이미지 분석법을 이용한 소프트 콘택트렌즈용 다목적용액의 각막상피세포 독성 평가
김남열1, 이군자1,2,
*
1을지대학교 대학원 보건학과, 대전 301-832
2을지대학교 안경광학과, 성남 461-713
투고일(2015년 2월 3일), 수정일(2015년 3월 13일), 게재확정일(2015년 3월 24일)
···
목적: 시판되고 있는 소프트콘택트렌즈용 다목적용액이 사람의 각막상피세포에 미치는 세포독성을 이미지 분석법 을 이용하여 평가하고자 하였다. 방법: 각막상피세포를 6종류의 다목적용액(A~F)이 0.05~50% 포함된 배양액에서 각각 2시간, 12시간, 24시간, 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 각막상피세포를 고정한 다음 Draq 5로 염색하고 공 초점현미경과 ImageXpress UltraTM를 이용하여 세포형태를 관찰하고 세포생존율과 세포자살(apoptosis)을 비교하였 다. 결과: 각막상피세포 생존율과 세포자살은 다목적용액을 2시간 처리한 경우에는 모든 제품에서 대조군과 차이가 없었으나, 12시간 이상 처리한 경우에는 B~F 제품에서 대조군의 52~75% 수준으로 감소하였고, 세포자살은 모든 제 품에서 차이가 없었다. 24~48시간 처리한 경우에는 생존율이 29~73% 수준으로 감소하였고(p<0.05), 세포자살은 199~526% 증가하였다. 제품별로는 다목적용액 D, E, F가 A보다 각막상피세포 생존율을 감소시켰고 세포자살을 증 가시켰다(p<0.05). 결론: 저농도의 다목적용액은 각막상피세포 독성에 영향을 미치지 않지만 고농도의 다목적용액은 각막상피세포의 자살을 유도하고 세포생존율을 저하시킬 수 있으므로 다목적용액의 성분은 소독기능이 우수하고 독 성이 없는 성분으로 개발되어야 할 것으로 사료된다.
주제어:각막상피세포, 다목적용액, 세포자살, 세포독성, 이미지분석법
···
서 론
콘택트렌즈는 굴절이상으로 인한 시력교정과 치료용 그 리고 미용을 목적으로 다양하게 사용되고 있다. 원데이 디 스포져블 콘택트렌즈가 아닌 경우에는 소프트 콘택트렌즈 를 관리하기 위해 세척과 소독의 목적으로 다목적용액 (multi-purpose solution)을 사용하게 된다. 특히 다목적용 액으로 소프트 콘택트렌즈를 소독할 경우에는 4~6시간 이 상 담가 놓는데 이 과정에서 다양한 성분이 콘택트렌즈 재질 속으로 흡수되거나 렌즈 표면에 흡착되고,[1] 콘택트 렌즈를 착용하는 동안 흡수 또는 흡착된 성분이 눈물로 방출되어 각막과 결막에 영향을 줄 수 있다.[2-4] 또한 콘택 트렌즈를 착용하기 전에도 다목적용액으로 헹구어 착용하 도록 권하고 있기 때문에 다목적용액에 포함된 성분이 안 구표면과 직접 접촉되는 경우가 많아질 수 있다.
다목적용액에는 콘택트렌즈의 세척과 소독을 위한 성분 으로 살균제(antimicrobial agent)와 계면활성제(surfactant) 가 포함되며, 세척효과를 높이기 위한 점도유지제(viscosity-
inducing component), 킬레이팅제(chelator)인 ethylenediami- netetraacetic acid(EDTA), 염도조정제(tonicity component) 인 염화나트륨, 용액의 산도를 유지시키기 위한 완충제 등 이 포함된다. 방부제로 사용되는 biguanide, biguanide polymers, polyquaternium-1(polyquad)는 살균효과가 우수하 여 0.00001~0.0003% 또는 0.0005% 이하의 저농도로 사용되 는데 이 경우에도 세포독성을 유발하여 각막염색을 유발한 다고 보고되었다.[5] Polyquad와 PHMB(polyhexamethylene biguanide)와 같은 고분자 콘택트렌즈 메트릭스(matrix) 내 로 흡수되지만 이러한 방부제도 세포궤사(necrosis),[6] 세 포막손상,[7] 각막상피세포의 폐쇄띠(tight junction) 및 세포 연접(cell adhesion) 파괴를 유발하며,[8] 단시간(15분~3시 간) 내에 세포사멸 수용체(cell death receptor)를 활성화 시켜 세포자살(apoptosis)을 유발한다고 알려져 있다.[9,10]
최근에는 특정 다목적용액이 특정 실리콘하이드로겔렌즈 에 흡수되어 각막염색을 과다하게 유발한다는 “in vitro”,[11,12] “in vivo” 연구결과가[13,14] 발표되어 논쟁을 일 으킨 바 있다.
*Corresponding author: Koon-Ja Lee, TEL: +82-31-740-7182, E-mail: [email protected]
<초청논문>
다목적용액의 세포독성을 평가하기 위해서 “in vivo”[1,4,13]
상태에서 뿐만 아니라 객관적이며 다양한 실험조건을 구 사할 수 있는 in vitro 상태의 연구가 활발히 진행되고 있
다.[2,4,7,8,11] 세포배양을 통해 이루어지는 in vitro 연구는 각막
상피세포(human corneal epithelial cells, HCEpiCs)를 단층 (monolayer)으로 배양하여 사용되며,[10,15,16] 이는 다목적용액 이 각막상피세포에 직접 작용하게 되어 독성 여부를 명확히 확인할 수 있다는 장점이 있다.[17] 각막상피세포의 독성을 확인하는 생화학적인 방법으로는 3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay와 caspase 활 성을 측정하는 방법이 사용되는데, 이 방법은 다목적용액의 세포독성을 빠르게 확인할 수 있고, 민감도가 높으며, 동일 한 조건에서 실험이 가능하다는 장점이 있으나,[7,18] 다목적 용액의 독성평가가 연구자마다 다르게 보고되었다.[11,12,19-21]
최근에는 광학장비와 정보기술을 기반으로 개발된 이미 지 분석법이 생체인식기술 등 정교한 과학 분야와 실생활 에서 다양하게 사용되고 있다.[22] 이미지 분석법은 물체의 크기, 색상, 형태를 기준으로 저장된 이미지를 사용하여 분석이 가능하기 때문에 기존 분자생물학적인 방법보다 경제적이고 다양한 연구 조건의 설정이 가능하며,[23]다양 한 제품에 동일하게 적용할 수 있기 때문에 세포독성 연 구와 신약 개발 연구에 활용되고 있으나[24,25] 이미지분석 법을 이용한 다목적용액의 독성연구는 미미한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 다목적용액이 눈에 접촉되는 여 러 실험조건의 설정이 가능하고 제품 별로 동일한 조건에 서 빠르고 효율적으로 비교할 수 있는 이미지 분석법을 이용하여 국내 제품을 포함한 여러 다목적용액의 독성을 평가하고자 하였다.
대상 및 방법
1. 각막상피세포 배양
실험에 사용된 사람의 각막상피세포(Primary Human
Corneal Epithelial Cell, HCEpiC)는 ScienCell Research Labortorie(HCEpiCs, U Cat. No. 6510, USA)에서 구매하 여 사용하였으며, 계대 및 유지에는 세포 구매사에서 제시 한 방법과 배양액(CEpiCM, Cat. No. 6511, USA)을 사용 하였다. 배양조건은 5% CO2, 37oC의 조건하에서 세포배 양기(CO2 Cell Culture Incubator, MCO-5ACTM, Panasonic, USA)를 이용하여 각막상피세포를 배양한 후 실험에 사용 하였다.
배양용기(Nunc Easy Flask 75 cm2 Nunclon Delta surface, Cat, N. 156499, Thermo Scientific, USA) 바닥면적에 70%
의 밀도로 각막상피세포가 자라면, 0.05%의 Trypsin- EDTA(Gibco, Cat, N. 25399-120)를 첨가하여 상피세포를 배양용기 바닥면에서 분리하고, 분리된 세포 중 10%는 새 로운 배양용기로 옮겨서 유지하였다.
2. 실험에 사용한 다목적용액
다목적용액은 biguanide, PAPB(polyaminopropyl biguanide), PHMB, polyquad 및 polyhexianide가 포함된 다목적용액 을 사용하였으며, 다목적용액 A, 바이오트루(BiotrueTM, Bausch+Lomb, Rochester, NY); 다목적용액 B, 리뉴프레쉬 (Renu freshTM, Bausch+Lomb, Rochester, NY); 다목적용액 C, 옵티프리익스프레스(Opti-Free ExpressTM, Alcon); 다목 적용액 D, 리뉴센서티브(Renu sensitiveTM, Bausch+Lomb, Rochester, NY); 다목적용액 E, 아큐파이(AquifyTM, CIBA Vision, USA); 다목적용액 F, 프렌즈엠피파이브(Frenz MP5TM, KOREA)의 총 6종을 사용하였다(Table 1).
3. 다목적용액 처리
배양된 각막상피세포를 384 well plate(384 well plate, Cat, N. 788091, Greiner Bio-one, Germany)에 일정한 수 만큼 옮기고 세포 안정화를 위하여 24시간 배양한 후 6종 류의 다목적용액을 넣어주었다. 다목적용액의 농도는 콘 택트렌즈를 착용하는 순간의 눈물 내 농도를 고려하여 Table 1. The composition of multi-purpose lens solutions used in the study
Brand Disinfecting Agent Buffer Other agents (Surfactants, chelating agents) MPS A PAPB 0.00013%
Polyquad 0.0001% Borate Tetronic 1107, hyaluronan, sulfobetain, EDTA MPS B PAPB 0.0001% Borate Tetronic 1107, hydranateTM 0.1% EDTA MPS C Polyquad 0.001%
MAPDA 0.0005% Citrate Tetronic 1304, sorbitol, 0.05% EDTA, aminomethylpropanol (AMP-95) MPS D PAPB 0.00005% Borate Tetronic 1107, 0.1% EDTA
MPS E Polyhexanide 0.0001% Phosphate Pluronic F127, sorbitol, dexpanthenol, tromethamine, EDTA, MPS F PHMB 0.001% Unknown Hyaluronan (0.02%)
PAPB, Polyaminopropyl biguanide; Polyquad, Polyquaternium-1; MAPDA, myristamidopropyl dimethylamine (Aldox); PHMB, polyhexamethylene biguanide; EDTA, Ethylenediaminetetraacetic acid; HYDRANATE, hydroxyalkylphosphonate.
50%에서부터 착용 후 눈물에 희석되는 농도를 고려하여 0.05, 0.1, 0.2 0.4, 0.8, 1.6, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50%가 포함되도록 배양액에 넣어주고 2, 12, 24, 48시간 동안 각 각 배양하였다. 매 실험마다 다목적용액을 처리하지 않은 대조군을 함께 진행하였으며, 대조군은 다목적용액 대신 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 동일 양 만큼 넣어주었다.
4. 이미지 분석을 위한 각막상피세포 처리 및 분석방법 다목적용액이 포함된 배양액에서 2~48시간 처리한 각막 상피세포를 4% 파라포름알데히드 용액(paraformaldehyde solution in 4% in PBS, Cat, N. 199431LT, Affymetrix, USA)에서 10분간 고정시키고, Draq5TM(1,5-bis{[2-(di- methylamino)ethyl]amino}-4,8-dihydroxyanthracene-9,10- dio, Cell Signal Technology, USA)를 사용하여 세포핵을 염색하였다. Darq5로 염색된 실험군과 대조군의 각막상피 세포는 공초점현미경(confocal microscopy, Axiovert 200MTM, Carl Zeiss, GERMANY)과 ImageXpress UltraTM(auto confocal high content-screening system, Molecular Devise, USA)을 이용하여 관찰하고 세포 사진을 저장한 후 MetaXpressTM (Molecular Devise, version 2.0.0.13, USA) 프로그램을 이
용하여 분석하였다.
정상세포와 손상된세포 및 세포자살 형태를 보이는 세 포는 형태적 특징(세포와 세포핵의 크기, 염색된 세포핵의 형광 정도)을 수치화한 기준에 따라 구별하였으며(Fig. 1, Fig. 2), 세포독성은 세포 생존율로 관찰하였고, 생존율은 건강한 세포와 형태적 이상을 보이는 세포를 백분율로 계 산하였다. 분석은 상위 10% 및 하위 10%값을 제외한 나 머지 80%의 평균값을 기준으로 하였다.
5. 통계분석
실험군의 그룹 간 유의성을 분석하고자 모든 측정값을 일원분산분석(One-way ANOVA)과 이원분산분석(Two- way ANOVA)법을 이용하였고, 통계분석 소프트웨어는 PRISM(GraphPad PRISM, Version 5.01, GraphPad Software, USA)을 이용하였다.
결과 및 고찰
1. 다목적용액의 종류 및 반응시간에 따른 각막상피세포 생존율
각막상피세포를 다목적용액이 0.05~50% 포함된 배양액
Fig. 1. Detected confocal micrographs of human corneal epithelial cells (HCEpiCs). HCEpiCs were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with DraQ5 (20X magnification).
Fig. 2. Confocal micrographs of healthy human corneal epithelial cells (HCEpiC) and apoptosis of HCEpiCs (red circle in b) with exposure of multipurpose solution (20X magnification).
에서 2, 12, 24, 48시간 처리한 결과 세포독성은 다목적용 액의 종류, 농도 및 처리시간에 따라 차이가 있는 것으로 나타났다(Fig. 3). 다목적용액의 농도와 처리시간은 “in vivo”
상태에서의 영향을 예측하기 위하여 콘택트렌즈 착용 후 안 구가 고농도의 다목적용액에 접촉되는 상황,[11,12,25] 콘택트 렌즈 재질에 흡수된 성분이 눈물로 서서히 방출되고[2,26]
낮은 농도에서도 장시간 노출되면 세포생존율에 영향을 준다는 연구결과를[27]고려하여 결정하였다. 대조군과 실 험군의 각막상피세포는 반응시간이 길어지면 세포증식이 일어나 세포 수가 증가하게 되기 때문에 실험군의 생존율 은 각각의 처리시간별로 대조군을 기준으로 계산하여 백 분위로 표시하였다(Table 2).
각막상피세포 생존율은 다목적용액에 2시간 처리한 경 우에는 모든 제품에서 농도에 상관없이 0.05% 뿐만 아니 라 50% 농도의 대조군과 차이를 보이지 않았다(Table 2, Fig. 4). 그러나 12시간 처리한 경우에는 50% 농도의 모든 다목적용액에서 대조군보다 세포생존율이 유의하게 감소 하였고(p<0.05), 25%와 12.5% 농도에서는 A제품을 제외 한 다른 모든 제품들에서 세포 생존율이 대조군의 54.5~68.3% 수준으로 감소하였으며(p<0.05), 6.25% 농도 에서는 D, E 및 F 제품에서 대조군의 71.4~75.1% 수준으 로 감소하였다(p<0.05), (Table 2, Fig. 4). 다목적용액을 24 시간 처리한 경우 생존율은 50%, 25% 및 12.5% 농도의 모든 다목적용액에서 대조군의 40~70% 수준으로 감소하 였고(p<0.05), 6.25% 농도에서는 다목적용액 A를 제외한 Fig. 3. Confocal micrographs of human corneal epithelial cells
(HCEpiCs) stained with DraQ5 (20X magnification).
Table 2. HCEpiC viability after exposure to MPSs measured by image analysis
HCEpiCs viability in multipurpose solution treatment (mean±SD)
Treat. Conc.(%) Control MPS A MPS B MPS C MPS D MPS E MPS F
2hrs
50 244.13
±22.03
252.00
±18.06
241.31
±15.99
241.88
±16.25
232.88
±19.41
254.25
±17.12
241.31
±22.87
25 248.63
±18.76
250.51
±10.44
256.5
±11.27
248.63
±12.98
246.38
±17.49
237.94
±19.42
237.38
±24.85
12.5 265.5
±10.98
235.78
±18.14
248.63
±13.72
254.25
±10.25
256.5
±12.39
249.19
±15.91
249.19
±18.54
6.25 253.13
±12.97
245.60
±9.90
253.69
±15.69
240.19
±23.07
246.38
±22.47
254.25
±18.86
254.81
±23.45
12hrs
50 276.34
±32.09
172.57
±20.34*
165.34
±30.28*
159.34
±25.42*
142.48
±23.18*
159.37
±26.41*
164.25
±19.18*
62.45% 59.83% 57.66% 51.56% 57.67% 59.44%
25 288.67
±28.06
225.34
±19.49
184.28
±30.07*
176.87
±23.79*
157.25
±23.86*
169.35
±26.86*
163.56
±23.52*
78.06% 63.84% 61.27% 54.47% 58.67% 56.66%
12.5 313.87
±18.50
276.48
±21.76
214.47
±28.00*
198.47
±24.91*
177.49
±24.42*
196.22
±28.55*
176.51
±16.46*#
88.08% 68.33% 63.23% 56.55% 62.51% 56.23%
6.25 317.36
±20.94
298.45
±11.88
268.47
±29.38
243.28
±25.43
226.48
±23.01*
231.54
±27.31*
238.45
±18.82*
94.04% 84.59% 76.66% 71.36% 72.96% 75.14%
B, C, D, E 및 F의 5개 제품에서 대조군보다 56~73% 수 준으로 감소하였으며(p<0.05), 다목적용액 D는 대조군 뿐 만 아니라 다목적용액 A와 비교해서도 세포생존율이 유 의하게 감소하였다(p<0.05), (Table 2, Fig. 4). 다목적용액 을 48시간 처리한 경우에는 50%, 25%, 12.5% 및 6.25%
농도에서 모든 다목적 관리용액에서 생존율이 각막상피세 포가 대조군의 28.5~72.5% 수준으로 감소하였고(p<0.05), 3.13% 농도에서는 다목적용액 C와 D 제품에서 세포 수가 감소하였으며(p<0.05), 그 이하의 농도에서는 차이가 없었 다. 제품별로는 50% 농도에서는 D 제품, 25% 농도에서는 D와 F 제품, 12.5%에서는 D, E, F 제품, 6.25%에서는 C, D, E, F 제품, 3.13%에서는 C, D 제품을 처리한 세포생존 율이 A 제품을 처리한 것보다 낮았다(p<0.05).
2. 다목적용액의 종류 및 반응시간에 따른 각막상피세포 자살 비교
다목적용액에서 처리한 후 각막상피세포의 자살은 2시 간, 12시간 처리한 경우에는 제품의 종류에 따라서도 차 이를 보이지 않았고 대조군과 차이가 없는 것으로 나타났 다(Table 3, Fig. 5). 24시간 처리한 경우, 50%와 25% 농 도에서는 세포자살이 모든 제품에서 대조군보다 1.6~5.6 배 수준으로 증가하였고(p<0.05), 12.5%와 6.25% 농도에 서는 A와 B 제품을 제외한 다목적용액에서 세포자살이 유의하게 증가하였고 대조군과 비교하여 1.9~4.0배 증가 한 것으로 나타났다(Table 3), (Figure 5). 특히 다목적용액 C, D, E, F의 세포자살은 대조군 뿐 만 아니라 다목적용 액 A 및 B 제품보다 유의하게 증가하였다(p<0.05). 48시 Table 2. Continued
HCEpiCs viability in multipurpose solution treatment (mean±SD)
Treat. Conc.(%) Control MPS A MPS B MPS C MPS D MPS E MPS F
24hrs
50 298.35
±30.51
167.78
±26.04*
144.29
±31.50*
132.38
±26.62*
119.39
±18.32*
129.45
±24.60*
134.28
±25.50*
56.24% 48.36% 44.37% 40.02% 43.39% 45.01%
25 305.24
±28.55
195.280
±25.86*
163.28
±32.90*
136.47
±27.05*
123.45
±17.51*
140.65
±18.88*
147.24
±26.24*
63.98% 53.49% 44.71% 40.44% 46.08% 48.24%
12.5 328.38
±29.90
232.370
±24.08*
202.23
±35.78*
190.27
±28.69*
139.48
±19.67*#
174.25
±16.04*
186.34
±26.86*
70.76% 61.58% 57.94% 42.48% 53.06% 56.75%
6.25 351.09
±30.51
298.370
±25.270
257.38
±32.17*
225.46
±27.49*
197.48
±18.64*#
217.38
±20.04*
213.28
±25.32*
84.98% 73.31% 64.21% 56.24% 61.91% 60.75%
48hrs
50 332.35
±43.42
152.460
±29.98*
132.14± 18.23*
117.38
±29.57*
97.38
±29.45*#
109.37
±33.24*
102.33
±35.78*
45.87% 39.76% 35.32% 29.3% 32.91% 30.79%
25 362.24
±26.67
187.480
±27.48*
145.42± 29.45*
137.26
±37.80*
103.24
±27.54*#
122.48
±35.77*#
155.35
±37.82*
51.76% 40.14% 37.89% 28.5% 33.81% 42.89%
12.5 392.81
±21.18
226.480
±31.19*
173.24± 17.44*
159.35
±29.53*
119.39
±30.36*#
136.29
±29.12*#
148.39
±34.17*#
57.76% 44.1% 40.57% 30.39% 34.7% 37.78%
6.25 419.64
±29.34
304.250
±28.76*
237.48± 20.89*
197.35
±31.43*#
168.49
±31.1*#
208.38
±32.16*#
187.48
±39.72*#
72.5% 56.59% 47.03% 40.15% 49.66% 44.68%
3.13 430.8
±24.26
400.110
±35.140
340.37
±26.56
267.49
±34.80*#
201.39
±29.98*#
341.38
±28.66
376.38
±33.25
95.91% 81.59% 64.12% 48.27% 81.83% 90.22%
*, P<0.05 compared with control; #, P<0.05 compared with MPS A based on post-hoc comparison test
간 처리한 경우의 세포자살은 25% 및 50% 농도에서는 대 조군보다 2.9~5.3배 증가하였고(p<0.05), 12.5% 및 6.25%
에서는 다목적용액 A와 B는 대조군과 차이가 없었지만 C, D, E, F 제품에서는 대조군보다 2.2~3.0배 증가하였으 며, D 제품에서 세포자살이 가장 많이 나타났다(p<0.05).
그러나 3.13%에서는 모든 제품에서 대조군과 차이가 없 는 것으로 나타났다. 다목적용액에 의한 각막상피세포 자 살은 다목적용액을 2시간, 12시간 처리한 경우에는 대조 군과 차이가 없었으나, 24시간 처리한 경우에는 25% 이상 의 농도에서 세포자살이 1.6~3.7배 증가하였고 48시간 처 리한 경우에는 2.9~5.3배 증가하였다. 제품에 따라서는 다 목적용액 A와 B를 처리한 그룹에서 세포자살이 적었고 다목적용액 D를 처리한 그룹에서 세포 자살이 가장 많은 것으로 나타났다.
다목적용액의 독성평가를 위해 사용하는 세포는 5~6층 의 중층각막상피세포를 사용하기도 하지만,[20] 이 경우 표 층과 기저층에 위치한 세포가 동일한 조건으로 다목적용 액에 노출되지 않으면 평가결과가 달라질 수 있고, 단일 세포층에서 관찰된 독성효과가 중층세포층에서는 관찰되 지 않는 경우도 있기 때문에[17] 본 연구에서는 상피세포를 하나의 층(mono-layer)으로 배양하고, 다목적용액에 직접 노출시키는 방법을 이용하여 시판되는 6종류의 다목적용 액을 평가한 결과 다목적용액을 12시간 처리한 경우에는 세포자살이 뚜렷이 증가하지는 않았지만 세포생존율이 감 소하기 시작하였는데, 이와 같은 결과는 본 연구에서 사용 한 형태학적인 방법이 세포자살의 마지막 단계에서 나타 나는 형태학적 특정을 기준[23]으로 하였기 때문으로 사료 된다. 다목적용액에 12시간 처리한 경우 각막상피세포는 다목적용액의 급성효과(accute effect)로 세포사멸(necrosis)가 촉진되어 세포생존율이 감소하지만, 24시간 이상 만성적 으로 노출된 경우에는 세포사멸과 세포증식이 억제될 뿐 만 아니라 세포자살이 촉진되어 세포생존율이 더 낮아지 는 것으로 사료된다.
다목적용액의 세포 독성은 용액에 사용되는 다양한 방 부제가 원인으로 보고되었고,[5,9,10,29] 다른 방부제보다 독 성이 적다고 보고된 PHMB와 같은 고분자 화합물의 경우 에도 콘택트렌즈에 흡착되어 각막에 손상을 유발하며[12], polyquad, PAPB, polyhexanide가 포함된 다목적용액의 경 우에도 각막상피세포에 독성을 주기 때문에 콘택트렌즈를 착용하기 전에는 식염수로 헹구어 착용할 것을 권하기도 하였다.[7] 완충제의 경우에는 각막상피세포에 독성을 유발 할 수 있다는 보고와[8,27] 세포독성이 없다는 결과[30]가 보 고되었고, 또한 단백질 등의 침전물을 제거하여 세척효과 를 높이는 계면활성제[2]의 경우에도 농도가 높거나 반응 시간이 길면 세포막을 분해시켜 세포 독성을 유발한다고 알려져 있다.[2,4,8] 다목적용액에 포함되는 점도유지제로 사 용되는 hydoxypropylmethycellulose는 방부제와 결합하여 방부제가 상피세포와 결합하는 것을 막아주기 때문에 세 포독성을 낮출 수 있다는 연구결과도[31]있어 다목적용액 의 독성은 다목적용액에 포함된 전체 화합물의 복합적인 효과로 이해해야 할 것으로 보인다. 콘택트렌즈에 흡수된 다목적용액의 성분이 장시간 방출되어 상피에 자극을 주 면 각막상피세포 자살을 유발하고 상피재생을 지연시킬 것으로 사료된다. Dutot 등[10]은 본 연구에 사용한 C 및 D 제품이 각막상피 세포 독성을 유발한다고 보고하였고, Cavet 등[28] 은 본 연구에 사용한 A 및 C 제품과 다른 제 품을 포함한 총 7개의 다목적용액을 비교하여 A 제품만 각막상피세포의 생존율에 영향을 주지 않고 다른 제품은 세포 독성을 유발한다고 보고하였는데, 본 연구에서는 다 Fig. 4. Number of healthy human corneal epithelial cells
(HCEpiCs) by image analysis. a. is cell number after 2h, b. is 12h, c. is 24h and d is 48h treatment of MPS.
Black bars represent control and the others represent MPS treated groups. *, Significantly lower than control at each exposure concentration (P<0.05).
목적용액 A 제품의 세포독성이 가장 적었고 D 제품의 독 성이 가장 큰 것으로 나타났다.
실제 콘택트렌즈를 착용하는 경우 다목적용액이 콘택트 렌즈 표면에 묻어서 결막이나 각막부위에 닿는 양은 최소 10 µL에서 최대 100 µL로 매우 적고 렌즈착용 방법이나 착용시간에 따라 달라지며,안구에서 일어나는 눈물의 순 환, 각막표면의 생물학적인 특성을 고려할 때 15~30분의 처리시간이 실제 안구에 미치는 상황이라 볼 수 있어,[32,33]
“in vivo” 상태에서 콘택트렌즈에 흡수 또는 흡착된 다목 적용액이 각막상피세포에 직접적으로 미치는 독성은 미미 할 것으로 보인다. 그러나 다목적용액이 콘택트렌즈에 흡 수되는 정도와 착용 중 방출되는 정도와 시간은 콘택트렌
즈의 재질과 렌즈 표면 처리방법에 따라 달라지고[26] 다목 적용액의 독성도 콘택트렌즈의 재질에 따라 다르게 나타 날 수 있기 때문에,[27] 세포독성이 적은 제품의 지속적인 개발이 필요할 것으로 사료된다.
결 론
시판되고 있는 소프트콘택트렌즈용 다목적용액이 사람 의 각막상피세포에 미치는 세포독성을 이미지 분석법으로 평가하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. 다목적용액을 2시간 처리한 경우에는 모든 제품에서 50%의 농도에서도 세포 생존율이 대조군과 차이를 보이 Table 3. Effect of MPS on HCEpiC apoptosis following exposure multipurpose solutions. Cell numbers are multi-nucleus cells
detected by image analysis
HCEpiC apoptosis in multipurpose solution treatment (mean±SD)
Treat Conc.(%) Control MPS A MPS B MPS C MPS D MPS E MPS F
12hr
50 12.8±3.1 10.5±2.2 11.2±1.2 13.2±3.2 12.7±2.3 12.4±2.5 11.7±2.20 25 12.1±2.5 11.9±2.3 14.2±2.3 12.4±2.5 14.2±1.5 10.4±2.0 11.4±2.10 12.5 13.3±2.1 10.4±1.6. 13.1±1.5 11.4±2.9 9.38±1.9 13.6±1.9 10.4±2.50 6.25 11.8±1.8 .9.4±2.1 10.4±1.2 13.7±1.5 10.8±1.3 12.4±0.8 9.2±1.9 3.13 12.5±2.0 12.3±1.5. 9.8±0.5 10.3±2.0 11.3±2.4 10.4±1.4 7.9±1.2
24hrs
50 22.4±5.20 .47.97±6.07* 057.85±12.32* 070.16±8.82* 82.68±8.21* 078.86±6.95* 70.48±8.77*
214% 258% 313% 369% 352% 315%
25 20.33±3.60 .31.45±8.88* 55.58±9.11* 0.67.81±4.69*# 074.39±6.95*# 064.77±8.15* 63.66±8.94*
155% 273% 333% 366% 319% 313%
12.5 17.96±4.55 25.12±7.34 34.68±11.32 0.53.28±4.41*# 070.82±6.15*# 0.54.59±7.75*# 51.53±5.12*#
140% 193% 297% 395% 304% 287%
6.25 15.87±3.13 19.28±6.07 19.29±3.460 0034.21±2.69*#$029.59±2.95*$ 0042.34±3.27*# 37.35±2.68*$
121% 122% 216% 186% 267% 235%
3.13 19.01±3.66 .20.1±5.31 23.78±2.370 023.3±3.12 26.81±4.510 0039.25±4.51*#$ 21.18±3.260
106% 125% 123% 141% 207% 112%
48hrs
50 19.70±7.80 0064.9±11.68* 078.84±17.48* 0093.78±17.23* 103.69±7.20*0 0090.44±15.27* 80.81±14.86*
329% 400% 476% 526% 459% 410%
25 22.50±6.79 44.78±10.92 0064.2±13.80* 0080.52±13.64* 0077.2±11.78* 0077.28±14.19* 72.38±12.19*
199% 285% 358% 343% 343% 322%
12.5 24.80±9.18 35.00±9.06 43.58±11.92 0060.68±11.96* 074.03±1.83*# 56.81±9.22* 57.98±8.21*
141% 176% 245% 299% 229% 234%
6.25 18.80±7.01 25.08±7.42 29.87±7.520 040.67±7.18* 48.61±4.80* 44.26±8.65* 44.13±8.04*
133% 159% 216% 259% 235% 235%
3.13 20.4±.39 23.81±5.92 26.38±4.720 31.43±7.79 38.47±4.900 37.1±7.43 29.29±6.2200
117% 130% 154% 189% 182% 144%
*, P<0.05 compared with Control; #, P<0.05 compared with MPS A; $, P<0.05 compared with MPS B, based on post-hoc comparison test
지 않았고 세포자살도 대조군과 차이를 보이지 않았다.
2. 다목적용액을 12시간 처리한 경우 생존율은 50%의 농도에서는 모든 제품에서 감소하였고, 25%와 12.5% 농 도에서는 다목적용액 A를 제외한 다른 제품에서, 6.25%
농도에서는 다목적용액 D, E 및 F 제품에서 감소하였고 (p<0.05), 세포자살은 모든 제품에서 대조군과 차이가 없 었다.
3. 다목적용액을 24시간 처리한 경우 생존율은 50%, 25% 및 12.5% 농도에서는 모든 제품에서, 6.25% 농도에 서는 A를 제외한 모든 제품에서 감소하였고(p<0.05), 세포 자살은 50% 및 25% 농도에서는 모든 제품에서 증가하였 고, 12.5%와 6.25% 농도에서는 A와 B를 제외한 모든 제 품에서 증가하였다(p<0.05).
4. 다목적용액을 48시간 처리한 경우 생존율은 6.25%
이상의 농도에서는 모든 제품에서 감소하였고, 3.13%에서 는 C와 D 제품에서 감소하였으며(p<0.05), 세포자살은 50% 및 25% 농도에서 모든 제품에서 증가하였고, 12.5%
및 6.25%에서는 C, D, E, F 제품에서 증가하였으나 3.13%에서는 모든 제품에서 대조군과 차이가 없었다.
5. 다목적용액의 농도가 1.60% 이하인 경우에는 세포생 존율과 세포자살이 모든 제품에서 처리시간에 관계없이 대조군과 차이를 보이지 않았다.
REFERENCES
[1] Lievens CW, Hakim N, Chinn A. The effect of multipur- pose solutions on the ocular surface. Eye Contact Lens.
2006;32(1):8-11.
[2] Tanti NC, Jones L, Gorbet MB. Impact of multipurpose solutions released from contact lenses on corneal cells.
Optom Vis Sci. 2011;88(4):483-492.
[3] Carnt N, Jalbert I, Stretton S, Naduvilath T, Papas E.
Solution toxicity in soft contact lens daily wear is associ- ated with corneal inflammation. Optom Vis Sci. 2007;84(4):
309-315.
[4] Chuang EY, Li DQ, Bian F, Zheng X, Pflugfelder SC.
Effects of contact lens multipurpose solutions on human corneal epithelial survival and barrier function. Eye Con- tact Lens. 2008;34(5):281-286.
[5] Lebow KA, Schachet JL. Evaluation of corneal staining and patient preference with use of three multi-purpose solutions and two brands of soft contact lenses. Eye Con- tact Lens. 2003;29(4):213-220.
[6] Oriowo MO. A fluorometric study of relative ocular lens cytosensitivity to multipurpose contact lens solutions using the resazurin assay method. Toxicol In Vitro. 2006;20(8):
1548-1554.
[7] Camus KMC, Pauline C, Maureen VB. Cytotoxicity and effects on metabolism of contact lens care solutions on human corneal epithelium cells. Clin Exp Optom. 2012;95(2):198- 206.
[8] Imayasu M, Shiraishi A, Ohashi Y, Shimada S, Cavanagh HD. Effects of multipurpose solutions on corneal epithe- lial tight junctions. Eye Contact Lens. 2008;34(1):50-55.
[9] Dutot M, Pouzaud F, Larosche I, Brignole-Baudouin F, Warnet JM, Rat P. Fluoroquinolone eye drop-induced cytotoxicity: role of preservative in P2X7 cell death receptor activation and apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci.
2006;47(7):2812-2819.
[10] Dutot M, Reveneau E, Pauloin T, Fagon R, Tanter C, Warnet JM, et al. lMultipurpose solutions and contact lens:
Modulation of cytotoxicity and apoptosis on the ocular sur- face. Cornea. 2010;29(5):541-549.
[11] Santodomingo-Rubido J, Mori O, Kawaminami S. Cyto- toxicity and antimicrobial activity of six multipurpose soft contact lens disinfecting solutions. Ophthalmic Physiol Opt. 2006;26(5):476-482.
[12] McCanna DJ, Harrington KL, Driot JY, Ward KW, Tchao R. Use of a human corneal epithelial cell line for screen- ing the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye Contact Lens. 2008;34:(1):6-12.
[13] Andrasko G, Ryen K. Corneal staining and comfort observed Fig. 5. Effect of MPSs on HCEpiC apoptosis measured by
image analysis. a. is cell number, after 2h, b. is 12h and c. is result of 48h treatment of MPS. Black bars represent control and the others represent MPS treated groups. *, Significantly lower than control at each exposure concentration (P<0.05).
with traditional and silicone hydrogel lenses and multipur- pose solution combinations. Optometry. 2008;79(8):444-454.
[14] Papas EB, Carnt N, Willcox MD, Holden BA. Complica- tions associated with care product use during silicone daily wear of hydrogel contact lens. Eye Contact Lens.
2007;33(6 Pt 2):392-393.
[15] Wright A, Mowrey-McKee M. Comparative cytotoxicity potential of soft contact lens care products. Cutan Ocul Toxicol. 2005;24(1):53-64.
[16] Cavet ME, Harrington KL, VanDerMeid KR, Ward K, Zhang JZ. Comparison of the effect of multipurpose con- tact lens solutions on the viability of cultured corneal epi- thelial cells. Cont Lens Anterior Eye. 2009;32(4):171- 175.
[17] Lim MJ, Hurst RK, Konynenbelt BJ, Ubels JL. Cytotox- icity testing of multipurpose contact lens solutions using monolayer and stratified cultures of human corneal epi- thelial cells. Eye Contact Lens. 2009;35(6):287-296.
[18] Tanti NC, Jones L, Gorbet MB, Impact of multipurpose solutions released from contact lenses on corneal cells.
Optom Vis Sci. 2011;88(4):483-492.
[19] Cavet ME, VanDerMeid KR, Harrington KL, Tchao R, Ward KW, Zhang JZ. Effect of a novel multipurpose con- tact lens solution on human corneal epithelial barrier function. Cont Lens Anterior Eye. 2010;33:S18-S23.
[20] Yanochko GM, Khoh-Reiter S, Evans MG, Jessen BA.
Comparison of preservativeinduced toxicity on monolayer and stratified Chang conjunctival cells. Toxicol In Vitro.
2010;24(4):1324-1331.
[21] Sorbara L, Peterson R, Woods C, Fonn D. Multipurpose disinfecting solutions and their interactions with a silicone hydrogel lens. Eye Contact Lens. 2009;35(2):92-97.
[22] Sirenko O, Crittenden C, Callamaras N, Hesley J, Chen YW, Funes C, et al. Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells. J Biomol Screen. 2013;18(1):39-53.
[23] Kim NY. Evaluation of multipurpose solutions on the cul- tured human corneal epithelial cell. PhD Thesis. Eulji uni- versity, Daejeon. 2014;14-29.
[24] Lang P, Yeow K, Nichols A, Scheer A. Cellular imaging
in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(4):343- 356.
[25] Ovadje P, Ma D, Tremblay P, Roma A, Steckle M, Guer- rero JA, et al. Evaluation of the efficacy & biochemical mechanism of cell death induction by piper longum extract selectively in in-vitro and in-vivo models of human can- cer cells. PLoS One. 2014;9(11):e113250.
[26] Powell CH, Lally JM, Hoong LD, Huth SW. Lipophilic versus hydrodynamic modes of uptake and release by contact lenses of active entities used in multipurpose solu- tions. Cont Lens Anterior Eye. 2010;33(1):9-18.
[27] Gorbet MB, Tanti NC, Crockett B, Mansour L, Jones L.
Effect of contact lens material on cytotoxicity potential of multipurpose solutions using human corneal epithelial cells. Mol Vis. 2011;17:3458-3467.
[28] Cavet ME, Harrington KL, VanDer Meid KR, Ward KW, Zhang JZ. In vitro Biocompatibility assessment of multi- purpose contact lens solutions: Effects on human corneal epithelial viability and barrier function. Cont Lens Ante- rior Eye. 2012:35(4);163-170.
[29] Garofalo RJ, Dassanayake N, Carey C, Stein J, Stone R, David R. Corneal staining and subjective symptoms with multipurpose solutions as a function of time. Eye Contact Lens. 2005;31(4):166-174.
[30] Lehmann DM, Cavet ME, Richardson ME. Nonclinical safety evaluation of boric acid and a novel borate-buffered contact lens multi-purpose solution, Biotrue multi-purpose solution. Cont Lens Anterior Eye. 2010;33(1):S24-32.
[31] Simmons PA, Donshik PC, Kelly WF, Vehige JG. Condi- tioning of hydrogel lenses by a multipurpose solution containing an ocular lubricant. CLAO J. 2001;27(4):192- 194.
[32] Wolkoff P, Nojgaard J, Troiano P, Piccoli B. Eye com- plaints in the office environment: precorneal tear film integ- rity influenced by eye blinking efficiency. Occup Environ Med. 2005;62(1):4-12.
[33] Nichols JJ, King-Smith PE. Thickness of the pre-and post-contact lens tear film measured in vivo by interfer- ometry. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44(1):68-77.
Cytotoxicity of Multipurpose Contact Lens Solutions on the Cultured Corneal Epithelial Cells Evaluated by Image Analysis
Nam-youl Kim1 and Koon-Ja Lee1,2,
*
1Graduate School of Public Health Science, Eulji University, Daejeon 301-832, Korea
2Dept of Optometry, Eulji University, Sungnam 461-713, Korea
(Received February 3, 2015: Revised March 13, 2015: Accepted March 24, 2015)
Purpose: To determine the effect of marketed multipurpose contact lens solutions (MPSs) on human corneal epithelial cells (HCEpiCs) toxicity by using image analysis. Methods: HCEpiCs were exposed six MPSs (product A-F) at 0.05~50% for 2h, 12h, 24h, and 48h respectively. HCEpiCs were fixed and stained with Draq5 after exposure with MPSs, and the cell viability and apoptosis were evaluated by using confocal microscope and ImageXpress UltraTM. Results: Viabilities of HCEpiCs exposed to MPS A-F for a 2h were not affected, while reductions (52~75%) in cell viability over a 12h exposure of MPS B, MPS C, MPS D and MPS F, and significant more reductions (29~73%) over a 24h and 48h-exposure. Apoptosis of HCEpiC was not affect over a 12h MPS exposure, however was significantly increased (199~526%) over 24h and 48h MPS exposure. Among the products MPS D, E and F reduced viability of HCEpiCs and apoptosis increased more than MPS A (p<0.05).
Conclusions: Lower concentration of MPSs have not an cytotoxic effect on HCEpiCs, however higher concentration of MPSs induce apoptosis and reduce viability of HCEpiCs. Therefore, it need to develop MPS having antimicrobial effectiveness with low cytotoxicity.
Key words: Human corneal epithelial cell (HCEpiC), Multi purpose solution, Apoptosis, Cytotoxicity, Image analysis
