분자광학이미징을 통해 이해하는 신경세포 시냅스의 기능

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molecular and cellular Biology Newsletter

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^●^●분 자 세 포 생 물 학 뉴 스 레 터

“Seeing is believing”, “듣는 것이 보는 것만 못하다” “白文不如一見”.

우리 주변에서 흔히 듣고 접해본 문구들이다. 모두들 한 가지를 이야기 하고 있다. 바로 시각적으로 인식하는 정보 의 전달이 무엇보다 강력하고 효과적이라는 것이다. 지리산 정상 천왕봉에서 내려다본 광경과 그랜드 캐년의 웅장한 계 곡을 백마디의 말보다 한장의 사진 혹은 동영상으로 전달하 는 것이 보다 효과적일 것이다. 그만큼 이미징을 통한 정보 의 전달이 간편하면서도 강력하다는 것을 알기 때문이다.

이러한 현상은 생명과학연구에서도 일찍이 시작되었고, 최 근의 광학기술 전반의 급속한 발전과 그에 상응하는 광학센 서의 발전은 실시간 세포속에서 일어나는 미세한 변화와 기 능의 이해가 가능하게 되었다. 본 기고문에서는 현재 생명 과학에 많이 사용되는 분자광학기술(광학기기와 광학센서) 을 간략히 소개하고, 그 분자광학기술이 머리 속 신경세포 시냅스의 생리적 기능을 연구하고 이해하는데 어떻게 사용 되고 있는지 이야기 해 보고자 한다.

분자광학이미징

광학이미징의 3대 요소 : 광학 현미경(광학기기), 카메라(

기록기기), 생물표본(광센서)

생명과학 연구를 위한 광학이미징에는 크게 3가지 요소가 필요하다. 첫번째는 눈으로 관찰을 위한 물리적 광학기기인 현미경이고, 두번째는 눈으로 관찰된 이미지를 기록할수 있 는 기기인 카메라, 그리고 마지막으로 관찰 목적물질로 광 학센서가 처리되어 있거나 이를 가지고 있는 생물표본이다.

이 3가지에 대해서 살펴보자.

1. 광학 현미경

16세기 얀센에 의해 최초 현미경이 발명되고 난 후, 지금 까지 무수한 발전을 이루며 여러 과학자들에게 노벨상을 안 겨주었다. 현재는 다양한 실험방법과 목적에 따라 여러 종 류의 광학 현미경이 이용되고 있다. 여기에서는 생명과학연 구에 일반적으로 사용되는 광학현미경에서 초정밀 현미경 까지 간단하게 소개해 보고자 한다.

1-1. Wide-field fluorescence microscopy (형광현미경) 형광현미경은 가장 보편적으로 사용되는 광학현미경으 로 세포 수준에서 세포소기관 혹은 단백질 등의 분포 등을 확인하는데 사용된다. 다양한 파장의 형광필터와 Mercury Arc나 Metal halide 램프를 이용하여 다양한 컬러(녹색, 빨

분자광학이미징을 통해 이해하는 신경세포 시냅스의 기능

김 성 현

경희대학교 의과대학 생리학교실 E-mail: [email protected]

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강색, 파랑색 등)의 이미징이 가능하다. 다른 기능의 현미경 (confocal microscopy, TIRFM 등)들도 기본 몸체는 일반 형광현미경을 바탕으로 하고 있다. 고가의 특수기능 현미경 보다는 가격면에서 경제성이 있어 일반 개인 연구실 수준에 서 설치 및 운영이 가능하고 다양하게 응용하여 사용 가능 하다. 굳이 단점을 찾아본다면 이미지의 초점 이외 지역에 서 발생된 형광에 의해 배경 노이즈가 발생 할 수 있다는 것 과 조직(tissue)등의 두꺼운 재료를 관찰하는데 한계가 있을 수 있다는 것이다. 하지만 논문에 싣고자하는 대부분의 단 일세포수준의 사진들은 이 형광현미경에 의해 무난하게 제 작될 수 있다.

1-2. Confocal Microscopy (공촛점 현미경)

공촛점 현미경은 이름 뜻 그대로 촛점이 맞춰진 지역 ( 공촛점)의 이미지만 기록하고 그 이외 지역(out of focus) 의 형광신호는 제거되어 깨끗한 이미지를 얻어 낼 수 있다.

또한 동시에 Z-축의 변화를 통해 일반 형광현미경에서 얻 기 힘든 표본의 3차원 입체이미지를 구성 할 수도 있다. 예 를 들면 관찰하고자 하는 단백질 혹은 세포소기관을 다양한 Z-축으로 이미징하여 세포내 3차원적 분포를 관찰 할 수 있다 (세포소기관의 위치와 그 특이 단백질, 세포막 단백질 등). 뿐만아니라 일반 세포보다 두꺼운 샘플 (조직 절편)의 관찰도 Z-축의 변화를 통해 가능하여 조직 관찰에 널리 사 용된다.

1-3. Multiphoton Microscopy (다광자 현미경)

Confocal Microscopy에서 한단계 진보한 것으로 특수한 파장과 빈도수의 광원(예, femtosecond laser)을 이용하여 confocal microscopy보다 더 효율적으로 두꺼운 샘플의 내 부 이미징이 가능하다. 주로 신경과학분야에서 살아있는 동 물의 뇌 이미징이나 두꺼운 뇌 조직 (Brain slice)의 관찰에 많이 사용된다.

1-4. TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy 전반사 형광현미경)

빛의 굴절 및 반사의 성질과 현미경의 특수 렌즈 [높은

N.A.(numeric aperture)] 성질을 이용하여 이미징 가능한 영역이 샘플 바닥에서부터 100nm이내의 지역으로 제한되 어 관찰하는 형광 현미경이다. 표본 바닥에 존재하는 세포 부착단백질(cell adhesion molecule)과 세포막의 다이나믹 스를 관찰하는데 매우 유용하다.

1-5. Super-resolution Microscopy (초정밀 현미경) 일반 광학 현미경으로는 두 물질간의 거리에 따른 구별 에 한계가 존재한다. 즉 두 물체가 어느 거리 이하의 간격 에 있을때 광학현미경으로는 구분해 낼 수 없다. 이러한 구 별의 한계는 광학자인 Ernst Abbe에 의해서 확립(Abbe’

s law: 아베의 법칙) 되었고 그것을 diffraction limit (회 절한계)라 한다. 하지만 최신의 광학기술과 형광물질의 발 달로 인하여 이러한 회절한계를 뛰어넘는 현미경이 개발 되었으니 바로 super-resolution microscopy이다 (이 기 술은 Eric Betzig, Stenfan Hall, William Moerner에게 2014년 노벨 화학상을 안겨주었다). 지금까지 대략 세가지 의 방법에 의한 회절한계 (diffraction limit)를 극복한 초 정밀 현미경이 개발되었다. 그러한 현미경으로는 PALM (Photoactivated localization microscopy) 혹은 STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy), STED (Stimulated emission depletion), 그리고 SIM (Structured illumination microscopy)이 있다. 단백질- 단백질 상호작용을 하나의 단백질 수준으로 이미징 하여 3 차원으로 재구성이 가능하다.

1-6. Lightsheet Microscopy

Lightsheet Microscopy는 광원의 방출 형태와 렌즈의 배치를 변형하여 샘플의 한 면을 이미징하는 현미경으로 샘 플의 다양한 부분 이미징을 통해 3차원 이미지를 구성해 낼 수 있다. 해상도가 비교적 높지 않아도 되는 이미징에 많이 쓰이고, 전체 샘플의 입체구조(예, 예쁜꼬마선충, 초파리 유 충)를 관찰,분석하는데 매우 유용한 현미경이다.

2. 이미지의 기록: 카메라

아무리 좋은 광학현미경이 있다 하더라도 눈(binocular)

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에 보이는 것을 제대로 기록하지 못한다면 아무 의미가 없 다. 현미경의 영상을 기록하기 위해 1990년대~2000년때 초 반까지만해도 국내에서는 고감도 필름이 들어있는 아날로그 카메라를 현미경에 부착하여 수분에서 수십분까지 이미지를 노출해 세포사진을 찍고 암실이나 사진관을 통한 현상으로 그 결과를 확인하곤 하였다. 디지털 기술의 발달은 이 모든 것을 바꿔 놓았다. 이미징 자체의 발전에 큰 원동력이었다.

일상생활에서는 개인 디지털 카메라나 DSLR의 붐을 일으켰 고 이제는 주머니속 스마트폰에 기본으로 장착되어 늘 함께 하고 있다. 연구용 카메라도 CCD 카메라, EMCCD 카메라, sCMOS 카메라등이 개발되면서 보다 선명하고 다양한 고화 질 영상부터 live-cell imaging을 통하여 살아있는 세포, 조 직, 동물의 관찰이 가능하게 되었다. 여기서는 실험에 쓰이 는 카메라에 대해 간단히 소개 보고자 한다.

2-1. CCD camera (Charged-coupled device camera) 카메라 내부에는 실리콘으로 구성된 CCD chip이 있다.

이것이 광(photon)을 전자기적 신호(electron charge)로 전환하여 디지털화 시켜 이미지를 화면에서 다시 볼 수 있 게 한다. 결국 이 CCD의 개발은 아날로그 방식의 이미지 디스플레이를 거의 대체할 수 있게 되었고 이것을 개발 한 두 물리학자(George Smith and Willard Boyle)에게 2009년 노벨 물리학상을 가져다 주었다. 이러한 디지털 카 메라에는 광입자신호를 전자기 신호로 전환시키는 효율인 QE(Quantum Efficiency)라는 것이 있는데 이 효율이 높 을 수록 좋은 감도의 카메라라고 말 할 수 있다. 인간의 눈 이 대략 5~10%의 QE를 가지고 있다고 알려져 있는데 좋은 성능의 CCD 카메라는 QE가 ~40%에 이르는 것으로 알려 져 있다.

2-2. EMCCD camera (Electron-multiplying CCD camera)

CCD camera에 더 진보된 기술이 결합되어 영국의 Andor technology에서 최초 개발한 카메라이다. 일반적 인 CCD camera에서 광자(photon)가 전자기(electron charge)로 변환되어 이동하는 과정(readout)에서 특수 기

술을 이용하여 전자기(electron charge)의 개수를 증폭 (multiplying)한다. 이러한 기술을 기존의 30~40% QE를 거의 95% 이상의 QE를 가능하게 하였다. 이 카메라의 개발 로 높은 효율의 이미징이 가능하게 되었고 단백질 하나 수 준의 이미징이 가능한 super-resolution microscopy에도 중요하게 사용되어지게 되었다.

2-3. sCMOS camera (scientific CMOS camera)

CMOS camera는 CCD camera와 유사한 방식을 사용하 는 카메라이나 이미지의 프로세싱 속도가 매우 빠르다. 하 지만 실제적인 이미지의 품질은 CCD보다 조금 모자란 것 으로 알려져 있었다. 최근에는 기술발달로 QE가 많이 향상 된 scientific CMOS가 개발되었는데 이것이 바로 sCMOS camera이다 높은 QE에 빠른 이미지 프로세싱까지 더해져 칼슘이미징과 같이 빠른 속도의 이미징을 요구하는 실험에 용이하다. 또한 기능면에서는 EMCCD와 유사하면서도 가 격면에서는 매우 경제적이어서 앞으로 더욱 많이 사용 되어 질 것으로 예상되고 있다.

3. 생물표본(광센서)

“광센서”라고 하면 다양한 종류가 있으나 여기에서는 형 광 현미경으로 관찰 가능한 형광센서에 한해 다루도록 하겠 다. 1960년 시모무라 오사무에 의해 해파리에서 형광단백질 (녹색형광단백질; Green Fluorescent Protein or GFP)이 최초 분리된 이래 이제는 생명과학 이미징에서는 없어서는 안되는 아주 중요한 물질이 되었다 (Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Tsien 이상 세명은 GFP의 발견, 적용, 보급에 큰 역할을 수행하여 2008년 노벨 화학상을 수 상). 여기에서는 이러한 형광단백질을 기본으로 하는 다양 한 형광센서에 대해 소개해 보고자 한다.

3-1. Fluorescent Proteins (FPs: 형광단백질)

시모무라에 의해 처음 추출된 GFP는 컬럼비아 대학의 마틴 찰피박사가 실험동물(예쁜 꼬마 선충)에 최초로 적용 하면서 생물학 실험에 사용가능하다는 것이 알려지게 되었 다. 이를 통해 유기화학자 로져 첸은 녹색뿐만 아니라 다양

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한 색의 형광단백질이 있다는 것을 알아냈고 그 다양한 형 광단백질을 생물학 실험에 사용 가능하도록 변형하여 보급 하였다. 그 결과 현재 생명과학 실험에 다양한 무지개 빛 깔의 형광단백질들이 사용되게 되었다 (GFP, YFP, RFP, mCherry, mBanana, mOrange…). 다양한 색깔의 이러한 형광단백질은 여러 단백질에 유전자 재조합기법으로 붙여 져 세포내에서 타겟단백질의 분포, 이동, 변화 등을 관찰하 는데 널리 사용된다.

3-2. Photoactivatable GFP (PA-GFP, 광-활성화 녹색형 광단백질)

광활성화성 형광단백질. 녹색형광단백질의 변형된 형태 로 형광을 가지기 위하여 일정한 계열의 빛을 조사해 주어 야만 활성을 가져 형광을 띄게 된다. 여러가지 응용되어 사 용될 수 있는데 예를 들면 일정시간 동안만 활성화 한 목적 단백질의 움직임, 이동, 확산등을 관찰하는데 유용하게 쓰 일수 있다. 또한 super-resolution microscopy중 STORM 이나 PALM계열의 초정밀 이미징에 이용될수 있다.

3-3. Photoconvertible Fluorescent Proteins (광전환 형광 단백질)

PA-GFP와 일부 유사하지만 광전환형광단백질은 하나 의 형광색에서 빛의 조사를 통해 다른 형광색으로 변환하여 나타나는 형광단백질이다. 예를 들어 녹색형광을 띄는 단백 질의 세포 일부지역에 일정한 계열의 빛 (예, 자외선 계열 330-380nm)을 조사해 주면 그 지역만 색깔이 빨강형광단 백질로 전환 (Photoconversion) 되어 나타나는 것을 관찰 할 수 있다. 이것은 실시간으로 단백질의 이동, 분해등을 관 찰하는데 유용하다. Dendra, Kaede, dronpa, mEOS2 등 이 여기에 해당한다.

3-4. pHluorin

GFP단백질의 무작위 변형을 통해 만들어진 형광단백질 로 pH의 변화에 따라 형광의 밝기가 달라지는 pH 센서이 다. pKa값이 7.1을 가지고 있고 pH 5.5 에서 거의 형광을 읽게 되고 pH7.4에서 형광이 20~25배가 밝아진다. 소포

낭의 연구나 세포막 다이나믹스 (endocytosis, exocytosis) 세포질내의 pH변화, 막 단백질의 이동등에 유용하게 사용 될 수 있다.

3-5. GCaMP or GECI (Genetically encoded Calcium indicator: 칼슘 센서)

GFP와 칼슘 부착 단백질 (Calmodulin, MLCK)의 일부 지역을 서로 혼합 변형하여 칼슘을 인지하였을때 형광을 띄 게 개발된 칼슘 센서이다. 2000년대 초반 최초의 GCaMP 가 개발된 이후 꾸준이 효율이 향상된 GCaMP가 개발되어 현재 GCaMP6 까지 이르고 있다. 최근에는 칼슘조절의 중 요 세포소기관이으로 타겟팅 하는 신호를 부착하여 세포 소 기관의 칼슘변화를 측정하는데 이용하기도 한다.

3-6. Voltage Sensor

신경세포나 심근세포등 세포내의 전기적 신호의 변화를 측정하는 이미징 센서이다. 미생물의 Archaerhodopsin을 근간으로 해서 개발이 이루어 지고 있으나 이것 이외에도 다양한 것을 바탕으로 지속적으로 새로운 버전의 센서 개발 이 이루어지고 있는 것으로 알려져 있다. 이것을 이용하여 신경세포 각 지역에서 활동전위(action potential)를 측정 할 수 있다.

분자광학이미징을 이용한 신경세포 시냅스의 기능 연구

1.개요

우리의 뇌는 약 1000억개의 신경세포로 정교한 서킷 을 이루며 구성이 되어 있다. 서로 연결된 신경세포는 시 냅스라는 접합부분을 형성하고 그곳을 통하여 신경정보 의 흐름이 이루어 지고 있다. 그러한 신경정보는 바로 전기 적 활성인 활동전위(action potential)의 흐름과 화학적 신 호 (neurotransmission)전달의 연속이다. 즉 전기적 신호 와 화학적신호 그리고 다시 전기적 신호로 변환의 연속으 로 구성된다. 신경정보전달은 전시냅스 말단 (presynaptic

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terminal)에서 후시냅스 (post-synapses)로 이루어지며 이러한 시냅스의 생리적 기능이해는 궁극적으로 뇌기능 이 해의 첫 발걸음이라 하겠다. 전통적으로 신경생리 연구에는 전기생리학(electrophysiology) 방법이 주를 이루어 왔지만 최근의 발전된 이미징기술은 현미경을 통해서도 시냅스의 생리적 기능을 이해할 수 있게 하였다. 여기에서는 앞서 소 개한 분자광학이미징을 이용한 전시냅스 말단 (presynaptic terminal)의 기능 조절 연구에 대해 소개해 보겠다.

2.전시냅스 말단(Presynaptic Terminal)의 기능 및 구조

하나의 전시냅스 말단에는 신경전달물질로 채워져있는 시냅스낭이 약 100~200여개가 존재한다.전시냅스 말단 에 활동전위가 도달했을때 이것을 인지한 칼슘채널이 열리 게 된다. 유입된 칼슘은 시냅스낭에 존재하는 칼슘인식 단 백질(synaptotagmin1)에 의해 인식이 되고 그것은 시냅스 낭과 세포막 단백질에 존재하는 SNARE 단백질들이 복합체 (complex)를 형성을 유도하여 세포막과 연합(fusion)이 되 면서 신경전달물질이 분비 되게 된다. 그렇게 연합된 시냅 스낭은 다시 세포내유입작용(endocytosis)에 의해 재생성 이 이루어지고 이것을 통해 지속적인 시냅스 커뮤니케이션 을 가능하게 한다.

3.이미징을 통한 전시냅스말단의 기능이해

이제 분자광학이미징을 이용한 신경세포 시냅스의 생리 적 기능 연구에 대해 살펴보자. 시냅스의 기능관찰을 위해 서는 광학기기로 형광현미경이나 confocal microscopy와 고속의 높은 효율을 가진 EMCCD나 sCMOS 카메라, 그리 고 몇가지 광센서(pHluorin, GCaMP, Voltage sensor)가 필요하다.

3-1. synaptic transmission and synaptic vesicle retrieval 시냅스낭이 액티브존의 세포막과 연합(fusion)되고 다시 리사이클되는 것을 실시간으로 모니터링하는 효과적인 방 법으로는 synaptopHluorin 또는 vGlut-pHluorin assay 가 있다. 앞서 설명한 pH센서 형광단백질인 pHluorin을 시 냅스낭 막단백질 (예, vGlut1)의 시냅스낭내부(lumen)에 위 치하게 재조합 단백질 (vGlut-pHluorin)을 만들어 신경세 포에 발현을 시킨다. 발현된 광센서는 시냅스낭 내부의 산 성의 조건에서 형광을 잃고 있다가 활동전위에 의한 세포막 과의 연합 (fusion)을 통해 외부에 노출되어 pH의 변화로 밝기가 증가하게 된다. 이 과정의 실시간 관찰 및 분석을 통 하여 synaptic transmission을 측정할 수 있다. 또한 세포 막과 연합(fusion) 후 세포내 유입현상(endocytosis)에 의 해 재형성된 시냅스낭은 재-산성화 과정에 의해 다시 형광 을 잃게 된다. 이것의 실시간 관찰 및 분석을 통하여 시냅스 낭 재형성의 효율을 분석해 낼수 있다.^{2, 3}

그림 1.

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3-2.전시냅스 Ca²⁺ 다이나믹스

전시냅스 말단에 들어오는 칼슘은 시냅스낭의 분비와 직 접적인 연관이 있다. 아무리 강하고 지속적인 활동전위가 전시냅스 말단에 전달 되더라도 시냅스 안으로 칼슘의 유 입이 안되거나 시냅스낭의 칼슘 인지 단백질에 문제가 생 겨 인지가 되지 않으면 시냅스낭은 외부로 분비 되지 않 는다. 이렇듯 칼슘 다이나믹스의 정확한 모니터링은 시냅 스 기능조절을 이해하는데 매우 중요하다. 앞서 소개하였 던 GCaMP6라는 최신 칼슘센서를 시냅스낭 단백질에 부 착(synaptophyin-GCaMP6)하여 활동전위에 따라 시냅 스의 칼슘 다이나믹스 (칼슘유입과 제거)를 고감도와 초 스피드로 모니터링 할 수 있다4, 5. 또한 다양한 칼슘채널 antagonist와 칼슘 킬레이팅제 (BAPTA, EGTA)를 이용하 여 자세한 기전도 연구 할 수 있다.

3-3.신경 활동전위 (action potential) 관찰

신경 활동전위를 직접적으로 관찰하는 것은 신경세포 기 능의 이해에 중요한 요소이다. 앞서 소개한 voltage sensor 인 Archaerhodopsin를 이용하여 1000분의 1초 동안 아주 빠르고 짧게 이루어 지는 신경활동전위(action potential) 를 다양한 신경세포 부위 (몸체, Node of Ranvier, AIS;

Axon Initial Segment, 시냅스 말단)에서 관찰 및 측정이 가능하다⁶.

요약해 보면, 이러한 분자광학이미징을 이용하여 시냅스 에서의 활동전위, synaptic transmission, 시냅스 칼슘다 이나믹스, 시냅스낭 재형성등을 종합적으로 관찰 할 수 있 다. 이러한 종합적 관찰은 시냅스 기능 조절의 중요 요인과 기전을 이해하여 우리 뇌기능 이해로 확장 할 수 있을 것이 고 또한 시냅스 기능이상에 의한 신경계 질환의 병리적 원 인의 이해까지 확장해 볼 수 있을 것이다. 물론 아직까지 남 아있는 과제들도 있다. 우리 뇌에 있는 다양한 종류의 신경 세포 특이적으로 이러한 기능을 연구하는데는 아직 한계가 있다. 하지만, 연구자들의 지속적인 노력은 이러한 문제들 도 앞으로 해결해 나 갈수 있을거라 생각해 본다.

[ 참고문헌 ]

1. Kim, S.H. & Ryan, T.A. CDK5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron 67, 797-809 (2010).

2. Kim, S.H. & Ryan, T.A. Synaptic vesicle recycling at CNS snapses without AP-2. J Neurosci 29, 3865-3874 (2009).

3. Sankaranarayanan, S. & Ryan, T.A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat Cell Biol 2, 197-204 (2000).

4. Chen, T.W. et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature 499, 295-300 (2013).

5. Kim, S.H. & Ryan, T.A. Balance of Calcineurin Aalpha and CDK5 Activities Sets Release Probability at Nerve Terminals. J Neurosci 33, 8937-8950 (2013).

6. Hoppa, M.B., Gouzer, G., Armbruster, M. & Ryan, T.A. Control and plasticity of the presynaptic action potential waveform at small CNS nerve terminals.

Neuron 84, 778-789 (2014).

김 성 현

저 | 자 | 약 | 력

1994-2000 성균관대학교 유전공학과 학사 2001-2002 광주과학기술원 생명과학과 석사 2002-2007 광주과학기술원 생명과학과 박사 2007-2011 코넬의과대학 박사후 연구원 2011-2013 코넬의과대학 전임강사

2013-현재 경희대학교 의과대학 생리학교실 조교수