Fabrication of Blended PCL/β-TCP Scaffolds by Mixture Ratio of β-TCP using Polymer Deposition System

폴리머 적층 시스템을 이용한 β-TCP 혼합 비율에 따른 PCL/β- TCP 인공지지체의 제작

Fabrication of Blended PCL/β-TCP Scaffolds by Mixture Ratio of β-TCP using Polymer Deposition System

하성우¹, 김종영^1,

Seong-Woo Ha¹ and Jong Young Kim^1,

1 안동대학교 기계공학과 (Department of Mechanical Engineering, Andong National University)

 Corresponding author: [email protected], Tel: +82-54-820-5669 Manuscript received: 2014.2.26 / Revised: 2014.6.12 / Accepted: 2014.6.23

Abstract Scaffold used as a carrier of the cell has been actively conducted using plenty of technology in tissue engineering. β-tricalcium phosphate (β-TCP) material has shown good biocompatibility and osteoconductive ability when it was implanted as a bone graft substitute in osseous defect in human and animal studies for bone regeneration. In this study, we fabricated the blended polycaprolactone (PCL) and β-TCP scaffold by the polymer deposition system (PDS).

The PCL/β-TCP scaffold was fabricated at a temperature of 110℃, pressure of 650 kPa, and scan velocity of 100 mm/sec. The Overall geometry and size of the scaffold were fixed circle type with a diameter of 10 mm and a height of 4 mm. PCL/β-TCP scaffold was observed by scanning electron microscopy. Cell attachment and proliferation of the scaffold containing 30 wt% β-TCP was superior to those containing 10 wt% and 20 wt% β-TCP.

Key Words: Polymer Deposition System (폴리머 적층 시스템), Scaffold (인공지지체), Polycaprolactone (폴리카프로락 톤), β-Tricalcium Phosphate (베타삼인산칼슘)

1. 서론

최근 조직공학 분야에서는 다양한 재료들을 이 용하여 인공지지체를 제작하는 연구가 활발히 이 루어지고 있다.^1,2 조직공학 (Tissue engineering) 은 손상된 조직이나 기관의 복원을 도울 수 있는 생 체물질, 생물학적, 그리고 공학적인 기술을 다루는 학문을 기반으로 한 의료분야의 중요한 기술로 알 려져 왔다. 그래서 생체의 손상된 기능을 복원, 유

지, 그리고 향상 하는 것을 목적으로 한 다양한 방법이 연구되고 있다.^3-6 조직 공학을 이용하여 조 직 재생에 필요한 인공지지체는 세포, 성장인자와 함께 중요한 3대 요소 중 하나로 정의된다. 이러 한 조직의 회복 및 재생을 위해 제작된 인공지지 체는 세포의 원활한 증착과 증식이 이루어지도록 유도하는 것이 필수적이다. 인공지지체 제작에 필 요한 재료들은 생분해성 (Biodegradability)과 생체 적합성 (Biocompatibility)의 성질을 가지고 있어야 __________

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하며, 골과 유사한 기계적 특성도 지니고 있어야 한다. 그리고 조직의 회복 및 재생을 위해 제작된 인공지지체는 우수한 공극을 가지는 내 외부 구조 에 주입 된 세포가 부착 및 분화, 그리고 증식에 적합한 환경을 제공해야 한다.^7-10 많은 연구자들이 현재 다양한 생체적합성 재료를 이용하여 조직의 특성에 맞는 인공지지체 제작을 위한 연구를 수행 하고 있다.^11,12 인공지지체 제작을 위해 주로 사용 되는 고분자 재료로는 천연고분자와 합성고분자 재 료로 분류된다. 천연 물질, 동물, 그리고 인체에서 유래한 천연고분자 재료는 타 재료에 비해 우수한 생체적합성을 지니고 있으며 독성이 없다는 장점을 가지고 있다. 그 종류에는 젤라틴 (Gelatin), 콜라겐 (Collagen), 피브린 (Fibrin), 엘라스틴 (Elastin), 그리 고 알긴산 (Alginate) 등이 있다. 천연고분자에 비해 합성고분자 재료는 비교적 값이 싸고 기계적 특성 이 우수하며, 생체 내에서 가수 분해되거나 효소에 의해 분해되어 이상적인 지지체용 고분자로의 장점 을 가지고 있다. 대표적인 합성고분자 재료에는 Poly(ε-caprolactone) (PCL), Poly(lactide-co-glycolide) (PLGA), Poly(lactic acid-co-ε-caprolactone) (PLCL) 등이 있다. 특히, 골 조직 재생을 위해 사용되는 고분자 재료인 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone, PCL)과 바

이오 세라믹 재료인 트리칼슘 포스페이트

(Tricalcium phosphate, TCP), 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite, HA)를 이용하여 골 조직 재생을 위한 인공지지체를 제작하고 있다.^13-17 인공지지체 제작에 쓰이는 많은 재료 중에서 주 재료로 사용 되고 있는 PCL은 메틸기를 갖는 구조적 성분 때 문에 소수성 (Hydrophobic) 특성을 가지고 있다. 재 료의 특성 중 친수성 (Hydrophilic)과 소수성은 인 공지지체에 세포 초기 증착을 위해 중요한 요소이 며, 소수성 일수록 배지나 다른 체액의 젖음성이 좋지 않아 세포 증착에 어려움이 있다.^18-20 골 조 직 재생을 위한 바이오 세라믹 재료인 β-TCP는 뼈 와 치아의 무기질과 같은 비슷한 조성을 갖고 있 어 구조적으로 안정성을 띄고 있다. 또한, 인체 내 에서 신생 골 성장과 동시에 완전히 흡수되는 장 점을 가지면서 그 어떤 재료보다 생체 친화성과 활성이 뛰어나다고 알려져 왔다.^21-23 하지만 고체 로 이루어져 있어 열을 이용하여 제작할 수 있는 고분자 재료에 비해 바이오 세라믹 재료는 파우더 로 이루어져 있어 고분자로 만들어진 인공지지체 보다 기계적 강도가 떨어지는 단점을 가지고 있다.

또한, 재료가 파우더로 구성되어 있어 내부 공극

이 우수한 3차원 인공지지체를 제작하는 데에 많 은 어려움이 있다. 그래서 이를 보완하고자 세라 믹 재료를 고분자 재료와 혼합하여 제작하는 연구 가 많이 이루어지고 있다.^24,25

본 연구에서는 고분자 재료인 PCL과 바이오 세라믹 재료인 β-TCP를 혼합한 3차원 인공지지체 를 제작하였다. 외부 형상이 지름 10 mm, 높이가 4 mm인 원형 타입의 인공지지체는 280 μm의 선 폭을 가지며 250 μm의 내부 공극을 가지고 있다.

이렇게 제작된 인공지지체는 조직 재생 적용을 위 해 기계적 강도 및 세포 실험 평가를 수행하여 골 적용 가능성을 평가하였다.

2. 재료 및 방법

2.1 폴리머 적층 시스템

본 연구에서는 폴리머 적층 시스템 (polymer deposition system)을 이용하여 고분자 재료와 바이 오 세라믹 재료가 혼합된 3차원 인공지지체를 제 작하였다. 폴리머 적층 시스템은 마이크로 단위의 원하는 3차원 형상 구조물을 제작하기 위한 시스 템으로서 정밀하고 신속한 제어를 가능하게 한다.

또한 공압, 온도, 그리고 이송속도에 따라 적층 되 는 재료의 선폭과 선 높이를 결정지을 수 있는 장 점을 가지고 있으며, 2축의 적층헤드로 장착 되어 있어 다양한 구조물을 빠르게 제작할 수 있다. 먼 저 인공지지체를 제작하기 위해 공압을 제어하도 록 하는 디스펜서 (Super x-V7, Musashai, Japan)와 공압을 공급 시켜주는 에어 콤프레샤 (S50-50-5.5, airssen, Japan)를 사용하였고, 디스펜서를 통해 최대 700 kPa의 압력 조절을 가능하게 하였다. 시린지에 열을 가해 주기 위한 기기로는 서모마스터(TC U- 02, MUSASHI, Japan)를 사용하여 최고 250℃까지 온도 조절을 가능하게 하였다. 그리고 정밀한 인

Fig. 1 The image of polymer deposition system

공지지체 제작을 하기 위해 정밀 분사 시스템 헤 드 부분 Z 축을 볼 스크류 (BNK0802-3RRG0+155 LC5Y, Samick THK, Korea)와 AC 서보 모터 (SGMAS, Yaskawa, Korea)를 이용하였으며, X, Y 축 에는 리니어 엔코더 (ST36D, Mitutoyo, Japan)와 리 니어 모터 (IL06-075A1C1, Kollmorgen, England)로 이용되어 높은 정밀도를 구현하였다. GMS회사로부 터 제작된 모션 제어 시스템을 구축하여 정밀한 구동을 할 수 있도록 하였고 G-code를 통해 X-Y-Z 축의 모션을 제어하였다.

2.2 재료 및 분석

인공지지체 제작에 사용된 고분자 재료인 PCL (Average Mn 45,000) 은 Sigma Aldrich 에서 구매하 였다. 바이오 세라믹 재료인 β-TCP는 Berkeley Advanced Biomaterials 에서 구매하였다. 제작된 인 공지지체는 스퍼터링 (Sputtering) 장치를 이용하여 골드 코팅 후, 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy, Tescan VEGA II LMU, Czech)을 이용하 여 관찰하였다.

2.3 인공지지체 특성 평가

인공지지체의 특성을 평가하기 위해 기계적 강 도 실험과 세포 증식 평가를 수행하였다. 먼저 제 작된 인공지지체의 기계적 강도를 평가하기 위해 압축시험기 (JSV H1000, KISC, Japan)를 이용하였다.

PCL과 β-TCP가 혼합된 인공지지체는 원형 타입으 로 지름이 10 mm, 높이가 4 mm로 제작되었으며, 이에 맞게 압축시험기 특성 부분을 설정하였다.

그리고 제작된 인공지지체를 혼합 비율에 따라 각 3개의 샘플을 준비하여 0.1 mm/min의 속도로 10 mm의 면적에 하중을 주었다. 결과로 압축시험 기 프로그램을 통해 응력-변형률의 그래프와 데이 터 값을 얻었으며, 3개 샘플의 평균값으로 계산하 였다.

다음 세포 증식 평가를 하기 위해 인공지지체 를 70% 에탄올을 이용하여 클린벤치에서 4시간 동 안 자외선으로 살균하였다. 그리고 PBS를 이용하여 인공지지체의 표면을 씻어 주었고, 배지에 2시간 동 안 넣어 표면에 세포들이 잘 증착 될 수 있도록 하 였다. 세포를 주입한 인공지지체는 7일 동안 인큐베 이터에서 배양을 시켰고, 1, 4, 7일에 거쳐 CCK-8 용 액을 이용한 세포 증식 평가를 진행하였다. 이때, 세포 증식 평가를 하기 위해 Microreader (UVM340, Elisa, USA)를 이용하였다.

Table 1 Process condition of PCL/β-TCP scaffold Condition PCL/β-TCP scaffold

Nozzle 250 μm (Precision nozzle) Pressure Avg. 650 kPa

Temperature 110 ℃

Scan velocity 180 mm/sec

Type Circle Overall size Diameter : 10 mm, Height : 3.5 mm

Line with 280 μm ± 20 μm Pore size 250 μm ± 10 μm

Fig. 2 Fabrication process of blended PCL/β-TCP scaffold 2.4 세포 배양

인공지지체의 세포 증식 평가를 하기 위해 MG-63 세포를 배양하였다. 세포 배양에 있어 배지 는 DMEM (D-minimum essential medium/high glucose, Hyclone, USA)과 10% FBS (Fetal bovin serum, Gibco, Rockvile, USA), 그리고 1% PS (Penicillin streptomycin, Sigma, USA)를 혼합하여 만들었다. 원활한 세포 배 양을 위해서 37℃의 온도와 5% CO2의 환경을 가 지는 인큐베이터에 배양 되었으며, 일정한 주기를 가지고 배지 교체 및 계대 배양을 하였다. 그리고 배양 접시에서 충분히 배양되어 있는 세포를 0.25%

Trypsin-EDTA solution (Gibco, Rockville, MD, USA)을 사용하여 세포를 떼어낸 후, 0.4% trypan blue stain (Gibco, Rockville, MD, USA) 용액으로 세포를 염색 하였다. 이 후, Hemacrometer 로 세포 수를 측정 및 계산하여 인공지지체에 1×10⁵ 만큼 주입하였다.

3. 결과 및 토론

혼합된 PCL/β-TCP 인공지지체는 폴리머 적층 시스템을 이용하여 원형타입으로 제작되었다. Table 1은 인공지지체의 공정 조건을 보여주고 있으며,

Fig. 2는 제작 과정을 사진으로 보여주고 있다.

먼저 폴리머 적층 시스템을 이용하여 제작된 인공지지체는 250 μm 의 정밀 노즐을 이용하여 적 층되었고, 평균 650 kPa의 압력과 110℃의 온도를 적용하였다. 폴리머 적층 시스템의 적층 헤드는 180 mm/sec 의 이송속도로 설정하였으며, 250 μm ± 10 μm 의 공극 크기를 가지도록 코드를 제작하였 다. 또한, 성공적인 PCL/β-TCP 인공지지체를 제작 하기 위해 Fig. 2에서 보는 바와 같은 제작 과정을 통해 이루어졌다. 먼저, 각각의 재료인 PCL과 β- TCP 를 저울을 통하여 무게를 측정한 뒤, 핫플레 이트를 통하여 혼합된 재료를 녹인다. 녹은 재료 를 다시 상온에서 굳혀 시린지에 들어갈 수 있는 고체형태가 되면, 이 재료를 시린지에 넣고 110℃

의 온도로 녹여 노즐을 통해 스테이지 위에 적층 하여 인공지지체를 제작하게 된다. Fig. 3은 β-TCP

비율에 따른 PCL/β-TCP 인공지지체를 제작한 모 습을 SEM으로 촬영한 사진이다. Fig. 3(a), (b)는 β- TCP를 10 wt% 만큼 넣어 제작된 인공 지지체이며, Fig. 3(c)-(f)는 각각 20 wt%, 30 wt% 만큼 β-TCP를 혼합하여 제작한 인공지지체의 모습이다. SEM 사 진을 보면 3차원 원형타입의 인공지지체가 원하는 형상에 맞게 잘 제작된 것을 확인할 수가 있다.

제작된 인공지지체를 압축시험기를 통하여 기계적 특성을 평가하였다. PCL/β-TCP 인공지지체의 강도 및 변형률을 알아보기 위해 Fig. 4와 같이 응력-변 형률 곡선을 이용하였다. Fig. 4는 제작된 PCL/β- TCP 인공지지체의 압축 응력-변형률의 그래프를 보여주고 있다. 제작되는 인공지지체는 해면골과 구조가 유사하기 때문에 인공지지체의 압축강도도 해면골 압축강도와 유사한 강도를 지녀야한다. 그 래프에서 보는 바와 같이 10 wt% PCL/β-TCP 인공 지지체가 30 wt% PCL/β-TCP 인공지지체보다 기계 적 강도가 높은 것을 확인할 수 있다. 이는 고분 자 재료인 PCL에 β-TCP 의 함량이 많이 함유되어 있을수록 기계적 강도면에서는 약하다는 것을 알 수 있다.²⁶ β-TCP의 바이오 세라믹 재료가 PCL 재 료에 혼합되어 있지만 기계적 강도는 PCL에 의해 점차적으로 증가하다가 PCL 내부에 파우더 형태 인 β-TCP 세라믹 재료가 많이 함유되어 있어 기계 적인 강도면 에서는 점차 약해지는 것으로 보여진 다. 그리고 β-TCP 재료의 특성상 인공지지체 응집 에 있어 빠른 파괴가 보이는 것으로 판단된다. 따 라서 β-TCP 세라믹 재료가 고분자 재료인 PCL에 함유량이 높을 수록 기계적인 특성면에서 큰 영향 이 미치는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 제작된 Fig. 3 SEM images of blended PCL (90 wt%)/β-TCP

(10 wt%) (a), (b), blended PCL (80 wt%)/β-TCP (20 wt%) (c), (d), and blended PCL (70 wt%)/β- TCP (30 wt%) (e), (f) scaffold

Fig. 4 Stress-strain result of blended PCL/β-TCP scaffolds

PCL/β-TCP 인공지지체가 세포적합성이 우수한지 확인하기 위해 세포 증식 실험을 진행하였다.

PCL/β-TCP 인공지지체의 세포 증식 평가를 위해 MG-63 세포를 배양하였다. 그리고 인공지지체의 세포 증식을 평가하기 위해 CCK-8 Kit를 이용하여 Microreader 장치를 통한 흡광도 측정 및 세포 증 식을 확인하였다. 배양된 MG-63 세포를 인공지지 체 내부에 주입하여 시간에 따른 세포 증식을 비 교하였다. Fig. 5는 인공지지체의 세포 증식 평가에 따른 측정 결과를 1, 4, 7일 동안 보여주고 있다.

그림에서 보는 바와 같이, 1일차 결과에서 세포의 초기 증착이 blended PCL (90 wt%)/β-TCP (10 wt%) 의 인공지지체가 Optical density (OD) 값이 가장 높 게 나타난 것을 확인할 수 있다. 이는 바이오 세 라믹 재료인 β-TCP 의 함량이 낮을수록 인공지지 체의 세포 초기 증착이 잘 되는 것으로 보여진다.

하지만 7일차 에서는 β-TCP 함량이 가장 높은 blended PCL (70 wt%)/β-TCP (30 wt%) 인공지지체의 OD 값이 가장 높게 나타났다. 이는 시간이 지날수 록 β-TCP 의 함유량이 높은 인공지지체가 세포 증 식이 원활히 이루어지고 있다는 것을 보여주고 있 다. 이러한 결과는 제작된 인공지지체의 재료 특 성이 연관되어 있는 것으로 판단된다. 즉, 소수성 표면을 가지는 PCL 의 재료에서 세포 초기증착이 잘 이루어지며, 골 전도성이 우수한 β-TCP 의 재 료 특성 상 세포 증식률이 좋은 것으로 여겨진다.

세포 증식 평가를 통해 바이오 세라믹 재료인 β- TCP의 함량이 높을수록 세포 증식에 큰 영향을 미치는 것을 확인할 수가 있었으며, 이는 골 전도 성이 좋은 β-TCP의 재료로 인해 β-TCP 함량이 높 은 인공지지체에서 세포 증식이 더 좋은 것으로 확인하였다.

4. 결론

폴리머 적층 시스템을 이용하여 고분자 재료인 PCL 과 바이오 세라믹 재료인 β-TCP 를 혼합한 3 차원 PCL/β-TCP 인공지지체를 성공적으로 제작하 였다. 본 연구에서 제작한 PCL/β-TCP 인공지지체 는 원형타입으로 지름이 10 mm, 높이는 4 mm 의 형상을 갖추고 있다. 인공지지체 제작을 위해 사 용된 폴리머 적층 시스템은 골 조직 형상을 위해 원하는 공극의 크기와 혼합재료의 인공지지체 제 작이 가능하다. 그리고 제작된 인공지지체를 통하 여 기계적 강도 평가와 세포 증식 평가를 수행하 였다. PCL 재료에 바이오 세라믹 재료인 β-TCP 를 혼합한 인공지지체를 이용하여 세포 증식 실험과 기계 강도 테스트를 진행한 결과, 세포 증식은 PCL 재료에 β-TCP 의 함유량이 높을수록 시간이 지남에 따라 OD 값이 증가하는 것을 볼 수 있었 다. 바이오 세라믹 재료인 β-TCP 의 함유량이 높 은 인공지지체에서 세포 초기 증착은 낮았지만, 세포의 증식률을 다른 인공지지체 보다 높아지는 것을 확인 할 수 있었다. 즉, 세포 증식은 혼합된 PCL/β-TCP 인공지지체의 β-TCP 함량 비율이 높을 수록 세포 증식에 탁월한 효과가 있는 것을 확인 하였다. 이는 소수성 표면을 가지는 PCL의 재료에 서 세포 초기증착이 잘 이루어지지만, 골 전도성 이 좋은 β-TCP 의 재료의 특성상 β-TCP 함유량이 높은 인공지지체가 세포 증식률이 좋은 것으로 판 단된다. 그리고 기계 강도 테스트에서는 β-TCP 함 유량이 높은 인공지지체에서 기계적 강도가 약한 것을 확인하였다. 이는 재료의 특성에 따라 영향 을 많이 미치게 되는 부분이다. PCL은 비교적 저 렴하게 제조되는 생분해성 고분자로 개환반응 및 중합에 의해 용이하게 합성할 수 있고, 인장강도, 신장율, 그리고 충격강도 등의 기계적 물성이 우 수하다. 하지만 β-TCP 재료는 파우더로 이루어져 있어 제작하는데 많은 어려움이 있으며, 재료의 특성과 파우더로 이루어진 인공지지체는 응집에 한계가 있고 빨리 파괴된다. 즉, PCL 재료에 파우 더 형태인 β-TCP 가 많이 함유되어 있는 인공지지 체가 응집에 있어 빠른 파괴가 일어난 것으로 보 여진다. 따라서 바이오 세라믹 재료인 β-TCP 가 고분자 재료인 PCL에 함유되어 있는 양에 따라 기계적 특성면에서 큰 영향을 미치는 것으로 확인 되었다. 그리고 해면골의 압축 강도는 2~12 MPa 로 보고 되고 있다.²⁷ 하지만 β-TCP의 함량이 높을 Fig. 5 Cell proliferation result of blended PCL/β-TCP

scaffolds

수록 압축강도가 낮아지지만, 세포 증식이 가장 우수한 blended PCL (70 wt%)/β-TCP (30 wt%) 인공 지지체의 경우 해면골과 비슷한 12 Mpa의 압축강 도를 가지고 있어 골 재생에 적합하다고 판단된다.

본 연구를 통해 β-TCP 혼합 비율에 따른 인공 지지체를 폴리머 적층 시스템을 이용하여 제작하 였으며, β-TCP 함유량에 따른 기계적 특성과 세포 증식을 확인하였다. 향 후, 골 조직 재생을 위해 다른 바이오 세라믹 재료를 이용하여 인공지지체 제작 및 특성 평가를 수행할 것이다.

후 기

이 논문은 2013년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 기초연구사업지원을 받아 수행된 것임(No. 2013R1A4A01010936).

또한, 본 연구는 보건복지부 보건 의료 연구개 발사업의 지원에 의하여 이루어진 것임(HI11C0388).

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