit a spin dle - lik e m or ph olog y . In RT - P CR , s am e size of P CR pr odu ct s of ox y t ocin g en e at hy p ot h alam u s , u t er u s an d CUE - P cells w er e dem on str at ed . T h e se r esult s sh ow ed t hr ee dim en sion al cultu r e sy st em cou ld b e m ade by u sin g t h e n ew cell lin es .

K ey W ords : Ut eru s , Epith elium , Str om a, R at , CUS - V 2, CUE - P

# 이 논문은 1997년 한국학술진흥재단 공모과제 연구비에 의하여 연구되었음

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장기간의 배아 체외배양이 좋은 동물실험모형이라는 것은 익히 알려진 바이지만 현재까지 의 기술로는 많은 제한이 있고 실행하기가 쉽지 않다. 배아의 체외 장기배양(long - term cultu r e )은 사람의 배아를 대상으로 한 연구에서는 초기 포배기까지만 배양을 한 것이 전부 이나 동물실험에서는 기관분화를 하여 심장박동과 lim b - buddin g을 보이는 배아단계까지 배 양이 진행되고 있으며, 이는 생쥐의 전체 임신기간의 약 절반에 해당하는 기간이다(강병문 등, 1996; Kang et al., 1997). 그러나 현재까지의 모든 체외 장기배양은 배양액이나 배양물 질이 함유된 2차원의 배양용기에 시행하였기 때문에 3차원의 조직인 자궁내에서의 배아성장 과는 많은 차이가 있다. 기존의 2차원적 배양방법을 이용한 배아의 체외배양에 있어서 대표 적인 문제점은 배아가 early egg cylin der (EE C )의 단계에 이르면 중력의 작용으로 인한 자 체의 무게에 의해서 형태가 파괴되어 배아부분(em bry onic part )은 3차원적으로 자라나 배외 막부분(ex tr a - em bry onic part )은 파열되어 실험용기의 바닥에서 2차원적으로만 성장한다는 것이다(Chen & H su , 1982; Olov s son & Nils s on , 1993).

따라서 3차원적인 배양을 위해서는 상피세포(epith elium ), 기저막(bas em ent m em br ane ), 간질(str om a ) 등으로 이루어진 자궁내막과 유사한 배양체계가 필요하다. 이러한 배양체계에 대한 연구는 국외에서는 활발하나(Bentin - Ley et al., 1994; Arm ant & Kam eda, 1994;

A r s an et al., 1995 ), 국내에서는 매우 드문 실정이며 강병문 등 (1998)이 3차원 배양체계의 완성을 위한 연구의 일환으로 기저막의 일종인 M atrig el을 이용하여 생쥐배아를 3차원적 구 조하에서 체외배양을 하고 그 결과를 발표한 바 있다.

한편으로 3차원 배양체계를 위한 연구시 또 다른 문제점이 있는데, 그것은 자궁내막세포 가 채취후 체외배양시 계속 증식하지 못하고 죽거나 고유의 특성을 잃어버리고 성질이 다른 세포로 변화하는 경향이 있는 것이다. 이와같이, 자궁내막세포의 체외배양시 생체내에서와 같은 유전적 특성을 계속 유지하지 못하면 정상적인 자궁내막과 같은 기능이 소실되므로 자 궁내막 세포 상호간의 작용이나 배아의 착상 연구에 문제가 될 수 있다. 따라서 본 연구에 서는 최근에 개발된 자궁내막 상피세포와 간질세포의 세포주를 체외배양하여 생체내에서와 같은 유전적 특성을 유지하는지 알아보고자 하였다.

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재 료 및 방 법

1 . 세 포 배 양 조 건

흰쥐의 자궁내막 상피세포와 간질세포에서 기원한 CUE - P (Cem al Ut eru s E pithelial cells - P la sm id tr an sfect ed ; don at ed fr om Zin g g ), CU S - V 2 (Cem al Ut er u s S t r om al cells - r et r oVir al t r an sfect ed, clon e2; don at ed fr om Zin g g ) 세포주 (cell lin e )를 각각 100 U/ m L p enicillin (Gib coBRL , Gait h er sbu r g , M D , U S A ), 50 μg/ m L st r ept om y cin (Gib coBRL , Gait h er sb ur g , M D , U S A ), 그리고 5% F BS (Gib coBRL , Gaith er sbu r g , M D , U S A ) 또는 10%

F BS 가 첨가된 F 12/ DM E M (Gib coBRL , Gaith er sbu r g , M D , U S A ) 배양액에서 370C 또는 320C에서 배양하였다.

2 . 조 직 과 세 포 에 서 의 t ot al RN A 분 리

T ot al RNA 는 변형된 acid g u an idium ph en ol - chlor oform 방법 (Ch om zy n ski & S a cchi, 1987 )에 의해서 얻었다. 조직의 경우, 흰쥐에서 시상하부와 자궁을 떼어낸 후, 바로 tis su e t ear er 를 이용해서 s olut ion D (4 M gu anidiu m th iocy an at e ; 25 m M s odiu m citr at e, pH 7.0;

0.5% s ar cosy l; 0.1 M 2- m er capt oet h an ol )에서 각 조직을 분쇄하였다. 세포의 경우 배양액을 제거하고 Dulbecco ph osphat e buffer ed salin e (D - P BS , GibcoBRL, Gaith er sbur g , M D, USA ) 으로 세척한 후 solution D를 넣고 pipetting을 하고 나서 새로운 1.5 m L tube로 옮겨주었 다. 그리고 0.1부피의 2 M sodium acetate (pH 4.0), 1부피의 물로 포화된 페놀 그리고 0.2 부피의 chlor oform - is oam yl alcohol 혼합물(49:1)을 넣고 얼음 위에 15분간 두었다. 40C, 13000 r pm 에서 20분간 원심 분리한 후, 수성 층에 존재하는 RNA 를 1부피의 isopr opan ol로 침전시켰다. 침전된 RNA를 40C, 13000 rpm 에서 20분간의 원심분리를 통해서 모은 후, 70%

에탄올로 세척하고, 10 μL의 3차 증류수에 녹였다.

3 . 역 전 사 중 합 반 응 (RT - P CR )에 의 한 ox y t oc in m RN A 검 출

cDN A 의 합성은 t ot al RN A 를 역전사의 주형가닥으로 삼아서 무작위적 핵산육합체를 시 발체로 이용해서 이루어졌다. 역전사를 시작하기 전에 무작위적 핵산육합체(B oehrin ger , M ann h eim , Ger m any ) 100 pm ol을 포함한 RNA 용액을 750C에서 10분 동안 열을 가해서

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RNA 의 2차구조를 분리시켰다. 이후 40C에서 잠깐 원심 분리시킨 후, 이 RNA 용액을 몇 분 동안 얼음에 두었다. RNas e H-- M M LV 역전사효소(P r om eg a , W I, U S A ) 200 u nit s가 들어 간 혼합물(4μL dNT P [각각 2.5 mM ], 0.25μL RNasin [26 U/ μL , Pr om eg a, W I, USA ], 4 μL 5x 역전사효소 완충용액[Pr om ega, W I, USA ])을 RNA용액에 넣은 후, diethyl py r ocar b on at e를 처리한 물을 이용해서 최종 반응 부피를 20 μL가 되게 하였다. cDN A 합 성을 위해서 370C에서 1시간 동안 반응시킨 후, 950C에서 5분간 머물게 해서 반응을 종료 시켰다. 반응 혼합물은 40C에서 잠깐동안의 원심분리 수행 후에, - 200C에서 보관되었다.

P CR 반응은 10x P CR 완충용액(P er kin E lm er Cet u s , NJ , U S A ) 4 μL , dN T P 혼합물 3.2 μL (각각 2.5 m M ), 1U Am pli- T aq polym er as e (P erkin Elm er Cetu s , NJ , USA )가 들어간 혼합물에 역전사한 용액 2 μL를 넣은 후, 3차 증류수를 이용해 총 40 μL가 되게 해서 진 행했다. 모든 반응에서 10 pm ol의 P CR 시발체를 사용했다. 그리고 이러한 P CR 반응 혼합 물에 m in er al oil(Sigm a , St . Louis , M O, U SA ) 25 μL를 덮고 나서, P CR cy cler (P ham acia L KB , Gen e A T A Q con tr oller , NJ , U S A )를 이용해서 증폭하였다. P CR은 940C에서 1분, 550C에서 1분, 720C에서 1.5분, 그리고 마지막 cy cle에서는 720C에서 10분간 수행되었다.

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1 . CU S - V 2와 CU E - P 세 포 관 찰

흰쥐 자궁 내막세포에서 기원한 세포주인 CUE - P와 CUS - V 2의 형태는 F ig . 1과 같다.

F ig . 1의 A 는 자궁내막 상피세포에 기원한 세포주인 CUE - P 이고 F ig . 1의 B는 간질세포에 서 기원한 CUS - V 2의 형태이다. CUE - P 세포들은 cuboid 형태를 보이는 반면에 CUS - V2 세포들은 fibr oblast를 닮은 형태로 spindle - lik e한 형태를 보였다. 상피세포와 간질세포 모두 10회 이상의 게대배양 (pa s s ag e s )에도 고유의 형태를 유지하였다.

2 . 역 전 사 중 합 반 응 에 의 한 ox y to cin m R N A 검 출

자궁내막 상피세포에서 기원한 세포주인 CUE - P에서의 oxyt ocin 유전자의 발현여부를 확 인하기 위해서 ex on s A ,B 에 각각 특이적인 시발체들을 이용한 RT - P CR을 수행하였다 (F ig . 2). 양성 대조군으로 흰쥐의 시상하부와 estr u s시기의 자궁조직을 이용하였다. 2% 아 가로스겔 전기영동 결과, 시상하부 또는 자궁조직의 t ot al RNA을 이용한 RT - P CR 산물과 같은 크기의 P CR 산물을 CUE - P 를 이용한 RT - P CR에서도 확인할 수 있었다 (F ig . 3).

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자궁내막과 유사한 3차원적인 배양체계의 완성을 위해서는 자궁내막세포의 성공적인 장기 배양과 동시에 세포의 특성을 유지하는 것이 필수적이다. 이에 저자 등은, 최근에 개발된, 흰쥐의 자궁 내막세포에서 기원한 세포주인 CUS - V 2와 CUE - P를 이용하여 이들 세포주의 형태학적 측면과 유전학적인 측면을 연구하였다.

CUE - P 와 CU S - V 2 세포주를 광학 현미경으로 관찰해 보면 CUE - P 는 cub oid 형태를 가 지며, CUS - V2는 fibr obla st와 유사한 형태를 보이고 있음을 알 수 있었다. 이러한 CUE - P 와 CUS - V2는 10회 이상의 게대배양 후에도 자궁조직에서 상피와 간질세포를 1차 배양했을 때 관찰할 수 있는 형태와 유사하였다. 이러한 사실로부터 CUE - P와 CUS - V2는 체외배양 후에도 생체조직과 형태학적인 유사성을 유지하고 있음을 알 수 있다.

Ox y t ocin은 su pr aopt ic an d par av en t ricu lar n u cleu s에 위치한 h y poth alam ic m ag n ocellu lar n eu r on 에서 주로 합성되어진다고 알려져 왔다(Jir ik ov sky et al., 1988 ). 그러 나 최근의 연구에 의하면 central n erv ou s sy stem 외에도 흉선(Ar giolas et al., 1990), 부신 (A n g & J enkin s , 1984 ), 정소(Nich ols on et al., 1984), 난소 (W at h e s & S w ann , 1982) 그리고 수란관 (S ch aeffer et al., 1984)에서도 ox ytocin이 발견되었으며, 흰쥐의 태반과 자궁에서는 그 유전자의 발현이 확인되었다(Lefebvr e et al., 1992).

본 실험에서는 CUE - P 세포주에서 ox yt ocin 유전자가 전사되어 m RNA를 실제로 형성하 는 지를 알아보기 위하여, 흰쥐의 ox ytocin 유전자 중, ex on A에서 sen se prim er를 선택하 고, ex on B에서 antis en s e prim er를 선택하여(Iv ell & Richt er , 1984) g enom e상의 유전자가 P CR에 의하여 검출되는 가능성을 배제하였다. 그리고 시상하부와 자궁조직을 양성 대조군 으로 이용하여 P CR 산물의 크기를 비교하였다. 이들 양성 대조군 조직과 CUE - P 세포주에 서 얻은 tot al m RNA를 이용하여 RT - P CR을 수행하였고 그 결과 CUE - P을 이용한 RT - P CR에서 시상하부와 자궁조직을 이용한 것과 동일한 크기의 P CR 산물을 확인할 수 있었다. 이는 체외배양 세포주인 CUE - P가 생체 내 자궁조직과 동일한 유전적 특성을 가지 고 있음을 알 수 있는 증거이다. 따라서 이 세포주를 이용한 3차원적인 체외배양체계의 연 구가 다음 과제가 될 것이고 이를 이용하여 최종적인 목표인 배아의 착상연구를 위한 모형 을 완성시킬수 있을 것이다.

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본 연구는 생식에 중요한 역할을 하는 자궁내막의 상피세포와 간질세포의 상호작용을 체

외에서 연구하는데 유용하게 이용될 것으로 사료되는 체외배양 세포주인 CUE - P 와

CU S - V 2의 형태학적이고 유전학적인 특성을 살펴보았다. 결과 이들 체외배양 세포주는 생 체내 조직과 형태학적 유사성을 유지하고 있으며, 유전학적으로도 동일한 특성을 지님을 확 인할 수 있었다. 그러므로 이들 체외배양 세포주를 이용하면 복잡한 환경하에 놓여있어 연 구가 힘들었던 자궁내막 상피세포와 간질세포의 상호관계를 연구하는데 많은 도움이 될 것 이며 3차원적 배양체계의 완성을 위한 가장 중요한 여건을 충족시킬 수 있을 것이다.

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B

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◀ 216bp

L an e 1 2 3 4

F ig . 3. D em on st r ation by RT - P CR of ox y t ocin g en e ex pr es sion by CU E - P cells . T h e calcu lat ed size s of t h e pr edict ed pr odu ct s fr om P CR r eact ion s ar e 216bp . L an e 1

참조

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