Evaluation of Candidate Housekeeping Genes for the Normalization of RT-qPCR Analysis using Developing Embryos and Prolarvae in Russian Sturgeon Acipenser gueldenstaedtii

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한수지 51(1), 95-106, 2018

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Korean J Fish Aquat Sci 51(1),95-106,2018

Note

서 론

PCR을이용한유전자정량발현분석법(quantitative reverse transcription-PCR; RT-qPCR) 방법은유전자발현의상대정량 분석에사용되는기법으로, ^정확도와^간편성이^높아^유전자^발 현평가와관련된다양한연구분야에서활용되고있다. 발현의 상대정량분석을위해서는동일양의 RNA 주형(template) 투 입을검증하기위해참조유전자(reference gene)를목적유전 자와함께동일시료에서증폭시켜시료들간유전자발현자 료의정규화(normalization) ^과정을^{필수적으로}^포함하게^된다 (Udvardi et al., 2008). 발현자료의정규화를위해서는생물의 발달및생리적상태에발현이영향을받지않는유전자들을

선발하여이용하며, 주로전통적으로항존유전자(housekeeping gene)라고알려져있는유전자들을이용하여왔다(Bustin et al., 2009). 그러나종래에알려진바와는달리여러항존유 전자들이실제생물의발생·^발달^상태, ^또는^{시험자극에서}^차등 의유전자발현조절이이루어지거나큰폭의발현양변화가있 을수있음이종종보고된바있으며, 때문에특정샘플의 RT-

qPCR 분석을위해서는해당실험별로참조유전자의신중한

선정평가가매우중요시된다(Taylor et al., 2013; Yuan et al., 2014; Lee and Nam, 2016).

배발생및초기개체발달과정은세포수증식, 기관분화및 형태발달과관련하여비교적짧은시간에역동적인유전자발 현조절의변화를나타내는시기이다(Jaramillo et al., 2017). 특

러시아 철갑상어(Acipenser gueldenstaedtii) 발생 시료의 RT-qPCR 분석을 위한 내재 대조군 유전자의 선정

남윤권*·이상윤·김은정

부경대학교 해양바이오신소재학과

Evaluation of Candidate Housekeeping Genes for the Normalization of RT-qPCR Analysis using Developing Embryos and Prolarvae in Russian Sturgeon Acipenser gueldenstaedtii

Yoon Kwon Nam*, Sang Yoon Lee and Eun Jeong Kim

Department of Marine Bio-Materials and Aquaculture, Pukyong National University, Busan 48513, Korea

To evaluate appropriate reference genes for the normalization of quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) data with embryonic and larval samples from Russian sturgeon Acipenser gueldenstaedtii, the expression stability of eight candidate housekeeping genes, including beta-actin (ACTB), elongation factor-1A (EF1A), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), histone 2A (H2A), ribosomal protein L5 (RPL5), ribosomal protein L7 (RPL7), succinate dehydrogenase (SDHA), and ubiquitin-conjugating enzyme E2 (UBE2A), were tested using embryonic samples from 12 developmental stages and larval samples from 11 ontogenic stages. Based on the stability rankings from three statistic software packages, geNorm, NormFinder, and BestKeeper, the expression stability of the embryonic subset was ranked as UBE2A>H2A>SDHA>GAPDH>RPL5>EF1A>ACTB>RPL7. On the other hand, the ranking in the larval subset was determined as UBE2A>GAPDH>SDHA>RPL5>RPL7>H2A>EF1A>AC TB. When the two subsets were combined, the overall ranking was UBE2A>SDHA>H2A>RPL5>GAPDH>EF1A>

ACTB>RPL7. Taken together, our data suggest that UBE2A and SDHA are recommended as suitable references for developmental and ontogenic samples of this sturgeon species, whereas traditional housekeepers such as ACTB and GAPDH may not be suitable candidates.

Key words: Russian sturgeon, Acipenser gueldenstaedtii, RT-qPCR assay, normalization control, reference genes

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https://doi.org/10.5657/KFAS.2018.0095 Korean J Fish Aquat Sci 51(1) 95-106, February 2018

Received 5 January 2018; Revised 24 January 2018; Accepted 25 January 2018

*Corresponding author: Tel: +82. 51. 629. 5918 Fax: +82. 51. 629. 5910 E-mail address: [email protected]

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남윤권ㆍ이상윤ㆍ김은정 96

히어류와같이체외수정및체외발달을하는수산동물의경 우, 부모와분리되어배발생과초기발달이진행되므로모계로 부터수정란에전달된유전자산물을이용하는발생초반의짧 은구간을제외하면, 정상적인발생·발달을위한독립적인유전 자발현체계를구축해야하며, 체외발생·발달특성상어류등 수산동물의발생관련유전자발현조절은다양한외부환경요 인으로부터많은영향을받는다(Fernandes et al., 2008; Ahi et al., 2013). 따라서어류발생에관여하는유전자들의정확한발 현정량분석을위해서는적절한참조유전자의선정이매우중 요시된다.

철갑상어(Acipenser species)^는^원시경골^어류로서^현존하는 조기아강(Actinopterygii)의가장원시형태를유지하고 있는 분류군이다(Birstein et al., 1997). 철갑상어는일반적인경골 어류(Teleostei)들과는달리전할(holoblastic cleavage) 방식으 로난할을개시하며, 비대칭적부분전할(동물반구와식물반 구에서차등속도의난할진행)^로^난할이^전개되고, ^발생이^진 행되면서다양한크기와모양의할구(blastomeres)들이만들어 진다. 또한배발생과정중일반경골어류와는달리특징적으 로분화된전신(pronephros)을나타낸다(Bolker, 1993; Cooper and Virta, 2007; Park et al., 2013a). 뿐만아니라, 부화후철갑 상어는비교적장기간의난황흡수기간을갖는데, ^이^기간^동안 형태변화는물론유영성(swimming behavior), 주류성(rheo- taxis), 주광성(phototaxis) 등행동발달측면에서많은변화를 나타낸다(Gisbert and Williot, 1997; Gisbert and Ruban, 2003;

Park et al., 2013b). 따라서철갑상어의배발생및초기발달에 관여하는유전자들의발현조절에관한연구정보들은어류발 생의진화및비교유전체연구에유용한연구자료를제시할뿐 만아니라, 철갑상어의인공종묘생산기술개선을위한기초과 학자료를제공한다는측면에서도의미가있다.

이에 본연구에서는 우리나라에신규 양식후보종으로소 개되기 시작하고 있는 러시아 철갑상어(Acipenser guelden-

staedtii)^의^발생과^초기^발달에^관여하는^{유전자들의}^발현^분석

을위한연구의시작점으로서, 배발생및자어발달시료들의

RT-qPCR 분석시유전자발현을적절히규격화할수있는참

조유전자들을선정평가하고자하였다.

재료 및 방법

실험어류, 인공수정 및 발생 시료 확보

실험에사용한러시아철갑상어 친어는 2002년에인공부화

후경남함양디노빌영어조합법인양식장에서사육중인개체 들이었다. 성숙한암수 친어들을 대상으로 산란유도 호르몬 인 luteinizing hormone-releasing hormone analog (LHRH-a;

Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를암컷 80 μg/kg, 수컷 20 μg/kg 어체중농도로근육주사하였고, 암컷의배란이이루 어질때까지수온 15-16℃^에서^{관찰하였으며}(^약 24^시간-30^시

간소요), ^수컷은^주사 24^시간째^및 30^시간째^정액을^확보한^희 석보관액(Park and Chapman, 2005)에 1:1 희석후냉장상태 를유지하였다. 암컷배란을최초확인시점부터 1시간이후복

부압박법을통해배란된알을얻었으며, 습식법을이용 1:1

mating 방식으로인공수정을실시하였다.

수정란의점액질을제거하기위해 Fuller’s earth ^분말^처리를

수행한후부화배양기에수용한후 19±0.3℃로항온배양하

면서난발생을유도하였다. 유전자발현시험에사용하기위 해배의발생과정중철갑상어발생에서대표적인 12 발달단 계로부터발생시료를확보하였다. 러시아철갑상어의발생배

의형태학적발달에의한발생단계구분은선행연구(Dettlaff

et al., 1993)에따라실시하였고, 본논문에서대상으로한 12 배발생단계는다음과같다. 수정직후(0 h post fertilization;

0 HPF), 제1난할(2.2 HPF), 제5-6난할(7.5 HPF), 포배기 초 기(9.2 HPF), 낭배기 시작(20 HPF), 70% 피포 형성기(28.5 HPF), ^신경배^형성^시작(33.5 HPF), ^전신^형성기(40 HPF), ^눈 및체절형성기(56 HPF), 심장박동기(73.5 HPF), 꼬리신장기 (95 HPF), 그리고최초부화(120 HPF)의발생단계로부터약 15-20 개의배또는부화자어를 3반복으로샘플링하였다. 샘 플링과정중죽었거나기형적으로발생하는배또는개체들이 포함되지않도록현미경하에서시료들을검경한후샘플링을 실시하였다. 샘플링직후드라이아이스에냉동시켰으며, 이후

초저온냉동고(-80℃)에사용직전까지보관하였다.

부화후, 부화자어들은부화온도와동일온도(19℃)로조절

되는항온수조(1 m×2 m×0.3 m; W×D×H)에순환여과식

으로난황흡수가완료(^부화 8^일째) ^후^알테미아^부화^유생(Ar- temia nauplii)^을^만복^{공급하였고}^부화 11일째까지(1 day post hatching; 1 DPH부터 11 DPH까지) 사육관리하면서 1일간격 으로샘플링을실시하였다. 각샘플링시점에서 10미씩 3반복 샘플링하였으며앞서와마찬가지로물기를제거후드라이아 이스를이용하여냉동처리하였다.

후보 유전자 및 프라이머 디자인

분석대상참조유전자후보군을 1차선정하기위해서연구 실에서 제작한 러시아철갑상어 next generation sequencing

(NGS) 발현유전체데이터베이스(치어전어체및미성어조

직 별 transcriptome ^분석^{데이터베이스})^로부터^후보^유전자 들의염기서열 정보를수집하였다. 1차수집된염기서열들을 대상으로프라이머디자인의용이성등에관한재평가를실시 하였으며, 이를통해총 8개의유전자를선정하였다. 선정된 8 개유전자는 beta-cytoskeletal actin (ACTB), elongation factor-1 alpha (EF1A), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), histone 2A (H2A), ribosomal protein L5 (RPL5), ribosomal protein L7 (RPL7), succinate dehydrogenase (SDHA) 및 ubiquitin conjugating enzyme E2 (UBE2A) 였으며, 각유전자염기서열을대상으로 RT-qPCR primer를디

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러시아 철갑상어 발생시료의 RT-qPCR 분석용 내재 대조군 유전자 97

자인하기위해서 RT-PCR ^클로닝^또는 RT-PCR ^산물의^직접적 인염기서열분석을통해염기서열을재검증하였다. 각유전 자별로프라이머길이(20 mers), G+C content (45-60%), melting temperature (55-65℃) 및증폭산물의길이(150-200 bp)를 기준으로 2-3쌍의 primer 쌍을합성하여 PCR 효율(PCR efficiency; E) ^및^단일^밴드의^선명한^증폭^여부를^{재평가하여}^유전 자별로최적프라이머쌍을선정하였다. 이때 PCR 효율값(E) 은철갑상어치어전어체 cDNA 주형과 Light Cycler 480 real- time PCR system을이용하여평가하였으며, 최소 94% 이상의 PCR 효율로증폭됨을확인하였다. 단일크기의밴드증폭여 부는 PCR ^증폭^산물을 1.5% ^아가로스^겔(agarose gel)^에^전기 영동후브롬화에티듐(ethidium-bromide; Et-Br) 염색을통해 서확인하였다. 본평가과정을통해서선정한후보유전자들의 종류와최종선정한프라이머정보들은 Table 1에나타내었다. RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-qPCR 분석

발생배및부화자어로부터 TriPure Reagent (Roche Applied Science)로 1차 total RNA를추출한후추출물을 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen Hilden, Germany)로다시순수분리하였고, 이때 DNA 오염을제거하기위해서 RNase-Free DNase를처 리과정을포함토록하였다. 분리된 total RNA가파괴없이확 보되었음을확인하기위해서 MOPS-formaldehyde gel ^전기영 동을통해 28S rRNA 밴드와 18S rRNA 밴드의선명도와진 하기를비교하여검증하였다. Total RNA 시료의순도는 Libar

S70 ^{분광광도계}(Biochrom Ltd., UK)^를^이용하여^흡광도(260 nm/280 nm 및 260 nm/230 nm)값이 1.85-2.05 범위에속함 을확인하였다. Total RNA로부터 cDNA를합성하기위해서 RNA 주형 2 μg을대상으로 oligo-d(T) primer (20 mers; Bi- oneer, Korea)와 random primer (random nonamers; Takara Bio Inc., Japan)^를^함께^포함한^역전사(reverse transcription) 반응을실시하였고, 역전사반응은 omniscript RT kit (Qiagen) 을 이용하여제조사의 권고방법대로실시하였다. 역전사반 응산물의농도를 nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, USA)으로 측정한후 동일 농도로보정하였고, 최종 DNase free water^에 4^배^{희석하였으며}, ^각^준비된 cDNA ^{주형으로부} 터 2 μL를취하여 qPCR 반응에이용하였다. PCR 증폭은 light cycler 480 System (Roche Applied Science)과 SYBR green I master (roche applied science)를이용하여 열순환반응이 95℃ 20초, 58℃ 20초및 72℃ 25초로총 40회수행되도록하 였으며최초변성반응으로서 95℃ 3^분을^{실시하였다}. ^각^순환 반응이종료될때마다형광검출을실시하였고, 최종순환과정 이종료된후 melting curve 분석을통해특이적증폭반응이일 어났음을확인하였다. 각 cDNA 별로 3회반복증폭시험을실 시하였다.

유전자 발현 안정성 평가

상기실험설계에따라 2회의서로다른산란그룹으로부터 각 33 발달단계(배발생 12 단계및자어발달 11 단계)로부터

Table 1. Summarized information on the housekeeping gene candidates and qPCR assay primers used in the present study

Gene Description Accession no. Primers (5´-to-3´) Amplicon size (bp) PCR efficiency (%) ACTB Beta-cytoskeletal actin KR906073.1 TCCCTGGAGAAGAGCTATGA

178 94.2

ACAGGTCCTTACGGATGTCA EF1A Elongation factor-1 alpha KR906074.1 ACAACATGCTGGAGACCAGT

183 99.1

CGATACCGCCAATCTTGTAG GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate

dehydrogenase MG722827 GGCTAAGCGTGTCATCATCT

183 95.8

GTCATGAGACCCTCAACGAT

H2A Histone 2A KP059880.1 CTCGTGCTAAGGCAAAGACT

161 97.5

CAGGATTTCAGCAGTCAGGT RPL5 Ribosomal protein L5 MG722830 AAGGAGTTCAACGCAGAGGT

179 101.5

ATAGCAGCATGAGCCTTGGT RPL7 Ribosomal protein L7 MG722829 TCAGACTTCGCCAGATCTTC

173 94.1

CAGAGGAATACGCTGCTTGT SDHA Succinate dehydrogenase MG722828 GGAGTTTGTGCAGTTCCATC

159 102.4

ACAACATCTCGAGAGGCAAG UBE2A Ubiquitin conjugating enzyme

E2 MG722831 CTCTTCCTCGCATCATAAGG

154 96.8

CCCAGGTATGGTACATTTGC

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각단계별 3^개의^생물학적^반복구(biological replication) ^샘플 링을통해서총 198개의 cDNA 주형(template)을제조하였고, 각 cDNA 주형별 3반복의 qPCR 수행(technical replication)을 통해서총 594 개의기초 quantification cycle 값(raw Cq data) 을확보하였다. 각 cDNA 당기술적반복구(technical replication)^들로부터^중간^값(median Cq)^을^선발하여^생물학적^반복 구별대표값을갖도록하였고, 이를기반으로유전자발현안정 성평가를실시하였다. 분석프로그램은 geNorm, NormFinder

및 BestKeeper 프로그램을 이용하여각 개발자가권고한방

법대로분석을실시하였다. 즉, geNorm 분석을통해 stability value (M; cutoff=1.5)^를^각^유전자^별로^측정한^후 pairwise ^변 이분석(V; cutoff=0.15)^을^통해^유전자간^상호^안정성^순서를 평가하였고, 가장낮은M ^값을^가진^유전자를^가장^유전자^발현 안정성이높은유전자로선정하였다(Hellemans et al., 2007).

NormFinder의경우 PCR efficiency를이용하여 Cq 값은상 대양(relative quantity)^로^전환^후^안정성^분석에^{이용하였고} (Andersen et al., 2004), 반면 BestKeeper의경우 coefficient of determination 및 Cq 값의기하평균(geometric mean)에의한 P 값을기반으로안정성이높은유전자를선발하였다(Pfaffl et al., 2004). 유전자발현안정성평가는배발생그룹(embryonic subset), ^자어^발달^그룹(larval subset)^을^구분하여^평가한^후^이 들두그룹을모두통합한자료와비교하였다.

결 과

qPCR의 Cq 데이터 패턴

최종 선정한 후보 유전자들의 증폭 조건에서 PCR 효율은 94.1-102.4%로나타나발현정량분석을위한적절한 PCR 효 율조건이충족되었음을알수있었고(Schmittgen and Livak, 2008; Doak and Zaïr, 2012), 역시 melting curve 분석및단일 밴드형성을확인함으로써유전자특이적인증폭반응이이루 어졌음을확인할수있었다(data not shown). 러시아철갑상어 배발생그룹(embryonic subset)을대상으로 8개후보유전자 의 Cq 값양상을조사한결과, ACTB가 20.01의평균(mean) Cq 값을나타내어(중앙값=20.34), 함께조사한다른 7개유전 자들보다가장높은발현을나타내었고반면 EF1A^가 39.7^의 평균 Cq 값(중앙값=39.35)을보여가장낮은발현수준을나타 내었다. 그외유전자들의경우 H2A 및 RPL7이나머지 4개유 전자(GAPDH, RPL5, SDHA 및 UBE2A)보다상대적으로높 은발현양상을나타내었다. 발생배시료그룹내에서 Cq 값의

편차를분석한결과, H2A^가^가장^작은^폭의^편차를^나타내어

상대적으로가장균일한 Cq 값들의분포를나타내었고, 이어 서 UBE2 및 SDHA가그뒤를이어적은편차를보였다. 반면 EF1A가가장큰폭의그룹내 Cq 값의편차를보였다(Fig. 1).

부화후자어발달그룹(larval subset)에서유전자들간 Cq 양 상은배발생그룹에서의관찰결과와유사하였으나, ^전반적으

Fig. 1. Expression profiles (Cq values) of eight housekeeping gene candidates in embryonic and larval subsets, and also in combined set. In the box plot, the lower and upper boundaries of each box indicate the 25^th and 75^th percentiles, respectively. Whiskers above and below the box are the 90^th and 10^th percentiles, respectively.

A black line within the box indicates the median value. The red line indicated by arrow head within the box is the mean value.

ACTB, beta-cytoskeletal actin; EF1A, elongation factor-1 alpha;

GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; H2A, histone 2A; RPL5, ribosomal protein L5; RPL7, ribosomal protein L7SDHA, succinate dehydrogenase; SDHA, succinate dehydrogenase; UBE2A, Ubiquitin conjugating enzyme E2.

10 15 20 25 30 35 40 45 50

10 15 20 25 30 35 40

10 15 20 25 30 35 40 45 50

ACTB EF1A GAPDH H2A RPL5 RPL7 SDHA UBE2A Total

Cq value

ACTB EF1A GAPDH H2A RPL5 RPL7 SDHA UBE2A Embryonic subset

Cq value

ACTB EF1A GAPDH H2A RPL5 RPL7 SDHA UBE2A Larval subset

Cq value

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러시아 철갑상어 발생시료의 RT-qPCR 분석용 내재 대조군 유전자 99

로유전자들의발현수준이증가하는(Cq ^값이^감소) ^경향을^나 타내었다. 이와같은 Cq 값의감소(평균 Cq 값기준시) 경향은 GAPDH, RPL7 그리고 ACTB에서상대적으로나머지다른유 전자들에비해서보다두드러진경향을나타내었고, H2A의경 우배발생그룹과자어발달그룹간 Cq 평균값에대한차이가 거의관찰되지않았다. ^따라서^자어^발달^{그룹에서는} ACTB (중앙값=16.03) 및 RPL7 (중앙값=16.40)이가장높은발현 을나타내었고, 뒤이어 GAPDH (중앙값=18.51)가높은발현 을나타내었으며반면 EF1A (중앙값=35.56)가가장낮은발 현을보였다. 유전자별 Cq 값의편차에있어서앞서배발생 그룹에서의결과와차이를나타내는유전자들이관찰되었는데, ACTB, EF1A, GAPDH 및 RPL7의경우배발생그룹에서보다 발현의편차가유의적으로감소하였으며, 반대로 H2A의경우 자어그룹에서발현수준의편차폭이소폭증가하였다(Fig. 1).

상기 두 부분집합(subsets) 그룹들의 Cq 값을 모두 대상으 로통합하여그양상을분석한결과, ^조사한 8^개^유전자들^중

ACTB와 RPL7이러시아철갑상어배발생및자어발달단계

에서가장높은발현을, EF1A가가장낮은발현을나타내었다.

두기간을모두대상으로할경우발생하는발현편차폭의경 우, GAPDH가가장큰폭의 Cq 값의표준편차를나타내었고 이어서 RPL7, EF1A, ACTB, RPL5 ^순으로^높은^편차를^나타 내었으며, H2A가가장낮은표준편차를보였다(Fig. 1).

발생 배에서의 유전자 발현 안정성 평가

배발생부분집합에서 3개의분석프로그램으로유전자발현 안정성을평가한결과, 3 종류프로그램들은각기다른유전자 들을가장안정적인 참조유전자로 선정함에따라분석프로 그램의알고리즘에따른선정차이를나타내었다. geNorm의 경우 SDHA와 UBE2A를가장안정적인쌍으로선정한반면,

ACTB와 RPL7을가장불안정한후보유전자들로선정하였다.

NormFinder의경우 GAPDH와 RPL5를안정도순위 1 및 2 순위로선정하였고 geNorm^과^{마찬가지로} ACTB^와 RPL7^을 가장낮은순위인 8 및 7 순위로각각나타내었다. 한편 Best- Keeper를이용한분석에서는 H2A와 UBE2가발현안정성에 서가장우수한점수를받았고, 반면 RPL7과 EF1A가가장낮 은점수를받은것을나타났다. 이에이들 3 종류프로그램에서 얻어진유전자별순위를기하평균으로환산할경우, UBE2A (geomean of ranking value; GRV 2.00)와 H2A (GRV=2.29) 가러시아철갑상어발생배시료에서가장높은순위의참조 가능 유전자들로 나타났으며, 반대로 ACTB (GRV=6.84)와

RPL7 (GRV=7.00)이특히낮은순위의유전자들로선정되었

다. GRV^를^기준^시^조사한 8^개^유전자의^순위는 UBE2>H2A

>SDHA>GAPDH>RPL5>EF1A>ACTB>RPL7 순으로나타 났다(Fig. 2).

자어 발달 과정에서의 유전자 발현 안정성 평가 부화후부터 11일째까지의부분집합그룹을대상으로한안

정성분석에서도마찬가지로서로다른분석프로그램들은각 기다른유전자들을최고안정적인유전자들로나타내었는데, geNorm 및 NormFinder 프로그램의경우, 앞서배발생부분집 합그룹에서와동일하거나거의유사한유전자순위를나타낸 반면, BestKeeper의경우배발생과는유의적인차이를나타내

었다. geNorm ^분석의^경우^배^{발생에서와}^{마찬가지로} SDHA

및 UBE2A가가장낮은 M ^값(가장높은안정성)을갖는것으 로나타났고반면 RPL7 및 ACTB가가장불안정한발현을보 이는유전자들로평가되었다. geNorm에서의발현안정성의순 위는 SDHA/UBE2A>EF1A>H2A>RPL5>GAPDH>RPL7

>ACTB^로^나타났다. ^한편^자어^부분집합^그룹에서 NormFind- er 분석에의한발현안정성순위는 RPL5>GAPDH>H2A>SD HA>UBE2>EF1A>RPL7>ACTB로나타나배발생부분집합 그룹과비교시, 1순위와 2순위, 그리고 4순위와 5순위간순위 바뀜이있었으나높은안정성을보이는유전자들과낮은안정 성을보이는유전자들의순위경향에는차이가없이유사하였 다. 반면 BestKeeper의경우자어발달부분집합에서가장안정 적인유전자들로 RPL7과 GAPDH를선정하였는데, 이들두유 전자는배발생부분집합에서각각 7순위와 4순위에해당하는 유전자들로서두부분집합들간유전자발현패턴에차이가있 음을보여주었다. ^배^발생^{부분집합에서}^가장^높은^순위를^부여 받았던 H2A의유전자의경우자어발달부분집합에서는 5순위 로평가되었다. BestKeeper에의한발현안정성순위는 RPL7>

GAPDH>UBE2A>ACTB>H2A>SDHA>EF1A>RPL5로나 타났다. 자어발달부분집합에서의 GRV를기준으로순위에대 한기하평균값을계산하면 UBE2A (GRV=2.47)>GAPDH>S DHA>RPL5>RPL7>H2A>EF1A>ACTB (GRV=6.35) 순으 로발현안정성순위를나타내었다(Fig. 3).

전체 시료(발생 배 및 자어 발달)에서의 유전자 발현 안정성 평가

수정부터부화 11^일째^{자어까지의}^전^구간을^대상으로^참조 유전자의유효한선정이가능한지를조사하기위해서앞서발 생배및자어발달부분집합그룹들을통합하여유전자발현안 정성평가를실시하였다. geNorm 분석결과, 두부분집합에서

의결과와동일하게 SDHA/UBE2A를가장안정적인유전자

로, ^반면 ACTB^와 RPL7^을^가장^불안정한^유전자로^선정하였 다(SDHA/UBE2A>EF1A>H2A>RPL5>GAPDH>RPL7>A CTB). NormFinder의경우두부분집합에서일관되게발현안 정성이우수한유전자들로평가되었던 GAPDH와 RPL5를전 체그룹에서도가장안정적인유전자로선정하였으며, geNorm 과마찬가지로 RPL7 ^및 ACTB^를^참조^유전자^후보로서^가장 불합리한유전자들로평가하였다(GAPDH>RPL5>SDHA>U BE2A>H2A>EF1A>RPL7>ACTB). 한편 BestKeeper의경우 배발생부분집합에서가장우수한평가를받았던 H2A와두부 분집합에서각각 2순위및 3순위로평가되었던 UBE2A가전체

(6)

그룹을대상으로할경우가장안정적인발현보이는후보유전 자로선정되었다(H2A>UBE2A>SDHA>RPL5>ACTB>EF1 A>RPL7>GAPDH). 전체시료들을대상으로한 GRV 평가에 서는 UBE2A (GRV=2.00)>SDHA (2.08)>H2A (2.71)>RPL5 (3.42)>GAPDH (3.63)>EF1A (4.76)>ACTB (6.84)>RPL7 (7.00) 순으로발현안정성이높게측정되어 UBE2A와 SDHA 가유사한정도의순위기하평균값을나타내었으며, ACTB와 RPL7이유의적으로낮은발현안정성순위를보였다(Fig. 4).

고 찰

본 평가에서 사용한 8종의 유전자들은 세포 골격(ACTB), 번역(EF1A), ^당 ^분해에^의한^에너지^생성(GAPDH), ^염색사 (chromatin) 구조(H2A), 리보좀합성(RPL5 및 RPL7), 구연산

회로(SDHA), 그리고단백질분해대사(UBE2A)에각기주요 기능을담당하는유전자들로서러시아철갑상어의발생및자 어발달에서유전자별로다양한발현수준에해당하는다양한 Cq ^값^구간을^보였으며, ^이는^이들^해당^{유전자들의}^세포^내^기 본기능의차이와연관이있는것으로판단된다. 유전자별 Cq 구간조사에서전체적으로배발생과정에비해부화후자어 발달에서여러유전자들의발현수준이증가하는것(Cq의감 소)이관찰되었다. 특히 GAPDH, RPL7 및 EF1A와같이에 너지생성및단백질합성에관여하는유전자들의경우그발 현양증가가더두드러졌으며, 이는철갑상어자어가부화직 후갖는왕성한활동성과자어의빠른성장과연관이있다고 판단된다(Dettlaff et al., 1993; Park et al., 2013b). 세포골격

및세포이동성에중요한역할을담당하는 ACTB 역시부화직

후자어의기관분화(organ differentiation)^와^형태^발달(larval

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

SDHA |

UBE2A EF1A H2A RPL5 GAPDH RPL7 ACTB

0 5 10 15 20 25 30

GAPDH RPL5 H2A UBE2A SDHA EF1A RPL7 ACTB

0 0.5 1 1.5 2 2.5

H2A UBE2A SDHA GAPDH ACTB RPL5 RPL7 EF1A

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0

UBE2A H2A SDHA GAPDH RPL5 EF1A ACTB RPL7

Most stable Least stable Most stable Least stable

Most stable Least stable

Geomean of ranking value

Stability value (M) Stability value

SD [±Cq]

geNorm NormFinder

BestKeeper

0 10 20 30 40 50 60

SDHA |

UBE2A EF1A H2A RPL5 GAPDH RPL7 ACTB 0

20 40 60 80 100 120 140 160

RPL5 GAPDH H2A SDHA UBE2A EF1A RPL7 ACTB

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

RPL7 GAPDHUBE2A ACTB H2A SDHA EF1A RPL5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

UBE2A GAPDH SDHA RPL5 RPL7 H2A EF1A ACTB

geNorm NormFinder

BestKeeper

SD [±Cq]

0 10 20 30 40 50 60

SDHA |

UBE2A EF1A H2A RPL5 GAPDH RPL7 ACTB 0

20 40 60 80 100 120 140

GAPDH RPL5 SDHA UBE2A H2A EF1A RPL7 ACTB

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

H2A UBE2A SDHA RPL5 ACTB EF1A RPL7 GAPDH

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0

UBE2A SDHA H2A RPL5 GAPDH EF1A ACTB RPL7

geNorm NormFinder

BestKeeper

SD [±Cq]

Fig. 2. Expression stability rankings of eight housekeeping genes in embryonic subset as addressed by geNorm, NormFinder and Best- Keeper programs. The overall ranking of each gene based on the geomean of ranking values from the three software programs are also provided. ACTB, beta-cytoskeletal actin; EF1A, elongation factor-1 alpha; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; H2A, histone 2A; RPL5, ribosomal protein L5; RPL7, ribosomal protein L7SDHA, succinate dehydrogenase; SDHA, succinate dehydrogenase;

UBE2A, Ubiquitin conjugating enzyme E2.