HPLC에 의한 Capsaicin 분석에 관한 고찰
2002. 11.
발표자
중앙관세분석소 분석 2관실 화 공 주 사 보 정 원 일
목 차
Ⅰ. 서론 Ⅱ. 본론
1. 분석의 원리 2. HPLC 기기조건
3, 분석시료 및 시료의 전처리 4. 분석 및 고찰
Ⅲ. 결론
Ⅳ. 참고문헌
Ⅰ. 서 론
고추는 우리나라를 포함하여 아시아, 아프리카, 아메리카 등지에서 재배 생산되고 있다. CAPSICUM, CHILLI, TABASCO, PAPRICA 등은 모두 고추의 일종이다. 고추의 매운 맛은 캡사이신(CAPSAICIN)이라고 하는 염기 성분 때문이며 붉은 색소의 성분은 주로 캡산틴(CAPSANTHIN)이다.
매운맛 성분의 대부분은 태좌와 격벽에 분포하고 종자에는 거의 함유되어 있지 않다고 한다. 매운 맛의 주체는 CAPSAICIN이며, 이외에 몇 개의 동족체가 함유되어 있다.
품종에 따라 캡사이신의 함량은 다르며, 그 범위는 0.2～1% 정도이다.
현재 고추다데기 등 고춧가루혼합조미료의 품목분류기준고시에 따른 요건확인을 위한 분석을 행함에 있어 기 시달된 『고춧가루 혼합 조미료 분석방법[분석관 47260-1112 (2001.7.23)호]』에 의해 고추의 특이 성분인 Capsaicin을 정량분석 하므로써 고추의 함량을 확인하고 있다.
또한, 고추다데기 등의 농산물 혼합 조제품은 함유된 개별 원재료의 함량 비율을 정량적으로 정확하게 확인한다는 것은 어려운 일이다. 그래서 이를 확인하기 위해 혼합조제품의 개별 원재료를 제출 받아 분석에 임하고 있다. 고추 또한 농산물로서 품종ㆍ산지ㆍ수확시기ㆍ저장기간 등에 따라 고추의 특이 성분인 Capsaicin의 함량이 다르기 때문에 원재료를 제출할 때는 반드시 제조(혼합)에 사용한 원재료가 제출되어 야만 정확한 고추함량 확인이 가능할 것이다.
본 연구에서는 분석방법은 이미 정해져 있지만 분석을 실시함에 있어 분석업무의 품질관리 차원에서 좀더 효과적인 방법으로 개선 할 점 또는 주의 할 점 등 여러 측면 에서 검토하여 보았다. 검토 방향은
- 첫째: 이동상의 농도와 유속을 조절하여 분석 시간을 단축 할 수 있는지, - 둘째: 추출 용제의 절약을 위하여 양을 달리하여도 분석결과에 이상이 없는지, - 셋째: 분석자의 반복성 여부
- 넷째: 고추 및 고춧가루에는 매운 성분이 얼마나 분포되어 있는지를 실제 분석을 통하여 알아보고자 한다
Ⅱ. 본론
1. 분석의 원리
당해 조제품에 투입한 원재료의 고추를 표준시료로 하여 고추의 특이 성분인 Capsaicin을 추출하여 HPLC로 정량 분석하여 고추의 함량을 확인한다.
2. HPLC의 기기 조건 ㅇ Column : C-18
ㅇ Mobil phase: Methanol : Water(70:30) ㅇ Flow rate : 0.5㎖/min
ㅇ Injection volume: 20㎕
ㅇ Detector: UV 229㎚
3. 분석시료 및 시료의 전처리 3-1. 분석시료
ㅇ 시약급 Capsaicin (min 60.0%) ㅇ 국내산 고추 4종
ㅇ 피망 3종
ㅇ 중국산 고춧가루 78종
3-2. 시료 전처리
시료(표준시료 포함) 1g을 각각 정확히 취하여 Acetone 약100㎖를 가하여 5시간동안 초음파 추출기에서 추출한 후 용액을 여과하여 아세톤을 휘발한 여액에 Methanol 10㎖를 가하여 0.45㎛ HPLC용 Filter로 여과한 용액을 분석 시료로 한다.
4. 분석 및 고찰
4-1. 이동상의 농도와 유속 조절하여 실험 시간을 단축 할 수 있는지 여부:
Capsaicin이 검출되는 시간(RT)은 약 17～18분대에서 측정되며, Run time은 25분 정도이다. 분석에 사용되는 원래의 이동상은 Methanol:Water(70:30)이다.
그러나 분석시간을 단축해보자는 의도에서 Methanol:Water(75:25)로 하여 시도해 보았다.
[그림 1] [그림 2]
[그림 3] [그림 4]
상기와 같이 분석결과 [그림 1]과 같이 Capsaicin의 RT가 12.7 분으로 앞당겨 졌으나 [그림 2] 에서의 17.5 분대의 분리도가 붙는 현상을 볼 수 있었다.
따라서 이동상의 농도는 기존대로 Methanol:Water(70:30)으로 하여야 한다.
그러나 유속을 0.5㎖/min에서 0.8㎖/min로 조절하여 분석한 결과 [그림 3]
과 같이 RT가 17.08분에서 [그림 4]과 같이 RT가 10.75분으로 앞당겨 졌으며, 분석 결과치에 대한 편차는 0.31%였다. 따라서 유속을 조절하여 분석시간을 단축 할 수 있었다.
4-2. 추출 용제의 용량 조절
고추의 매운 성분인 Capsaicin을 추출하기 위하여 250㎖의 삼각플라스크에 시료 1gr을 정확히 취하여 Acetone 약 100㎖를 가하여 5시간 동안 초음파추출기 에서 추출한다. 이때 용량 변화에 따른 추출량의 변화를 관찰하기 위하여 Acetone을 100㎖, 80㎖, 60㎖, 40㎖를 각각 가하여 동일 조건으로 비교 실험하 였다.
[그림 5, Acetone 80㎖] [그림 6, Acetone 60㎖]
[그림 7, Acetone 40㎖]
상기 [그림 5, 6, 7]과 같이 고추에 함유된 Capsaicin이 Acetone 100㎖를 기준으로 하여 80㎖에서는 100%, 60㎖에서는 96.8%, 40㎖에서는 94.5%가 추출된 것으로 나타났다. 따라서 Capsaicin 추출시 Acetone 80㎖를 가하여 추출하여도 될 것으로 사료된다.
4-3. 반복성 여부
반복성이라 함은 동일 기기를 이용하여 동일 실험자가 반복하여 실험을 하였을 경우에서 정확한 정도를 말한다. 실험자는 본인이 분석한 결과에 대해 정확한지를 수시로 검증해 보아야 한다.
실험오차의 원인은 시료간의 응답인자의 차이, 보정에서의 오차, 오염된 시료, 조작자의 실수 등 여러 가지에서 찾을 수 있다. 본 실험에서는 반복성 여부를 확인하기 위하여 ①시약급 Capsaicin (min 60.0%)을 0.03% 농도로 하여 3회 실시한 결과의 오차는 ±0.29% 정도이고[그림 8,9,10 참조], ②시료 전처리의 오차를 확인하기 위하여 중국산 고추 동량을 채취하여 동일조건 동일 방법으로 각각 분석한 결과 약 ±0.47%정도의 오차가 발생하였음을 확인하였다. [그림 11,12,13 참조]
그 이유는 본품 분석방법이 휘발성의 유기 용제를 사용하기 때문에 1, 2차 여과 과정에서 발생할 수 있고, 최종 여과한 용액의 관리 소홀로 휘발분이 발생될 경우도 있다. 그러므로 최종 여과한 용액이 휘발되지 않도록 밀폐 용기에 잘 보관하여야 실험오차를 최소화 할 수 있을 것이다.
[그림 8] [그림 9]
[그림 10] [그림 11]
[그림 12] [그림 13]
4-4. 고추 및 고춧가루의 Capsaicin 정량분석
시약급인 Capsaicin(min 60.0%)을 표준으로 하고 중국산 고춧가루 78종, 국내구입 고추 4종, 피망 3종을 Sample로 하여 다음과 같은 방법으로 분석에 임하였다.
1) 시료의 채취과정: 주의할 점은 시료의 균질화 여부부터 확인하여야 한다.
고추는 제조 및 혼합에 투여한 원재료를 제시받아 그 원재료를 표준시료로 하여 분석에 임하기 때문에, 견본과의 입도의 차이, 색상의 차이, 균질화 여부 등을 미리 확인하여 재 분석하는 경우가 발생되지 않도록 한다. 분석의 시작은 항상 제시된 표준시료와 동시에 실시한다.
2) 건조과정: 습다데기 등 수분을 함유한 시료는 추출시 오차의 요인이 될 수 있으므로 수분을 측정하면서 건조시킨 시료를 다음 과정에서 사용한다.
3) 시료평량과정: 추출 용기는 약 250㎖의 입구가 작은 삼각플라스크가 좋다.
입도가 크거나 거칠은 시료라면 반드시 미세하게 분쇄하여 평량해야 한다.
그 이유는 입도가 크거나 불균질하다면 추출에 영향을 줄 수 있기 때문이다.
여기에서 시료의 양은 수분을 포함한 1gr을 평량 한다.(예를 들면 수분이 50%
라면 수분을 포함한 1gr은 0.5gr임)
4) 추출과정: Acetone 100㎖를 가하여 5시간 동안 초음파추출기에서 추출한다.
앞의 분석결과와 같이 Acetone을 80㎖를 가하여도 될 듯 싶다.
5) 1차 여과과정: 여과지 #2를 사용하여 300㎖ 비이커에 Acetone으로 충분히 여과한다.
그림
번호 품명 수입자 Capsaicin(mg%) 비고
14 홍고추(맵지 않은 것) 국내구입 0.22
15 청고추(맵지 않은 것) “ 1.44
16 홍고추(청양) “ 38.89
17 청고추(청양) “ 37.15
18 청피망 “ 0
19 홍피망 “ 0
20 황피망 “ 0
6) Acetone 휘발과정: 핫플레이트에서 98℃에 고정하여 휘발한다.
7) Methanol에 용해과정: Methanol 10㎖를 정확히 가하여 추출된 Capsaicin을 충분히 녹인다. 특히 이 과정에서 Methanol이 휘발하므로서 분석결과치에 대한 오차가 발생할 수 있으므로 10㎖를 정확히 가한 후 즉시 랩으로 밀봉한다.
8) 2차 여과과정: 0.45㎛ HPLC용 Filter로 여과한 용액을 분석시료로 한다.
여과한 용액은 휘발되지 않도록 밀봉 용기에 잘 보관한다.
9) HPLC 분석과정: Capsaicin의 Ret. Time은 17～18분대에서 측정되며, Run time 은 22～25분 정도이다.
상기와 같은 방법으로 분석을 실시하여 다음과 같은 결과치를 얻었다. 중국산 고춧가루 78종에 대한 Capsaicin 평균함량은 40.54mg%였으며, 최소 5.42mg%, 최대 130.12mg%, 그 차이는 124.70mg%로 매운맛의 차이가 큰 것으로 나타났다. (표 2 참조)
국내의 매운 고추의 Capsaicin은 37.15mg%～38.89mg% 함유하고 있었고, 맵지않은 고추는 0.22mg%～1.44mg%였다. 그리고 피망에서는 Capsaicin이 검출되지 않았다. (표1 참조)
- 분석 결과표
표1. 국내산 고추
시료번호 capsaicin(mg%) 시료번호 capsaicin(mg%) 시료번호 capsaicin(mg%)
1(그림21) 44.76 31 31.89 61 33.42
2(그림22) 55.90 32 37.07 62 23.48
3(그림23) 64.60 33 47.83 63 21.96
4(그림24) 46.96 34 40.01 64 16.16
5(그림25) 66.08 35 76.51 65 27.04
6(그림26) 44.84 36 30.89 66 23.56
7(그림27) 38.75 37 41.98 67 23.44
8 24.43 38 24.71 68 19.30
9 46.64 39 76.87 69 18.02
10 45.38 40 32.86 70 13.46
11 32.47 41 28.39 71 23.92
12 63.23 42 31.19 72 13.59
13 39.77 43 86.81 73 19.25
14 39.59 44 29.22 74 19.73
15 61.01 45 28.14 75 11.72
16 36.64 46 54.18 76 15.57
17 44.05 47 101.84 77 12.86
18 37.81 48 54.24 78 5.42
19 43.95 49 38.43
20 49.32 50 42.23 평균 40.54
21 46.03 51 36.64 최대 130.12
22 45.70 52 36.65 최소 5.42
23 34.71 53 31.17
24 28.43 54 49.99 ※참고: 참고문헌 5참조
- 국내 유통중인 59개 시료에 대한 Capsaicin 함량
ㅇ 평균: 45.47mg%
ㅇ 최대: 111.7mg%
ㅇ 최소: 23.81mg%
25 34.63 55 26.40
26 130.12 56 39.07
27 104.72 57 25.56
28 35.97 58 37.14
29 25.62 59 119.61
30 35.42 60 34.78
표 2. 중국산 고춧가루 (78점)
중 국 산 고 춧 가 루 의 매 운 맛 분 포
1 1
3 8
1 8
6 5
1 4 . 1
4 8 . 7
2 3 . 1
7 . 7 6 . 4
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
0 ∼ 2 0 2 1 ～ 4 0 4 1 ～ 6 0 6 1 ～ 8 0 8 1 이 상
C a p s a i c i n ( m g % )
건 수 비 율 ( % )
[그림 14] [그림 15]
[그림 16] [그림 17]
[그림 18] [그림 19]
[그림 20] [그림 21]
[그림 22] [그림 23]
[그림 24] [그림 25]
[그림 24] [그림 25]
Ⅲ. 결론
본 연구의 첫 번째 검토사항인 분석시간 단축 여부에 대하여는 이동상의 농도는 Methanol:Water(70:30)으로 하고, 유속(Flow rate)을 0.8㎖/min로 조절하면 분석시간을 25분대에서 14분대로 단축할 수 있으리라 판단되며, 두 번째 검토사항인 추출용제의 절약에 대해서는 추출시 Acetone 80㎖를 가하여 추출하여도 분석결과에 이상이 없었으며, 세 번째 검토사항인 분석자의 반복성 여부 즉, 실험오차 부분에 있어서는 약 ±0.47%
정도의 오차가 발생함을 확인하였다. 이는 소량의 Sample을 채취하여 분석에 임하고 있기 때문에 농산물인 분석시료가 불균질할 경우 그 오차는 클 수 밖에 없다. 이러한 개인의 실험오차를 최소화하기 위해서는 기 시달된 “식품분석의 시료 채취 및 조제방법”의 내용을 숙지하여 실시하는 것이 바람직하며, 특히 본 실험의 오차는 휘발성 유기 용제를 사용하기 때문에 1, 2차 여과 과정에서 발생할 수 있고, 최종 여과한 용액의 관리 소홀로 휘발분이 발생될 경우도 있다. 그러므로 최종 여과한 용액이 휘발되지 않도록 밀폐 용기에 잘 보관하여야 실험오차를 최소화 할 수 있을 것이다. 네 번째 검토사항인 Capsaicin의 분포에 대하여는 중국산 고춧가루의 매운맛이 5.42mg%～130.12mg%로서 그 차이가 124mg%로 매운맛의 차이가 매우 큰 것으로 나타났다.
HPLC를 이용한 Capsaicin 정량 분석에 소요되는 시간은 최소 3일정도 소요된다.
분석에 소요되는 시간이 장시간이므로 잠깐의 실수라도 발생되면 정신적 육체적으로 스트레스를 받는다. 실수를 하지 않기 위해서는 앞에서 언급한 주의사항을 주지하여 분석에 임하면 좋을 듯 싶다.
분석에 있어서 무엇보다 중요한 것은 정확성, 재현성, 반복성이 있어야 한다는 것이다.
정확성은 참값과 측정값의 차이를 말하는데 이는 참값을 알고 있는 경우에만 적용할 수 있다. 참값을 모른다면 이론적인 값이라도 대략 알고있다면 정확성에 좀더 근접할 수 있을 것이다. 재현성은 다른 기기와 여러 실험자가 같은 실험을 하였을 경우 정확한 정도를 말한다. 반복성은 본인이 분석한 내용을 다시 반복실험을 하였을 경우 그 정확한 정도를 말한다. 분석에 있어서 기본이지만 다시 한번 상기하는 기회가 되었으면 한다.
참고로 본인은 Capsaicin 정량을 실시 할 때 본인의 정확성을 확인하기 위해 수시로 표준시료로 임의의 함량을 조제하여 같은 방법으로 분석한다. 왜냐하면 그 결과치는 항상 내게 신뢰감을 주기 때문이다.
Ⅳ. 참고문헌
1. 액체 크로마토그래피의 원리와 응용 : 인하대학교 출판부 2. 식품공업 : 세문사
3. 화학대사전 : 도서출판 세화 4. 동아세계대백과사전 : 동아출판사
5. 고추와 고춧가루의 품질관리체계 연구개발 : 농협전문대학 농산물가공기술연구소
