대한소화기학회지 2005;45:189-194
서 론
담관암은 담관 상피세포에서 발생하는 치명적인 암으로 일반적인 간암의 5%를 차지한다.1,2 이들의 발생기전에 대
해서 아직도 명확히 규정되어 있지는 않으나 최근 세포 분자 생물학 접근법을 통하여 일부 종양 유전자의 활성화 나 암억제 유전자의 불활성화 또는 상실과 같은 조절유전 자 변이의 축적이 담도암 발생의 기전 중 하나라고 생각
점액과분비 담관암에서 p53의 과발현 및 INK4a-ARF에 의해 전사되는 p16과 p14의 발현 변화
단국대학교 의과대학 내과학교실, 울산대학교 의과대학 내과학교실*, 병리학교실†
김홍자 김명환* 송문희* 송동은
†유은실
†Immunohistochemical Study of p53 Mutation and p16, p14 Alterations Encoded by INK4a-ARF in Mucin-hypersecreting Bile Duct Tumor
Hong-Ja Kim, M.D., Myung Hwan Kim, M.D.*, Moon Hee Song, M.D.*, Dong Eun Song, M.D.†, and Eunsil Yu, M.D.†
Department of Internal Medicine, Dankook University Hospital, Cheonan; Departments of Internal Medicine* and Pathology†, Asan Medical Center, University of Ulsan, Seoul, Korea
Background/Aims: Mucin-hypersecreting bile duct tumor is rare, and has an unusual histologic characteristic of having various degrees of cellular atypia ranging from dysplasia to invasive carcinoma in the same specimen. To gain insight into the role of p16, p14 and p53 in the carcinogenic process of bile duct tumor, we analyzed the expression status of these proteins in mucin-hypersecreting bile duct tumor. Methods: Immunohistochemical staining of p16, p14 and p53 were performed in 34 paraffin embedded tissues obtained from 22 patients of mucin-hypersecreting bile duct tumor. Results: Thirty-four specimens were categorized into low-grade dysplasia (9), high-grade dysplasia (4), carcinoma in situ (CIS, 11) and invasive carcinoma (10) based on the degree of cy- tologic and structural atypia. p53 overexpressions were found in 6 (17.6%, 3 in CIS, 3 in invasive carcinoma) and more frequently observed in the advanced histologic stages (p＜0.05). Loss of p16 staining was found only in 2 (6%) of low-grade dysplasia specimen. Loss of p14 staining was found in 21 (61.7%, 7 in low-grade dysplasia, 2 in high-grade dysplasia, 8 in CIS, and 4 in invasive carcinoma) and was frequently observed in low-grade and high-grade dysplasia compared to p53 (p＜0.05). Conclusions: In mucin-hypersecreting bile duct tumor, p14 and p53 may play a role in the early and advanced stage of carcinogenesis, respectively. Further study regarding genetic and epigenetic alterations in p14 and p53 gene may be needed. (Korean J Gastroenterol 2005;45:189-194)
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Key Words: Mucin-hypersecreting bile duct tumor; p53; p14; p16; Immunohistochemistry
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Department of Internal Medicine, Dankook University Hospital 16-5 Anseo-dong, Cheonan, Chungnam 330-715, Korea Tel: +82-41-550-3107, Fax: +82-41-556-3256
E-mail: [email protected] ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
접수: 2004년 7월 12일, 승인: 2005년 1월 26일 연락처: 김홍자, 330-715 충남 천안시 안서동 산16-5
단국대학교 의과대학 내과학교실 Tel: (041) 550-3107, Fax: (041) 556-3256 E-mail: [email protected]
이 연구는 2004년도 단국대학교의료원 생명과학연구소 연구비 지원으로 연구되었음.
190 대한소화기학회지: 제45권 제3호, 2005
하며, 이 중 세포주기 조절과 관련된 단백질인 p16과 p14 는 암화의 중요한 조절 유전자이다.3,4 이들은 염색체 9p21 에 위치하는 INK4a-ARF 유전자자리의 선택적 스플라이싱 에 의해 각각 p16 및 p14로 코딩되는데, p16은 체세포의 G1 세포주기에서 CDK4와 작용하여 그들의 키나아제 활 성을 억제하여 G1 주기로의 진행을 억제하는 세포 주기 음성 조절인자로서 이들이 불활성화되면 CDK4는 cyclin D 와 결합하여 pRb를 인산화시키고 이는 S기로의 진입을 촉 진하여 세포의 지속적인 성장과 악성화를 유발한다. p14는 이와 달리 p53 경로를 특이적으로 활성화시켜 성장억제제 의 역할을 하는데 이들은 세포핵 내 MDM2를 축적시키고 축적된 MDM2는 MDM2-p53결합체를 형성하여 p53의 유비 퀴틴 매개 단백분해 과정을 피하여 p53을 안정화시켜 과 도한 외부자극에 대해 세포주기 정지나 세포 고사를 유도 한다. 실제 myc나 ras 등의 과도한 자극이 있을 때 p14가 활성화되면 과도한 세포 성장 및 악성화를 억제하며 각종 종양에서 이들의 불활성화됨이 여러 연구에서 보고되었 다.3-5
점액과분비 담관암은 통상의 담관암과는 그 임상, 병리소 견이 달라 점액 분비로 인한 담관의 미만성 확장, 반복적인 담관염에 의한 암의 조기발견 등의 소견이 췌장의 관내 유 두상 점액 종양과 매우 유사하며 조직소견이 과형, 선종, 또 는 선암에 이르기까지 다양하며 흔히 한 종양 내에서도 양 성 병변에서 악성 병변까지 혼재하여 관찰되기도 하는 독특 한 담관암의 한 아형이다.6 이러한 병리 특징을 이용하여 전 암 병변 및 암 병변이 혼재하는 조직에서의 조직단계별 유 전자 발현양상을 관찰하면 악성변화의 단계에 따른 특정 유 전자의 역할 규명에 도움이 된다.
이 연구는 담관암의 발생기전에서 INK4a-ARF 유전자자 리의 역할에 대한 인식을 얻기 위해 수술로 채취한 점액 과분비 담관암 조직을 이용하여 p16, p14 및 p53의 발현에 대해 면역조직화학 염색을 통하여 조사하였다.
대상 및 방법
1. 대상
1995년 1월부터 2002년 12월까지 서울아산병원을 방문하 여 내시경 역행췌담관조영술 및 경피경간 담도내시경을 시 행하여 점액과분비 담관암으로 진단받은 58명의 환자 중 종양 절제술을 시행받아 확진된 22명을 대상으로 하였다.
평균연령은 60세(39-73세)였으며 남자 15명, 여자 7명이었 다. 점액과분비 담관암은 십이지장경에서 유두 개구부로부 터 다량의 점액이 배출되거나 담도에서 점액이 발견되며 수 술소견에서 담도 내에 다량의 점액을 분비하는 종양이 있는
경우로 정의하였다.6 조직검체는 간내 담도의 종양 분류법 에 근거하여 이형성의 정도에 따라 경도 이형성, 고도 이형 성, 상피내암종, 침습 암종으로 분류하였다.7 구체적으로 국 소적으로 다층형성 등을 보이나 침습이 없으며 경미한 핵이 형성만을 보이는 경우를 경도 이형성으로, 중등도의 이형성 을 보이면서 가성층화(pseudostratification) 소견을 보이는 경 우를 고도 이형성으로, 핵의 다형성과 중첩화, 중증 이형성 및 세포극성의 소실 등 악성화의 소견을 보이나 국소 침윤 의 증거가 없는 경우를 상피내암종으로, 확실한 간실질 내 또는 담도의 섬유근층으로의 침윤이 있는 경우는 침윤 암종 으로 정의하였다. 한 환자에서 다양한 병리소견을 보이는 경우 그 각각에 대해 면역조직화학 염색을 시행하였다.
2. p53 및 p14, p16에 관한 면역조직화학 염색
수술을 시행하여 얻은 22개의 검체 중 서로 다른 조직유 형을 나타내는 34개의 병변부위에 p53 및 p14, p16 면역조 직화학 염색을 시행하였다.
면역조직화학 염색을 위해 파라핀 포매조직을 4μm 두께 로 박절한 뒤 크실렌으로 탈파라핀화한 후 계열 에탄올을 거쳐 함수시켰다. 항원 복구를 위해 조직절편을 pH 6.0의 구연산 완충액에 담가 극초단파 오븐에서 10분씩 3회 가열 후 식혔다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 3% 과산화수소수에 10분간 반응시킨 후 pH 7.2의 0.02 M Tris 완충액으로 5분간 세척하였다. 일차항체로 1:1,600으로 희석된 p53 (DAKO, Carpinteria, CA, USA)과 1:200으로 희석 된 p16 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) 에 대한 단클론 항체 및 1:20으로 희석된 p14 (Abcam Ltd, Cambridge, UK)에 대한 다클론 항체를 이용하여 1시간 동안 반응시킨 다음 biotin이 부착된 이차항체를 조직 위에 도포 하고 10분간 방치하였다. 그 후에 과산화효소가 부착된 streptavidine 용액(LSAB kit, DAKO)을 10분간 반응시켰으며 이어서 diaminobenzidine으로 발색시켰다. 발색된 조직을 he- matoxyline으로 대조 염색한 후에 현미경으로 관찰하였다.
염색의 양성 판정은 100배 시야에서 염색의 경중에 관계없 이 핵이 갈색의 과립상으로 염색된 경우로 하였다. p53의 경우 염색된 세포수가 전체의 10% 이상인 경우에 양성으로 판정하였고 p14 및 p16의 경우는 세포의 핵 부위에 염색되 는 부분이 관찰되는 경우 양성으로 정의하였으며 핵이 염색 되지 않는 경우를 p14 및 p16에 대한 단백 발현의 소실로 간주하였다. p14에 대한 양성 대조군으로는 강양성을 보이 는 자궁경부 편평상피암 세포를 사용하였고 p16의 경우는 구개편도조직 세포를 이용하였다. 음성 대조군으로는 일차 항체 대신 생리 식염수를 사용하여 비교 분석하였다. p53은 autostainer (Ventana, Tucson, AZ, USA)를 사용하여 염색하였 다.
김홍자 외 4인. 점액과분비 담관암에서 p53의 과발현 및 INK4a-ARF에 의해 전사되는 p16과 p14의 발현 변화 191
3. 통계 분석
p53, p14, p16 단백 면역조직화학 염색의 성적 비교는 Fishers exact test 및 Chi-square 검정을 사용하였으며 통계 유의성은 p＜0.05인 경우로 하였다.
결 과
1. 조직 분류
수술을 시행한 22예 중 34개의 조직에서 면역조직화학 염
색을 시행하였다(Table 1). 면역조직화학 염색을 시행한 34 개의 조직 병리 소견은 경도 이형성 9예, 고도 이형성 4예, 상피내암종이 11예, 그리고 침습 암종이 10예였고 2가지 이 상의 병리 소견이 혼재된 경우가 9명이었다(Table 2).
2. p53, p16, p14 면역조직화학 염색
p53 과염색은 이형성에서는 관찰되지 않았고 상피내암종 3예 및 침습 암종 3예 등 34개의 조직 중 6예(17.6%)에서 관 찰되었고(Fig. 1), 이형성 단계보다 암조직에서 의미 있게 발 현하였다(p＜0.05). p16 염색소실은 34개의 조직 중 경도의 이형성 조직 2예에서만 관찰되었다(Fig. 2). p14 염색의 소실 은 34개의 조직 중 21예(67.7%)에서 관찰되었는데 경도 이 형성 7예, 고도 이형성 2예, 상피내암종 8예, 및 침습 암종 4 예에서 관찰되었다(Fig. 3). 특히 이들과 p53의 비교에서 p14 단백 소실이 악성화의 초기 단계인 이형성 시기부터 보인 경우가 의미 있게 많았다(p＜0.05).
3. 조직 단계에 따른 p53, p16, p14 면역조직화학 염색
같은 환자에서 2가지 이상의 조직유형이 존재하여 단계 별로 단백발현 분석이 가능했던 9예를 따로 분석하였는데 이형성 조직이 관찰된 6예 중 2예에서 p53 과발현 관찰이 가능하였고 이들은 모두 이형성 단계에서는 p53이 음성이
Table 2. The Results of Immunohistochemical Staining of p53, p14, and p16 in 9 Patients Showing Various Histologic Features in the Same Specimen
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Patients Age/Sex Histology p53 p14 p16
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1 66/male CIS + - +
Invasive carcinoma + - +
2 59/female CIS - - +
Invasive carcinoma - - +
3 65/male Low-grade dysplasia - - +
CIS + - +
4 52/male Low-grade dysplasia - + +
High-grade dysplasia - + +
CIS - + +
5 66/male High-grade dysplasia - + +
Invasive carcinoma + + +
6 73/male Low-grade dysplasia - - +
CIS - - +
7 57/male Low-grade dysplasia - - +
CIS - - +
Invasive carcinoma - - +
8 39/female High-grade dysplasia - - +
CIS - - +
9 45/female CIS - + +
Invasive carcinoma - + +
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Table 1. The Results of Immunohistochemical Staining of p53, p14, and p16 according to Histologic Stage
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Dysplasia Invasive ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ CIS carcinoma
Low-grade High-grade (11) (10) (9) (4)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
p53 overexpression 0 0 3 3
Loss of p14 7 2 8 4
Loss of p16 2 0 0 0
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192 The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 45, No. 3, 2005
었으나 암조직에서 양성이었다(Table 2). p14의 경우 이형성 을 포함한 6예 중 4예에서 단백이 소실되었으며, 이러한 단 백소실은 모두 이형성 및 암조직에서 동일하게 관찰되었다.
동일 환자에서 조직 유형에 따른 p16, p14 단백 면역조직화 학 염색의 차이는 없었다.
고 찰
담관암의 발생 기전은 아직도 명확하지 않으나, 한국인에 흔한 간내담석이나 간 디스토마와 같은 간내 기생충 질환이 있는 경우 그 발생빈도가 의미 있게 높고,8,9 원발 경화 담관 염과 같은 만성 담관염에 동반되어서도 담관암의 발생률이 높아서 만성적인 담관세포의 자극과 이로 인한 담관 염증
반응이 담관상피세포의 암화에 중요한 요인이다.4 이를 근 거로 대장암에서와 같은 선종-암종 연속체와 같이 단계별로 특정 유전자의 역할이 주목되고 있다. 담관의 점액과분비 종양은 이러한 선종-암종의 연속체 이론에 특히 잘 부합되 는 담관암의 특이한 아형으로 췌장의 점액 분비 유두상 종 양(intraductal papillary mucinous tumor)과 그 특징이 매우 유 사한 종양이다.6 이들은 통상적인 담관암과 임상, 방사선 그 리고 병리소견이 차이가 있는데 특히 같은 조직 내에 점막 의 과증식, 경도나 고도의 이형성, 선종, 상피내암종, 또는 침습 암종같이 다양한 조직소견이 혼재되어 있고 이들 중 일부의 양성 병변은 전암 병변으로 알려져 있어 각 병리 단 계에 따른 이상 소견의 분석은 악성화의 분자생물학 기전을 이해하는 데 매우 중요하다. 그러나 이처럼 점액과분비 담 관암을 이용한 연구가 담관암 발생 과정의 좋은 자료가 될 수 있음에도 불구하고 이를 이용한 연구는 없는데 이는 통 상적인 담관암도 흔하지 않은 질환인 데다 한 아형인 점액 과분비 담관암은 더욱 희귀하기 때문이다.
담관암의 발생에서 p53의 변이는 다양하여 p53 과발현은 모든 종양의 40-50%에 존재하며 어떤 종양에서는 종양의 분화도가 나쁠수록 과발현하지만 아직도 논란이 많다.10,11 이번 조사에서는 p53 과발현이 17.6%로 비교적 다른 보고 보다 낮았다. 그러나 흥미롭게도 이번 연구에서 p53 과발현 은 이형성 시기에는 발견되지 않다가 상피내암이나 침습암 에서만 발견되어 p53은 이형성 시기보다 암화로 진행되는 데 관련된 인자일 가능성을 시사한다. 실제로 다른 보고들 이 흔히 이형성을 제외한 암조직만을 이용한 연구인 반면 이번 연구에서는 이형성까지 포함된 점액과분비 담관암 조 직을 이용한 점을 고려한다면 이 같은 낮은 과발현율을 설 명할 수 있으며 암조직만을 따로 산출하면 이들의 과발현율 Fig 1. Positive imunohistochemical staining of p53. Invasive car-
cinoma of mucin-hypersecreting bile duct tumor shows positive nuclear immunoreactivity for p53 (immunoperoxidase, ×100).
Fig 2. Positive imunohistochemical staining of p16. Invasive car- cinoma of mucin-hypersecreting bile duct tumor shows positive nuclear immunoreactivity for p16 (immunoperoxidase, ×100).
Fig 3. Positive imunohistochemical staining of p14. Invasive car- cinoma of mucin-hypersecreting bile duct tumor shows positive nuclear immunoreactivity for p14 (immunoperoxidase, ×200).
Kim HJ, et al. p53 Mutation and p16, p14 Alterations in Mucin-hypersecreting Bile Duct Tumor 193
은 30%에 달하여 기존의 연구와 유사한 결과를 보였다.
이번 연구에서 살펴본 p16 및 p14의 변이는 일부 원발 간 세포암에서 관찰되지만 아직 담관암에서 보고는 부족하
다.12-16 한 보고에 따르면 간내담관암의 90% 이상에서 p16
이 비활성화되며, 이상을 보인 51예 중 39예(76%)에서 비정 상적인 촉진자의 과메틸화가 관찰되며, 8예에서 9p21 유전 자의 적어도 한 유전자자리의 LOH (loss of heterozygosity) 소견이 관찰된다.14 원발 경화 담관염과 관련된 담관암 환자 를 대상으로 한 다른 연구에서도 90%에서 9p21 염색체 이 상이 동반되고 25%에서 p14의 불활성화가 관찰된다.4 그러 나 이번 연구는 흥미롭게도 기존 보고와 다소 다른 결과를 보이는데 p16 단백질 발현은 이전의 보고들과 달리 경도의 이형성을 보인 2예를 제외하고는 대부분의 종양에서 정상 적인 핵내 염색소견을 보였다. 이와 반대로 p14의 경우 오 히려 타 보고와 달리 67.7%에서 염색의 소실 소견이 관찰되 었고 특히 염색소실을 보인 예들은 경도 및 고도 이형성 시 기부터 관찰되어 암화의 초기 단계인 이형성 유도에 p14가 기여할 것으로 추정된다. 그러나 그 예가 적어 더 많은 조직 에서 조사가 필요할 것으로 생각한다.
이번 연구에서 이전의 조사들과 달리 p53 및 p16의 발현 이상 빈도가 낮고 상대적으로 p14의 이상발현 빈도가 높은 상이한 결과를 보이는 데는 여러 가지 이유가 있으나 우선 기존의 보고에서와 다른 종류의 암종이므로 기존의 담관암 과는 다른 유전자 변이에 의해 발생할 가능성을 고려해야 한다. 또한 이번 연구에 사용된 조직은 경도 및 고도 이형성 의 악성화 초기 조직이 많이 포함되어 있어 진행된 암조직 을 사용한 기존의 조사들에 반해 암화 이전 이형성 단계의 유전자 변이에 대한 자료를 제시할 수 있는 의미 있는 결과 라 할 수 있다.
이번 연구는 유전자 변이를 단백질 발현 여부만으로 조사 하였다는 한계점이 있는데 결과에서 보이는 p14 및 p16의 면역염색 저하가 실제 유전자의 변이와 일치할 것인지 하는 문제가 있다. 그러나 기존의 연구를 종합하면12-16,17 p14 및 p16 단백의 면역염색 발현 정도는 유전자 변이와 비교적 잘 일치한다. 실제 p16 유전자 변이가 있는 종양에서는 거의 모두 p16 단백의 염색이 관찰되지 않은 반면 정상 조직이나 유전자 변이가 없는 조직에서는 모든 예에서 p16 핵내 염색 이 관찰되어 면역염색과 p16 유전자 이상은 좋은 상관관계 를 보인다.14 p14의 경우도 유사하여 p14 촉진자의 과메틸화 를 보인 25%의 종양 환자에서 모두 p14 면역염색이 되지 않아 비록 이번 연구는 단백발현까지만을 관찰하였으나 이 러한 단백발현의 변화와 유전자 변이가 비교적 좋은 상관관 계를 보임을 예측할 수 있다. 그러나 향후 이번 조사에서 보 이는 단백이상과 유전자 변이와 관련성은 추가로 조사해야 할 것이다.
요약하면 점액과분비 담관암에서 p14, p16 및 p53의 변화 는 암화의 각기 다른 단계에 작용할 것으로 추정되며 이번 연구에서 관찰된 단백이상과 관련된 유전자 변이를 향후 추 가로 조사한다면 담관암 발생기전의 이해에 큰 도움이 될 것으로 생각한다.
요 약
목적: 점액과분비 담관암은 과형성, 선종, 또는 선암에 이 르기까지 다양한 병리 소견을 보여 단계에 따른 유전자 발 현양상의 관찰은 담관암 발생기전의 이해에 도움이 된다.
이번 연구는 수술로 채취한 점액과분비 담관암 조직에서 p16, p14 및 p53의 발현을 면역조직화학 염색을 이용하여 조사하였다. 대상 및 방법: 1995년부터 2002년까지 서울아 산병원을 방문하여 점액과분비 담관암으로 진단받은 58명 의 환자 중 종양 절제술을 시행받아 확진된 22명을 대상으 로 하였다. 22개의 수술조직을 경도 이형성, 고도 이형성, 상피내 암종, 침습 암종으로 분류하고 한 환자에서 다양한 병리소견을 보이는 경우 그 각각에 대해 p53 및 p14, p16 면 역조직화학 염색을 시행하였다. 결과: 경도 이형성 9예, 고 도 이형성 4예, 상피내암종 11예, 그리고 침습 암종 10예를 포함하는 34예의 조직을 대상으로 하였다. p53 과염색은 이 형성에서는 관찰되지 않았고 상피내암종 3예 및 침습 암종 3예의 6예(17.6%)에서 관찰되었고, 이형성 단계보다 암조직 에서 의미 있게 발현되었다(p＜0.05). p16 염색소실은 경도 의 이형성 조직 2예(6%)에서만 관찰되었으나 p14 염색의 소 실은 21예(67.7%, 경도 이형성 7예, 고도 이형성 2예, 상피내 암종 8예, 침습 암종 4예)에서 관찰되었다. 이들은 p53에 비 해 단백발현 변화가 이형성 시기부터 있는 경우가 의미 있 게 많았다(p＜0.05). 결론: 점액과분비 담관암의 발생에서 p14는 이형성 시기부터 관찰되어 초기 단계의 이형성 유도 에 기여할 것으로 추정되며 이와 달리 p53은 암화로 진행되 는 데 관련된 인자일 가능성을 시사한다.
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염색
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