항체 동정용 희귀 적혈구의 냉동 보존법 비교

󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏

접수일：2008년 7월 31일, 승인일：2008년 8월 22일

항체 동정용 희귀 적혈구의 냉동 보존법 비교

서 지 원ㆍ한 규 섭

서울대학교병원 진단검사의학과

= Abstract =

Comparison of Cryopreservation Methods of Rare Red Blood Cells Used for Antibody Identification Tests

Ji-Weon Seo, Kyou-Sup Han

Department of Laboratory Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul, Korea

Background: When a certain antibody, which is not clearly identified, is detected before transfusion, rare red blood cells (RBCs) should be used for antibody identification. But its rarity make it difficult to identify the antibody. This study compared the high glycerol method with the liquid nitrogen method for the cryopreservation of rare RBCs that are used for antibody identification.

Methods: The frozen RBCs were thawed every 2 months to measure the strength of agglutination. We observed the changes of the strength of agglutination. The Di^a antigen, which is relatively frequent in Asians, was included in this study.

Results: Using the high glycerol method, the decrease of the strength of agglutination was observed with using the k antigen from 4 months and the decrease of the strength of agglutination was observed with using M, N, s, Le^a, Le^b and Fy^b antigens from 8 months. With freezing the donor RBCs by the liquid nitrogen method, the decrease of the strength of agglutination was observed with using the C, s, k and Le^b antigens from 2 months, with using the M and S antigens from 4 months, with using the D, c, e, N and Fy^a antigens from 6 months and with using the Le^a antigen from 8 months. Rare RBCs with the Di^a antigen were successfully cryopreserved for 6 months with using the high glycerol method. For the commercial screening cells, the high glycerol method showed effective cryopreservation with using c, e, M, k, Le^a, Le^b, Jk^a and Fy^b antigens for 6 months or longer.

Conclusion: We were able to preserve most of the important antigens of the RBCs for at least 6 months without a significant decrease of reactivity by employing the high glycerol cryopreservation technique. (Korean J Blood Transfus 2008;19:120-131)

󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏

Key words: Cryopreservation, Rare red blood cells, High glycerol method, Liquid nitrogen method, Antibody identification

서 론

비예기항체는 용혈성수혈부작용이나 신생아 용혈성질환을 유발하므로 수혈 전 항체 선별 및 동정 검사를 통해 적혈구 비예기항체의 존재와 특이성을 확인함으로써 수혈부작용의 발생을 방 지할 수 있다. 임상적으로 중요한 적혈구 항원들 을 가지고 있는 O형 혈구들과 환자의 혈청을 37^oC 식염수법 및 항글로불린법으로 반응시킴으 로써 비예기항체를 확인할 수 있으나 항체가 동 정되지 않을 경우 희귀 항원에 대한 항체를 고려 해 보아야 하며, 저빈도 항원이나 고빈도 항원 혹 은 서양인에서는 드물고 한국인에 흔한 항원이 이에 해당된다.

저빈도 항원들로는 Kell 혈액형 군의 K, Kp^a, Js^a 항원과 Lutheran 혈액형군의 Lu^a 항원 등이 있 다. K 항원은 서양인의 9%로 표현되며, Lu^a 항원 은 백인의 7.7%에서 관찰된다.¹⁾ Kp^a와 Js^a 항원도 백인에서 그 빈도가 상당히 낮은 것으로 알려져 있다. 저빈도 항원의 경우 동정용 혈구 제작 시 항상 포함되지 못하며, 따라서 저빈도 항원에 대 한 항체 생성 의심 시 동정용 혈구를 확보하지 못 하여 확인하지 못할 가능성이 높다.

고빈도 항원으로는 Jr^a, At^a 항원 등이 있다. Jr^a 항원은 거의 모든 사람에게 표현되나 일본에서는 0.03∼0.12%에서 표현되지 않는 것으로 알려져 있으며 항-Jr^a 항체에 의한 신생아용혈성질환과 용혈성수혈부작용이 보고되어 있다.²⁾ At^a 항원도 거의 대부분에서 표현되나 항원이 음성인 환자에 서 용혈성수혈부작용이 보고된 바 있다.³⁾ 현재 검사실에서 사용하는 동정용 혈구는 주로 서양인의 혈구를 사용하여 만들어지므로 백인에 서는 드물고 아시아에서 독특한 항원들은 제외된 경우가 흔하다. Di^a 항원은 서양인에서는 거의 관 찰되지 않으나 몽골인에서 9.9%, 일본인에서 8.8%

등 아시아에서는 흔하게 나타난다.⁴⁾ 국내에서도 12.6%로 서양인에 비해 높게 표현되는 것으로 알 려져 있으며,⁵⁾ 항-Di^a 항체에 의한 신생아용혈성 질환이 보고된 바 있다.⁶⁾ Wr^a 항원은 한국인에서 는 0.7%로 표현되며,⁵⁾ Mi^a 항원도 서양인에서 0.1% 미만에서 표현되나 중국인에서는 7%로 높 게 표현된다.⁷⁾ 수혈부작용을 유발할 수 있는 항 체는 현재 검사실에서 사용하는 시약에 포함되지 않아 항체를 동정되지 못할 가능성이 높으며 따 라서 한국에 흔한 항원을 가진 동정용 혈구를 확 보해야 할 필요가 있다.

적혈구의 냉동에 사용되는 냉동보호제로 현재 글리세롤이 가장 많이 사용되고 있다. 글리세롤 은 동결 중 세포 외 용질의 농도 증가를 조절하고 얼음 결정에 의해 흡수되는 물의 양을 줄여 탈수 로 인한 세포의 손상을 막으며,^8,9) 37년까지 냉동 보관 후 75% 이상의 적혈구를 획득하였다는 보 고도 있다.¹⁰⁾

동결보호제를 사용하지 않고 액체질소를 이용 하여 적혈구를 냉동 보관하는 방법도 있다. 수혈 용이 아닌 시약용 적혈구 보관에 사용되며 방법 이 비교적 간단하고 동결보호제를 세척할 필요가 없는 장점이 있다.¹¹⁾

이에 본 연구에서는 항체 동정용 희귀 적혈구 를 장기적으로 보존하여 희귀 항체 검출에 이용 하고자 고농도 글리세롤법과 액체질소법을 비교 하였다.

재료 및 방법

1. 적혈구

Di^a 항원을 포함하여 적혈구 항원이 적절히 조 합된 5명 공혈자 적혈구와 항체 선별용 적혈구인 Search-Cyte (Medion Diagnostics, Dudingen, Swit-

zerland)를 사용하였다. 각각의 적혈구를 냉동시 킨 후 2개월 간격으로 해동하여 응집 강도의 변 화를 관찰하였다.

2. 시약

항체로는 Anti-A, Anti-B, Anti-D (Celliance, Livingston, UK)와 Anti-C, Anti-c, Anti-E, Anti-e, Anti-M, Anti-N, Anti-S, Anti-s, Anti-K, Anti-k, Anti-Le^a, Anti-Le^b, Anti-Jk^a, Anti-Jk^b, Anti-Fy^a, Anti-Fy^b, Anti-Lu^b, Anti-Di^a, Anti-Di^b (Biotest, Dre- ieich, Germany)를 사용하였고, 항글로불린 시약 은 Anti-Human Globulin Mono-Type (Medion Diag- nostics)을 사용하였다.

3. 냉동 및 해동시약

고농도 글리세롤법에서는 DiaMed CellFreeze, DiaMed CellThaw, ID-CellStab solution (DiaMed, Morat, Switzerland)을 사용하였고 액체질소법에 서는 Glycerine, 0.3 M glucose (Duksan pharma- ceutical co., Kyungkido, Korea), 3.45 M sucrose (SIGMA, St. Louis, MO, USA), 0.05 M NaCl (Seoul Chemical Industry co., Seoul, Korea)로 제조하여 사용하였다.

4. 냉동법

고농도 글리세롤법에서 냉동은 3,400 RPM에 서 2분간 원심 침전시켜 혈장을 제거한 후 침전 된 적혈구를 ID-CellStab solution (DiaMed)으로 3 회 세척하고 세척된 적혈구를 DiaMed CellFreeze solution (DiaMed)과 1.2：100의 비율로 혼합하여 9 mL씩 분주한 후 −80^oC 냉동고에서 보존하였 다. 해동은 냉동된 적혈구 부유액을 실온에서 30 분간 방치한 후, 해동된 적혈구 부유액과 DiaMed CellThaw solution (DiaMed)을 1：1의 비율로 섞 고 3,400 RPM에서 2분간 원심 분리하여 상층액

을 버렸다. 위의 과정을 3회 반복한 후, ID-Cell- Stab solution (DiaMed)으로 2회 세척 후 생리식염 수로 5% 적혈구 부유액을 만들었다.

액체질소법에서 냉동은 3,400 RPM에서 2분간 원심 침전시켜 혈장을 제거한 후 침전된 적혈구 를 생리식염수로 3회 세척하였다. 세척된 적혈구 와 동량의 자가 제조한 냉동보존액을 섞은 후 실 온에서 30분간 반응시키고 액체질소에 혈청분리 관을 이용하여 한 방울씩 떨어뜨려 냉동시켰다.

냉동된 적혈구를 1.8 mL Cryotube (Nunc, Ros- kilde, Denmark)에 넣고 5개씩 canister에 넣어 액 체질소통에서 냉동 보존하였다. 해동은 액체질소 통에서 Cryotube를 꺼내어 37^oC의 생리식염수에 해동시킨 후, 3,400 RPM에서 2분간 원심 침전시 킨 후 상층액을 제거하였다. 37^oC에서 생리식염 수로 2회 더 세척하였으나 실험 중 용혈이 자주 관찰되어 4개월 냉동 후 해동한 실험부터는 추가 세척 없이 생리식염수로 5% 적혈구 부유액을 만 들었다.

5. 항원항체 반응 해석

1：128까지 배수 희석한 항체를 5% 적혈구 부 유액과 50 uL씩 넣은 후 항체 종류대로 제조사에 서 제시한 방법으로 실온 및 항글로불린 단계로 반응시켰다. 결과는 육안 관찰 시 하나의 큰 응집 이 있고 배경이 맑은 경우(4; 4＋), 육안 관찰 시 몇 개의 큰 응집들이 있고 배경이 맑은 경우(3;

3＋), 육안 관찰 시 크고 작은 응집들이 있으면서 배경이 맑은 경우(2; 2＋), 육안 관찰 시 많은 작 은 응집들이 있으면서 배경이 지저분한 경우(1;

1＋), 육안관찰 시 응집이 없는 경우(0; −)의 5단 계로 구분하여 판독하였다.

통계처리는 SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를 이용하였다. 두 가지 냉동법에 따른 적혈구 응 집강도의 비교는 Wilcoxon 부호순위 검정을 이용

Table 1. Agglutination strength of D, C, c, E and e antigens at 1：8 dilution according to storage time

　2 months 4 months 6 months 8 months

Ag No 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈

FR HG LG P value FR HG LG P value FR HG LG P value FR HG LG P value

D 1 4 4 3 P1=0.02 4 4 H P1=1.0 4 4 H P1=0.046 3 3 H P1=1.0

2 4 4 3 P2=0.014 4 4 H P2=0.317 3 3 3 P2=0.005 4 4 3 P2=0.046

3 4 3 3 P3=0.257 4 4 4 P3=0.317 4 3 3 P3=0.206 4 4 4 P3=0.046

4 3 1 H 3 3 3 3 3 3 3 3 3

5 4 3 4 4 4 3 4 4 3 4 4 H

C 1 3 3 3 P1=0.317 2 2 H P1=0.157 2 2 H P1=0.157 3 3 H P1=1.0

2 3 3 2 P2=0.003 2 3 H P2=0.046 2 2 2 P2=0.046 3 3 2 P2=0.014

3 3 3 2 P3=0.008 3 3 3 P3=0.046 2 2 2 P3=0.083 3 3 2 P3=0.014

4 3 3 H 3 3 2 3 3 2 3 3 3

5 3 3 3 3 3 2 3 3 2 3 3 H

c 1 3 3 3 P1=0.317 3 3 H P1=0.157 3 3 3 P1=0.317 3 3 3 P1=1.0

2 3 4 3 P2=0.083 3 3 3 P2=0.317 3 3 2 P2=0.034 4 4 3 P2=0.046

P3=0.046 P3=1.0 P3=0.059 P3=0.046

E 1 3 3 3 P1=0.564 3 3 H P1=0.157 3 2 3 P1=0.046 3 3 3 P1=0.083

2 3 4 3 P2=1.0 3 3 3 P2=1.0 3 3 3 P2=0.317 4 3 3 P2=0.083

P3=0.564 P3=1.0 P3=0.18 P3=1.0

e 1 4 4 4 P1=0.157 4 4 H P1=1.0 4 4 H P1=0.317 4 4 H P1=1.0

2 4 4 3 P2=0.025 4 4 H P2=1.0 3 3 3 P2=0.046 4 4 3 P2=0.014

3 4 4 4 P3=0.083 4 4 4 P3=1.0 4 4 3 P3=0.18 4 4 4 P3=0.014

4 4 4 H 4 4 4 4 4 3 4 4 3

5 4 3 3 4 4 4 4 4 3 3 3 H

Abbreviations: Ag, antigen; FR, fresh; HG, high glycerol method; LG, low glycerol method; H, hemolysis; P1, FR vs HG; P2, FR vs LG; P3, HG vs LG.

하였다. P＜0.05인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결 과

1. 공혈자 적혈구의 응집 강도의 비교

ABO 혈액형 군에서는 A, B 항원 모두 고농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시는 8개월 후 해동하 여도 적혈구 응집 강도가 감소하지 않았다.

Rh 혈액형 군에서 D 항원은 고농도 글리세롤

법으로 냉동 보존 시 2, 6개월에서는 응집 강도의 저하가 보였지만 각각 다른 한명의 공혈자에서만 관찰되었고 8개월째는 적혈구 응집 강도가 감소 하지 않았다. 저농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 전 기간에서 한두 차례씩 용혈이 관찰되었으 며 용혈을 제외하고 응집 강도의 변화를 비교 시 6개월부터 적혈구의 응집 강도가 감소하였다 (Table 1). C 항원은 고농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 전 기간에서 적혈구 응집 강도가 감소하 지 않았다. 저농도 글리세롤법으로 보존 시 전 기 간에서 한두 차례씩 용혈이 관찰되었고 용혈을

Table 2. Agglutination strength of M, N, S, s, k, Le^a and Le^b antigens at 1：4 dilution according to storage time

　2 months 4 months 6 months 8 months

Ag No 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈

FR HG LG P value FR HG LG P value FR HG LG P value FR HG LG P value

M 1 3 4 4 P1=0.705 3 3 H P1=1.0 3 3 H P1=1.0 3 3 H P1=0.046

2 3 3 2 P2=0.705 3 3 H P2=0.005 3 3 3 P2=0.009 3 3 2 P2=0.083

3 3 2 H P3=0.025 3 3 2 P3=0.005 3 3 1 P3=0.009 3 1 3 P3=0.165

4 2 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 H

N 1 1 2 1 P1=0.317 1 1 H P1=0.317 2 2 2 P1=0.083 2 2 0 P1=0.023

2 3 3 3 P2=0.317 4 3 4 P2=0.063 4 3 3 P2=0.015 4 3 3 P2=0.026

3 1 1 H P3=0.317 2 3 1 P3=0.157 3 3 1 P3=0.068 3 1 3 P3=0.732

S 1 2 2 H P1=0.014 3 2 2 P1=0.157 2 0 0 P1=0.063 2 1 2 P1=0.317

2 3 2 3 P2=0.317 2 2 1 P2=0.024 2 2 1 P2=0.038 1 1 H P2=1.0

P3=0.083 P3=0.038 P3=0.157 P3=0.317

s 1 1 1 1 P1=0.014 1 1 H P1=0.083 1 1 H P1=0.059 1 1 H P1=0.046

2 2 1 2 P2=0.025 1 1 H P2=0.046 1 1 1 P2=0.002 1 1 0 P2=0.025

3 2 1 1 P3=0.655 2 2 1 P3=0.046 2 1 1 P3=0.046 1 1 1 P3=0.655

4 1 1 H 1 1 1 1 0 0 1 0 0

5 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 H

k 1 2 0 0 P1=0.059 1 1 H P1=0.008 1 1 H P1＜0.001 1 1 H P1=0.034

2 2 2 2 P2=0.015 1 1 H P2=0.014 2 1 1 P2=0.003 1 1 1 P2=0.083

3 2 2 1 P3=0.083 2 2 1 P3=0.317 3 1 1 P3=1.0 1 1 1 P3=0.257

4 2 2 H 1 1 1 1 1 1 2 0 1

5 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 H

Le^a 1 1 1 1 P1=1.0 1 1 1 P1=0.317 2 2 1 P1=1.0 3 1 1 P1=0.015

2 2 2 H P2=1.0 3 3 1 P2=0.102 1 1 1 P2=0.157 1 1 1 P2=0.046

P3=1.0 P3=0.102 P3=0.157 P3=0.317

Le^b 1 1 1 0 P1=0.317 1 1 H P1=0.157 0 0 H P1=0.317 1 1 H P1=0.046

2 2 2 2 P2=0.008 2 2 H - 1 1 1 P2=0.317 2 1 0 P2=0.059

P3=0.014 - P3=0.317 P3=0.059

Abbreviations: See Table 1.

제외하고 적혈구 응집 강도의 변화를 비교 시 전 기간에서 적혈구 응집 강도가 감소하였고, c 항원 의 경우 고농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 전 기간에서 적혈구 응집 강도는 감소하지 않았다.

저농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 4개월에 한 차례 용혈이 관찰되었고 용혈을 제외 시 6개월부 터 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었다. E 항 원은 고농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 6개월

에서 두 명의 공혈자 중 1명에서 적혈구 응집 강 도의 감소가 관찰되었으나 8개월에서는 적혈구 응집 강도의 감소가 없었다. 저농도 글리세롤법 으로 냉동 보존 시 전 기간에서 적혈구 응집 강도 의 저하가 없었으나, e 항원은 고농도 글리세롤법 으로 냉동 보존 시 적혈구 응집 강도의 감소는 없 었다. 저농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 전 기 간에서 한두 차례씩 용혈이 관찰되었으며 용혈을

제외하고 적혈구 응집 강도의 변화를 비교 시 6 개월부터 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었 다.

MNS 혈액형 군에서 M 항원은 고농도 글리세 롤법 사용 시 8개월부터 적혈구 응집 강도의 감 소가 관찰되었다. 저농도 글리세롤법 사용 시는 전 기간에서 한두 차례씩 용혈이 관찰되었으며 용혈을 제외하고 적혈구 응집 강도의 변화를 비 교 시 4개월부터 적혈구 응집 강도의 감소가 관 찰되었다. 두 방법 간의 차이는 2, 4, 6개월에서는 관찰되었으나 8개월에서는 두 방법 간의 차이를 보이지 않았고, N 항원은 고농도 글리세롤법 이 용 시 8개월에서 적혈구 응집 강도의 감소가 있 었다. 저농도 글리세롤법 이용 시 2, 4개월에서 한 차례씩 용혈이 관찰되었으며 6개월부터 적혈 구 응집 강도의 감소가 있었다(Table 2). S 항원은 고농도 글리세롤법 사용 시 2개월에서만 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었다. 저농도 글리세 롤법 사용 시 2, 8개월에서 한 차례씩 용혈이 관 찰되었으며 용혈을 제외하고 적혈구 응집 강도의 변화를 비교하였을 때 4개월부터 적혈구 응집 강 도의 감소가 관찰되었으며, s 항원의 경우 고농도 글리세롤법에서는 2, 8개월에서 적혈구 응집 강 도의 감소가 관찰되었다. 저농도 글리세롤법에서 는 전 기간에서 한두 차례씩 용혈이 관찰되었으 며 전 기간을 통해 적혈구 응집 강도의 감소가 관 찰되었다.

Kell 혈액형 군인 k 항원에서 2개월에 5번의 해 동 중 1번에서 두 가지 방법 모두 응집이 관찰되 지 않았다. 고농도 글리세롤법은 4개월부터 적혈 구 응집 강도의 감소가 관찰되었다. 저농도 글리 세롤법은 전 기간에서 한두 차례씩 용혈이 관찰 되었으며 용혈을 제외하고 적혈구 응집 강도의 변화를 비교 시 전 기간에서 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었다(Table 2).

Lewis 혈액형 군에서 Le^a 항원의 경우 저농도 글리세롤법에서 2개월에서 한 차례 용혈이 관찰 되었으며 두 가지 방법 모두 8개월에서 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었고, Le^b 항원은 고농 도 글리세롤법에서 8개월에서 적혈구 응집 강도 의 감소가 관찰되었다. 저농도 글리세롤법에서는 2개월에서 적혈구 응집 강도의 저하가 관찰되었 고 그 이후에는 용혈이 자주 관찰되었다(Table 2).

Kidd 혈액형 군에서 Jk^a 항원은 고농도 글리세 롤법으로 냉동 보존 시 전 기간에서 적혈구 응집 강도가 감소하지 않았다. 저농도 글리세롤법은 2, 8개월에서 한 차례씩 용혈이 관찰되었고 용혈을 제외 시 응집 강도의 저하는 없었고, Jk^b 항원은 고농도 글리세롤법은 8개월까지 적혈구 응집 강 도의 감소가 없었다. 저농도 글리세롤법은 4, 6, 8개월에서 한두 차례씩 용혈이 관찰되었으며 용 혈을 제외하고 적혈구 응집 강도의 변화를 비교 시 적혈구 응집 강도의 감소는 관찰되지 않았다 (Table 3).

Duffy 혈액형 군에서 Fy^a 항원은 고농도 글리세 롤법에서 6개월에서 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었으나 8개월에서는 적혈구 응집 강도의 감소가 없었다. 저농도 글리세롤법에서는 전 기 간에서 한두 차례씩 용혈이 관찰되었으며 6개월 부터 적혈구 응집 강도가 감소하였으며, Fy^b 항원 은 고농도 글리세롤법에서는 8개월에서 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었다. 저농도 글리세 롤법에서는 4개월부터 한 명의 공혈자에게서 계 속 용혈이 관찰되었다(Table 3).

Lutheran 혈액형 군인 Lu^b 항원은 고농도 글리 세롤법 사용 시 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰 되지 않았다. 저농도 글리세롤법으로 보존 시 전 기간에서 한두 차례씩 용혈이 관찰되었으며 용혈 을 제외하고 적혈구 응집 강도의 변화를 비교하 였을 때 6개월에서 적혈구 응집 강도의 감소가

Table 3. Agglutination strength of Jk^a, Jk^b, Fy^a, Fy^b and Lub antigens at 1：2 dilution according to storage time

　2 months 4 months 6 months 8 months

Ag No 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈

FR HG LG P value FR HG LG P value FR HG LG P value FR HG LG P value

Jk^a 1 1 1 H P1=0.317 1 1 1 P1=0.157 1 1 0 P1=1.0 1 0 1 P1=0.157

2 1 1 1 P2=1.0 1 1 1 P2=0.317 0 0 0 P2=0.157 1 1 H P2=1.0

P3=0.317 P3=0.564 P3=0.157 P3=0.157

Jk^b 1 2 1 2 P1=0.083 1 1 H P1=0.083 1 1 H P1=0.083 1 1 H P1=0.157

2 1 1 1 P2=0.317 1 1 H P2=0.317 1 1 1 P2=0.157 1 1 1 P2=0.083

3 1 1 1 P3=0.317 2 1 2 P3=0.157 1 1 1 P3=1.0 1 1 1 P3=0.317

4 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 H

Fy^a 1 2 2 2 P1=0.317 1 1 H P1=0.083 1 1 H P1=0.034 2 2 H P1=0.157

2 2 2 2 P2=1.0 1 1 H P2=0.083 1 1 1 P2=0.011 1 1 1 P2=0.317

3 1 1 1 P3=0.317 2 1 1 P3=1.0 1 0 0 P3=0.317 1 1 1 P3=0.083

4 2 2 H 1 1 1 1 1 0 1 1 1

5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 H

Fy^b 1 1 1 1 P1=0.059 1 1 H P1=1.0 1 1 H P1=0.059 1 0 H P1=0.025

2 2 0 1 P2=0.157 1 1 1 P2=1.0 1 0 0 P2=0.059 1 1 1 P2=0.317

P3=0.083 P3=1.0 P3=1.0 P3=1.0

Lu^b 1 1 0 0 P1=0.157 1 1 H P1=0.083 1 1 H P1=0.083 1 1 H P1=0.317

2 1 1 1 P2=0.083 1 1 H P2=0.083 1 1 1 P2=0.008 1 1 0 P2=0.083

3 1 1 1 P3=0.317 2 1 1 P3=0.317 1 1 1 P3=0.102 1 1 1 P3=0.157

4 1 1 H 1 1 1 1 1 0 1 1 1

5 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 H

Abbreviations: See Table 1.

관찰되었다(Table 3).

Diego 혈액형 군에서 Di^a와 Di^b 항원 모두 고농 도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 냉동 전에 비해 6개월까지 적혈구 응집 강도는 감소하지 않았다.

저농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 2개월에서 응집 강도의 감소와 4, 6개월에서 용혈이 관찰되 었으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았 다.

2. 항체 선별용 적혈구의 응집 강도 비교

Rh 혈액형 군 중 c 항원은 전 기간에 걸쳐 저농 도 글리세롤법에서 고농도 글리세롤법에 비해 응 집 강도의 감소가 관찰되었다. 고농도 글리세롤

법에서 4, 6개월 해동 후 각각 2, 4개월과 비교하 였을 때 적혈구 응집 강도의 감소는 관찰되지 않 았고, e 항원은 4개월부터 저농도 글리세롤법에 서 고농도 글리세롤법에 비해 응집 강도의 감소 가 관찰되었다. 고농도 글리세롤법에서 4, 6개월 해동 후 각각 2, 4개월과 비교하였을 때 적혈구 응집 강도의 감소는 관찰되지 않았다(Table 4).

MNS 혈액형 군에서 M 항원은 전 기간에서 저 농도 글리세롤법에서 고농도 글리세롤법에 비해 적혈구 응집 강도가 감소하였다. 고농도 글리세 롤법에서 6개월 해동 후 2, 4개월에 비해 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었다(Table 4).

Kell 혈액형 군인 k 항원은 전 기간에 걸쳐 저

Table 4. Agglutination strength of various antigens of the commercial screening cells according to storage time

2 months 4 months 6 months

Ag No 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈 󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈󰡈

HG LG P value HG LG P value HG LG P value

c 1 3 2 P1=0.003 4 2 P1=0.002 4 2 P1=0.002

2 3 0 - 4 3 P2=0.705 4 2 P2=1.0

3 4 H - 4 2 - 4 2 P3=0.655

4 4 3 4 4 4 4

5 4 H 4 H 4 H

6 4 3 3 3 3 H

M 1 2 1 P1=0.024 2 1 P1＜0.001 3 0 P1=0.002

2 3 1 - 2 1 P2=0.096 3 0 P2=0.001

3 2 H - 2 0 - 3 0 P3=0.001

4 2 1 3 2 3 3

5 2 H 3 H 3 H

6 2 2 3 2 3 H

k 1 1 1 P1=0.011 2 1 P1＜0.001 1 0 P1=0.002

2 1 0 - 1 1 P2=0.655 1 0 P2=0.655

3 1 H - 2 0 - 2 0 P3=1.0

4 2 0 2 1 2 2

5 1 H 1 H 1 H

6 1 1 1 1 1 H

Le^a 1 1 0 P1=0.083 2 0 P1=0.002 2 0 P1=0.015

2 1 H - 1 0 P2=0.317 2 0 P2=0.157

3 2 1 - 2 1 - 2 H P3=0.083

Fy^b 1 1 0 P1=0.034 1 0 P1＜0.001 1 0 P1=0.005

2 2 0 - 1 1 P2=0.059 1 0 P2=0.034

3 1 H - 1 0 - 2 0 P3=1.0

4 1 0 1 1 1 1

5 1 H 1 H 1 H

6 1 1 1 1 1 H

Abbreviations: Ag, antigen; HG, high glycerol method; LG, low glycerol method; NT, not tested; H, hemolysis; P1, HG vs LG; P2, HG 2 months vs HG 4 or 6 months; P3, HG 4 months vs HG 6 months.

농도 글리세롤법에서 고농도 글리세롤법에 비해 응집 강도의 감소가 관찰되었다. 고농도 글리세 롤법에서 4, 6개월 해동 후 각각 2, 4개월과 비교 하였을 때 적혈구 응집 강도의 감소는 관찰되지 않았다(Table 4).

Lewis 혈액형 군에서 Le^a와 Le^b 항원 모두에서

4개월부터 저농도 글리세롤법에서 고농도 글리 세롤법에 비해 응집 강도의 감소가 관찰되었다.

고농도 글리세롤법에서 4, 6개월 해동 후 각각 2, 4개월과 비교하였을 때 적혈구 응집 강도의 감소 는 관찰되지 않았다(Table 4).

Kidd 혈액형 군에서 Jk^a 항원은 4개월부터 저농

도 글리세롤법에서 고농도 글리세롤법에 비해 응 집 강도의 감소가 관찰되었다. 고농도 글리세롤 법에서 4, 6개월 해동 후 각각 2, 4개월과 비교하 였을 때 적혈구 응집 강도의 감소는 관찰되지 않 았다.

Duffy 혈액형 군에서 Fy^b 항원은 전 기간에서 저농도 글리세롤법에서 고농도 글리세롤법에 비 해 응집 강도가 감소하였다. 고농도 글리세롤법 에서 6개월 해동 후 2개월과 비교하였을 때 적혈 구 응집 강도의 감소가 관찰되었다(Table 4).

고 찰

적혈구를 장기간 보관하기 위해 사용되는 방법 으로는 냉장 보관, 냉동 보관(cryopreservation), 냉 동 건조(lyophilization) 등이 이용되고 있다.¹²⁾ 적혈구의 체외 보관 시 유발되는 적혈구의 응 집과 생존력 및 기능의 저하는 항응고제인 구연 산과 보존제인 글루코스의 도입으로 향상되었 다.¹³⁾ 냉장 보관법은 일차 세계대전 중 Robertson 에 의해 도입된 방법으로 온도가 저하되면 생화 학 및 분자 반응이 억제되는 원리에 기반을 두고 있다.¹⁴⁾ 냉동 보관법도 역시 분자운동을 억제하 고 대사 및 생화학 반응을 정지시키는 원리로 적 혈구를 보존하며,¹⁵⁾ 냉장 보관법에 비해서 혈색 소의 구조와 세포막 등이 장기간 보관에도 영향 을 거의 받지 않아 생체 외에서 적혈구의 기능을 보존하면서 장기간 보존 가능한 유일한 방법으로 알려져 있다.^10,16)

냉동 시 세포 손상의 기전은 냉동 속도에 따라 크게 두 가지로 구분된다.¹⁷⁾ 냉동 속도가 느리면 세포 밖에 얼음 결정이 생겨 용질의 농도가 높아 지면서 세포 내의 물 분자가 세포막을 통과해 이 동할 시간이 주어진다. 따라서 세포는 탈수되어 크기가 작아지고 세포 안의 용질의 농도가 증가

하게 되므로 세포가 손상을 받게 된다.¹⁸⁾ 반대로 냉동 속도가 빠르면 세포 밖의 용질 농도가 증가 하고 이에 반응하여 물 분자가 이동할 시간이 없 으므로 세포 안에서 얼음 결정이 형성되어 직접 적으로 세포에 손상을 주는 것으로 알려져 있 다.¹⁹⁾ 따라서 세포의 냉동 보관 시에 발생하는 세 포 손상을 막기 위해 동결보호제의 사용이 필요 하며 이는 세포막 통과 유무에 따라 두 가지로 나 눌 수 있다. 세포막을 통과하지 못하는 동결보호 제는 hydroxyethyl starch (HES), polyvinyl pyrro- lidone (PVP), polyethylene oxide 등이 포함되며 세 포 안의 얼음 결정 생성과 용질 농도 증가를 억제 하여 세포를 보호한다.²⁰⁾ 세포막을 통과하는 동 결보호제로는 글리세롤, dimethyl sulfoxide (DMSO) 등이 포함되며 냉동 시 유발되는 과도한 세포 용 적의 감소를 막아서 세포를 보호한다.²¹⁾

현재 적혈구의 냉동 보관을 위해 임상적으로 유용하게 쓰이는 방법 중 고농도 글리세롤법은 주로 미국이나 캐나다에서 사용되며 비교적 느린 속도로 −80^oC에 냉동 저장시키고 빠른 속도로 해동시키는 방법이다.²²⁾ 고농도 글리세롤법의 경 우 k 항원을 제외한 모든 항원에서 최소 6개월까 지 보관이 가능할 것으로 생각된다. 공혈자 적혈 구를 냉동시켰을 때 뿐 아니라 상업용 항체선별 용 적혈구를 냉동시켰을 때도 해동 후 적혈구 응 집 강도가 유지되었다. 실제로 검사실에서 사용 하다 남은 선별용 적혈구를 냉동 보존한 후 사용 하게 될 것이므로 고농도 글리세롤법의 냉동 보 존법은 소량의 적혈구 냉동 보관에 더 적합한 방 법으로 생각된다. 고농도 글리세롤법의 경우 기 존의 냉동고를 사용할 수 있고 실온에서 조작이 가능하여 쉽게 처리할 수 있다. 본 실험에서는 한 번에 많은 양의 적혈구가 필요하여 약 25 mL정도 의 적혈구를 한 번에 해동시켰으나 실제로 검사 실에서 사용 시에는 더 적은 양의 적혈구를 사용

하게 될 것이므로 실험에 사용된 15 mL 튜브보다 더 작은 것을 이용하는 것을 고려해야 한다.

액체질소법은 냉동과 해동 과정에서 적혈구의 안정성이 떨어져 공혈자 적혈구 및 항체 선별용 적혈구에서 공히 약 30%에서 용혈이 발생하였 다. 해동시 물리적인 손상이 적혈구의 용혈을 촉 진하는 것으로 생각하여 생리식염수로 3회 세척 하는 과정을 4개월째부터는 1회로 제한하였으나 성적이 눈에 띄게 향상되지 않았다. 또한 고농도 글리세롤법에서도 해동시 3회 이상의 세척을 시 행하므로 직접적인 물리적 손상을 통한 적혈구의 용혈의 가능성은 떨어져 보인다. 한편 조작 과정 이 복잡하여 일부 적혈구는 최종 액체질소통에 들어가는 시간의 지연이 있었고, 이것이 해동시 용혈이 발생하는 원인인 것으로 생각된다. 액체 질소법의 경우 해동 후 용혈의 발생 외에도 일부 항원에서는 고농도 글리세롤법에 비해 적혈구 응 집 강도가 저하되는 것으로 관찰되었다. 특히 항 체 선별 검사 시 사용되는 Search-Cyte를 사용하 였을 때, 공혈자 적혈구를 사용할 때보다 액체질 소법에서의 응집 강도 감소가 더 심해지는 것이 관찰되었다. Search-Cyte는 채혈 후 냉동까지의 시간이 오래 걸리므로 시간적인 차이가 이런 결 과를 가져올 수 있다고 생각된다.

또한 희귀 항원에 대한 검사를 위해서 Di^a 항원 을 선별하였다. 고농도 글리세롤법에서는 6개월 까지는 해동 후 적혈구 응집 강도가 유지되었으 나 액체질소법의 경우 응집 강도의 감소가 관찰 되었다. 역시 고농도 글리세롤법이 항체 동정 검 사를 위한 희귀 항원의 냉동 보존에 이용될 수 있 을 것으로 생각된다.

비교적 항원이 잘 보존된 고농도 글리세롤법에 서도 항원의 종류에 따라 소실되는 시기에 차이 를 보였다. International Society of Blood Trans- fusion (ISBT)에서는 현재 적혈구의 항원으로 29

개의 혈액형 군을 규정하고 있다.²³⁾ 이 적혈구의 항원들은 항원결정인자(epitope)의 구성성분에 따 라 크게 구분되며 당 항원결정인자를 가지는 것 이 6개, 단백질로 구성된 것이 23개이다. 단백질 로 구성된 항원 중 적혈구 표면에 수동적으로 흡 착된 Chido/Roger를 제외한 22개의 항원 군을 세 군으로 분류할 수 있다. 즉, 세포막을 여러 번 통 과하는 막단백, 세포막을 한번만 통과하는 막단 백, GPI (glycosylphosphatidylinositol)가 연결된 막 단백으로 나누어 진다.²⁴⁾ 탄수화물로 이루어진 적혈구 항원에는 ABO, Lewis, P 등이 있다. 세포 막을 여러 번 통과하는 막단백에는 Rh, Kidd, Duffy, Diego 등 총 8개의 혈액형 군이 해당되고, 세포막을 한번만 통과하는 막단백에는 MNS, Kell, Lutheran 등 10개 혈액형 군이 해당되며, GPI 가 연결된 막단백에는 Dombrock, Cromer 등 4개 혈액형 군이 있다.²⁵⁾

본 실험에서 고농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 항원 소실이 관찰된 항원으로는 M, N, s, k, Le^a, Le^b, Fy^b 항원이 있었다. 이 중 세포막을 한번 만 통과하는 막단백은 M, N, s, k 항원으로 가장 많았고 특히 k 항원은 냉동 후 4개월부터 응집 강 도의 감소를 보였다. 나머지 세 항원은 6개월부 터 적혈구 응집 강도가 감소하였으나 두 명의 공 혈자로부터 얻은 결과로 앞의 4개의 항원에 비해 공혈자 수가 적었다. 비슷한 항원인 Fy^a 항원은 다섯 명의 공혈자로부터 얻은 결과로 통계적으로 유의한 응집 강도의 감소를 보이지 않은 점으로 미루어 Le^a, Le^b, Fy^b 항원의 응집 강도의 감소는 추가적인 관찰이 필요할 것으로 생각된다. 따라 서 여러 종류의 적혈구 항원 중 세포막을 한번만 통과하는 막단백으로 구성된 적혈구 항원이 가장 먼저 항원성이 상실되는 것으로 생각된다.

본 연구에서는 고농도 글리세롤법이 적혈구의 냉동 보관에 더 적합한 것으로 판단되었으며 액

체질소법은 조작 과정 중의 용혈의 가능성을 줄 일 수 있는 냉동 과정의 수정이 필요할 것으로 판 단된다. 항원의 종류에 따라서는 세포막을 한번 만 통과하는 막단백로 구성된 적혈구 항원이 냉 동 보관에 가장 취약한 항원으로 생각된다. 항원 에 따라 냉동 보관 시간의 차이는 보이지만 고농 도 글리세롤법을 사용 시 저빈도 항원이나 고빈 도 항원 혹은 한국인에 독특한 Di^a 항원 같은 희 귀 적혈구를 장기간 보관함으로써 비예기항체 동 정에 큰 도움이 될 것으로 생각된다.

요 약

배경: 수혈 전 항체 선별 검사에서 항체가 동정 되지 않는 경우 희귀 항원을 고려해 보아야 하지 만 선별용 혈구에 일부 희귀 항원들은 포함하지 않기도 하여 항체 동정에 어려움을 겪고 있다. 이 에 본 연구에서는 고농도 글리세롤법과 액체질소 법을 비교하여 항체 동정용 희귀 적혈구의 냉동 보존에 더 적합한 방법을 선정하고자 하였다.

방법: 5명의 공혈자 적혈구와 6가지의 항체 선 별용 적혈구를 고농도 글리세롤법과 액체질소법 의 두 가지 방법으로 냉동 보존한 후 2개월 단위 로 해동시켜 적혈구 응집 강도의 감소와 두 방법 간의 응집 강도의 차이를 비교하였다. 희귀 항원 으로 한국인을 포함한 아시아에 독특한 항원인 Di^a 항원을 포함하였다. 응집강도는 5단계로 분류 하였다. 통계적 분석을 위해 Wilcoxon 부호순위 검정을 이용하였다.

결과: 고농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 k 항원은 4개월부터 적혈구 응집 강도의 감소가 관 찰되었고 M, N, s, Le^a, Le^b, Fy^b 항원은 8개월부터 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었다. 액체질 소법을 이용한 20회의 냉동 보존 적혈구의 해동 중 6회에서는 용혈이 관찰되었다. 액체질소법으

로 냉동 보존 시 C, s, k, Le^b 항원은 전 기간에서 적혈구 응집 강도의 감소가 관찰되었으며, M, S 항원은 4개월, D, c, e, N, Fy^a 항원은 6개월, Le^a 항원은 8개월부터 적혈구 응집 강도의 감소가 관 찰되었다. 희귀 항원인 Di^a 항원의 냉동 보존에서 는 고농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 6개월까 지 응집 강도의 저하가 없었으나 액체질소법에서 는 응집 강도의 저하 및 용혈이 발생하였다. 항체 선별용 적혈구를 이용한 두 가지 냉동 보존법의 비교에서는 측정한 모든 항원인 c, e, M, k, Le^a, Le^b, Jk^a, Fy^b 항원에서 액체질소법의 적혈구 응집 강도가 고농도 글리세롤법에 비해 감소하였다.

고농도 글리세롤법으로 냉동 보존 시 대부분의 항원에서 6개월 이상 응집 강도의 저하없이 냉동 보존 가능하였다.

결론: 희귀 항체 검출을 위한 항체 동정용 적혈 구는 고농도 글리세롤법을 이용할 경우 대부분 최소 6개월 이상 보존할 수 있는 것으로 나타났 다.

참고문헌

1. Schenkel-Brunner H. Human blood groups.

2nd ed. Vienna: Springer, 2000:485-526 2. Nakajima H, Ito K. An example of anti-Jra

causing hemolytic disease of the newborn and frequency of Jr^a antigen in the Japanese po- pulation. Vox Sang 1978;35:265-7

3. Cash KL, Brown T, Sausais L, Uehlinger J, Reed LJ. Severe delayed hemolytic transfusion reaction secondary to anti-At^a. Transfusion 1999;39:834-7

4. Komatsu F, Hasegawa K, Yanagisawa Y, Kawabata T, Kaneko Y, Watanabe S, et al.

Prevalence of diego blood group Di^a antigen in Mongolians: comparison with that in

Japanese. Transfus Apher Sci 2004;30:119-24 5. Choi S, Kim SI, Cho HI. Study on gene

frequencies of blood groups in Koreans.

Korean J Hematol 1984;19:63-75

6. Tatarsky J, Stroup M, Levine P, Ernoehazy WS. Another example of anti-Diego(Di^a). Vox Sang 1959;4:152-4

7. Broadberry RE, Lin M. The incidence and significance of anti-Mi^a in Taiwan. Transfu- sion 1994;34:349-52

8. Snyder EL, Haley NR, Triulzi DJ. Cellular therapy. A physician's handbook. 1st ed.

Bethesda, Maryland: American Association of Blood Banks, 2004;41-2

9. Lelkens CC, Noorman F, Koning JG, Truijens- de Lange R, Stekkinger PS, Bakker JC, et al.

Stability after thawing of RBCs frozen with the high- and low-glycerol method. Transfusion 2003;43:157-64

10. Valeri CR, Rango G, Pivacek LE, Cassidy GP, Srey R, Hansson-Wicher M, et al. An experi- ment with glycerol-frozen red blood cells stored at -80 degrees C for up to 37 years. Vox Sang 2000;79:168-74

11. Huntsman RG, Hurn BA, Lehmann H. Storage of red cells for blood-grouping after freezing in liquid nitrogen. Br Med J 1960;9:118 12. Scott KL, Lecak J, Acker JP. Biopreservation of

red blood cells: past, present, and future.

Transfus Med Rev 2005;19:127-42

13. Rous P, Turner JR. The preservation of living red blood cells in vitro. I. Methods of pre- servation. J Exp Med 1916;23:219-37

14. Mollison PL. The introduction of citrate as an anticoagulant for transfusion and of glucose as a red cell preservative. Br J Haematol 2000;

108:13-8

15. Mazur P. Basic problems in cryobiology. In:

Timmerhaus KD. Advances in cryogenic engi- neering. 9th ed. New York: Plenum Press,

1964;28-37

16. Lecak J, Scott K, Young C, Hannon J, Acker JP. Evaluation of red blood cells stored at −80 degrees C in excess of 10 years. Transfusion 2004;44:1306-13

17. Mazur P, Leibo SP, Chu EH. A two-factor hypothesis of freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells. Exp Cell Res 1972;71:345-55

18. Pegg DE, Diaper MP. On the mechanism of injury to slowly frozen erythrocytes. Biophys J 1988;54:471-88

19. Mazur P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. J Gen Physiol 1963;47:

347-69

20. Meryman HT. Cryoprotective agents. Cryobio- logy 1971;8:173-83

21. McGann LE. Differing actions of penetrating and non penetrating cryoprotective agents.

Cryobiology 1978;15:382-90

22. Meryman HT, Hornblower M. A method for freezing and washing red blood cells using a high glycerol concentration. Transfusion 1972;

12:145-56

23. Daniels GL, Flectcher A, Garratty G, Henry S, Jørgensen J, Judd WJ, et al. Blood group terminology 2004: from the International So- ciety of Blood Transfusion committee on terminology for red cell surface antigens. Vox Sang 2004;87:304-16

24. Reid ME, Yahalom V. Blood groups and theia function. Baillieres Best Pract Res Clin Hae- matol 2000;13:485-509

25. Rojewski MT, Schrezenmeier H, Flegel WA.

Tissue distribution of blood group membrane proteins beyond red cells: evidence from cDNA libraries. Transfus Apher Sci 2006;35:

71-82