, Woon Jung Lee, B.S., Sung Eun Hur, M.D.

Interleukin-6의 전사조절부위 SNP와 폐경전 여성의 골밀도의 연관성에 관한 연구

이화여자대학교 의과대학 산부인과학교실, 건국대학교 의과대학 산부인과학교실¹, 건양대학교 의과대학 산부인과학교실²

이유선․박세나․이지영¹․이운정․허성은²․정혜원

Association Study of the Relationship Between Polymorphism of the Interleukin-6 Gene and Bone Mineral Density in Premenopausal Korean Women

Yu Sun Lee, M.D., Se Na Park, M.D., Ji Young Lee, M.D.

, Woon Jung Lee, B.S., Sung Eun Hur, M.D.

, Hye Won Chung, M.D.

Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, Ewha Womans University, Seoul, Korea Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, Konkuk, University, Seoul, Korea

Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, Konyang, University, Seoul, Korea

Objectives: To investigate a possible relationship between single nucleotide polymorphism of human IL-6 promoter －572 locus and peak BMD of Korean women.

Method: We examined BMD of 477 premenopausal Korean women (by peripheral DEXA) and extracted DNAs from peripheral blood samples. Polymerase chain reaction was used to detect IL-6 gene polymorphism.

Results: The mean age, height, and weight of patients were respectively 37.89±6.84 years, 158.70±4.81 cm, and 56.94±7.34 kg. They were not significantly different (P＞0.05). The genotype distribution was as follows; GG genotype, 263 (55.1%) women; GC genotype, 186 (40.0%) women; CC genotype, 28 (5.9%) women. BMDs of forearm in genotype GG, GC, CC were 0.56±0.17 g/cm

, 0.59±0.19 g/cm

, 0.58±0.19

g/cm

, respectively. They were not significantly different (P＞0.05). BMDs of calcaneus were 0.47±0.09 g/cm

, 0.47±0.10 g/cm

, 0.46±0.11 g/cm

, respectively. There was no statistical significance in BMD in each genotypes (P＞0.05).

Conclusion: We concluded that IL-6 -572 SNP have no correlation with BMD of premenopausal Korean women. IL-6 promoter -572 SNP would not be a genetic factor of premenopausal bone mineral density.

Key Words: Interleukin-6, Bone mineral density, SNP, Premenopause

3)

폐경 후 골다공증은 많은 부분 최대 골량에 의하 여 결정되므로 폐경 후 골다공증 예방에 가장 효과

책임저자 : 정혜원, 이화여자대학교 의과대학 산부인과학 교실

Tel: 02)650-5568, Fax: 02)2647-9860 E-mail: [email protected]

적인 방법은 되도록 높은 최대 골량을 만들 수 있

게 하는 것이다. 어떤 시점에 있어서 골량은 성장기

에 이루어진 최대 골량 (Peak bone mass)과, 노화에

따른 골량 감소의 정도에 따라 결정지어지게 된다

.

최대 골량 (peak bone mass)은 일생 동안 일정하게

골밀도와 관련이 있으며 실제로 70세의 골량까지도

최대 골량에 의해 좌우된다. 최대 골량에 이르는 나 이는 일반적으로 20～45세 사이로 알려지고 있으며 남자가 여자보다 높은 최대 골량을 보인다. 최대 골 량에 이르는 나이는 부위에 따라 다른데 피질골과 해면골의 상대적 량에 따라 다르며 hip이 spine보다 최대골량에 이르는 나이가 이르며 spine은 30대 초 반까지 꾸준히 증가한다

.

최대 골량은 주로 유전적인 영향을 받으며 영양 과 lifestyle의 영향도 받는다. 최대 골량이 10% 증 가하면 골다공증이 13년 늦게 발생하는 것으로 보 고되어 최대 골밀도가 골다공증 발생에 가장 중요 한 예측 인자이다

. 가족은 유전 성향이나 환경이 유사하기 때문에 유사한 골밀도를 갖는 경우가 많 다. 골다공증은 유전적인 질환으로 알려져 있는데 쌍둥이연구에서 유전적인 소인과 골량이 강한 연관 관계가 있다고 보고되어 유전에 의하여 폐경 전 여 성에서 lumbar spine BMD의 92%, femoral neck BMD의 70%가 결정된다고 보고되었다

. 부모와 자 녀를 대상으로 한 연구에서도 최대 골량이 강한 유 전성 경향이 있다는 것이 알려져 있다

. 골대사에 관여하는 유전자를 찾으려는 연구가 1995년도 이후 전 세계적으로 진행되기 시작하여 최근 여러 후보 유전자에서의 다형성 (polymorphism) 연구가 진행 중이다. 그 중에서, vitamin D 수용체

, 에스트로겐 수용체

, collagen-I-α-1 (COLIA1) 유전자

및 골 단백질, 호르몬, 사이토카인에 대한 유전자에 대해 연구가 활발히 연구되고 있다. 여러 사이토카인 중 에서 interleukin-6 (IL-6)는 B cell- differentiated factor 로 알려져 있으며 면역반응과 조혈작용에서 뿐 아 니라 골흡수를 조절하는데 있어서 필수적인 다기능 적인 사이토카인이다. IL-6는 세포 표면의 IL-6 수 용체와 결합함으로써 작용을 하며 파골세포의 생성 을 자극함으로써 골 흡수를 증가시키게 된다. IL-6 는 파골세포에 의한 골흡수를 촉진시키며 폐경후, Paget’s disease, and rheumatoid arthritis와 관련이 있

다

. IL-6는 스테로이드 호르몬의 감소에 의하여

증가하는데 IL-6의 과도한 생성은 노화나 만성 스 트레스와 연관된 질환을 유발한다.

최근 IL-6 전사조절부위 (promoter)의 -174 G → C 유전자 다형성에서 IL-6 -174 C 유전자를 가지는

경우에 IL-6의 전사 능력이 현저히 낮기 때문에 동 형접합 (homozygote)인 CC군에서는 다른 유전자군 에 비하여 혈청 IL-6 농도가 낮게 나타나, IL-6 전사 조절부위의 유전자 다형성이 IL-6의 활성도에 관여 하는 것으로 알려지고 있다

. Ferrari 등은 이렇게 IL-6의 활성도가 낮은 폐경 여성에서 골 흡수율이 낮으므로, 골다공증의 위험성이 낮게 나타난다고 보고하였다

.

단일염기서열다형성 (Single nucleotide polymor- phism: SNP)은 개개인에서의 유전체 DNA 염기서 열상 단일 염기차이로 정의되고 있는데 가장 빈도 가 작은 allele의 빈도가 1%이상인 경우를 말하며 돌연변이는 그 빈도가 1%이하인 경우를 말한다.

SNP는 1000개의 염기 당 1개 정도로 인간 유전체 에 존재한다고 추측되고 있으며 이러한 SNP는 po- pulation genetics, 신약 개발, 법의학, 암 등 각종 유 전질환의 진단 및 치료관리에 사용될 수 있다. 즉 개개인에 따라 이러한 SNP의 차이와 환경적 요소 에 의하여 질환의 발생, 치료에 대한 반응도 등에 있어서 차이가 나타날 수 있다. 특히 유전자의 발현 조절 부위에 위치하는 SNP는 질병에 대한 민감성 에 영향을 줄 수 있으므로 SNP와 질병의 상관관계 가 밝혀지면 질병에 대한 민감성을 예측하고 그 질 병에 대한 환경과 유전의 역할을 이해하는 데 도움 을 주게 될 뿐만 아니라 질병의 예측, 예후 및 치료, 예방에까지 이용될 수 있다.

현재까지 IL-6의 전사조절부위의 SNP는 -634,

-597, -572, -174 부위가 알려져 있다. 한국 폐경 여

성의 IL-6의 전사조절부위 중 -572의 CC 유전자 형

에서 대퇴골 골밀도가 유의하게 낮은 것으로 보고

되었으나

, 요골과 종골의 골밀도에는 영향을 미치

지 않는 것으로 보고된바 있다

. 그러나 대사나 영

향인자가 폐경 후 여성과는 다른 폐경 전 여성의

골밀도와 IL-6 유전자 다형성의 연관성에 관한 보

고는 아직 없어 본 연구에서는 폐경 전 한국 여성

의 IL-6의 전사조절부위 중 -572의 SNP와 요골과

종골의 골밀도를 조사하여 IL-6 유전자 다형성이

폐경 전 여성의 골밀도에 미치는 영향을 규명하고

자 하였다.

대상 및 방법 1. 연구 대상

2000년 3월 1일부터 2001년 2월 28일까지 이화여 자대학병원 종합검진 및 일반검진을 받은 환자 중 에서 50세 미만의 여성 중 폐경이 되지 않은 172명 의 여성을 대상으로 하였다. 연구 대상자중 최근 6 개월 간 호르몬제제를 비롯한 골 생성과 골 흡수에 영향을 미친다고 생각되는 약제를 복용한 여성은 제외하였다.

2. 연구 방법

1) 방사선검사 (골밀도 측정)

DXA (Dual energy X-ray absorptiometry, Lunar Pixi)를 이용하여 전완 및 족부의 골밀도를 측정하 였으며 반복 측정시 오차는 (coefficient of variation of repeated measurement on individual) 1.2%였다.

2) 말초혈액으로부터의 DNA 추출

항응고제로 EDTA 용액을 사용하여 피검자로부 터 채혈한 혈액을 -20

C 냉동고에 보관하였다가 DNA를 추출했다. genomic DNA는 QIA amp Blood kit (QUIAGEN Inc., USA)을 사용하여 추출하였으 며, 이 DNA는 260 nm와 280 nm에서 흡광도비율은 1.7～1.9로 순수하였다.

3) IL-6 Genotyping

중합효소연쇄반응의 시발체 (primer)의 염기서열 은 다음과 같았다.

(F) 5’-GCAAAGTCCTCACTGGGAGGA (R) 5’-GGGCTGCGATGGAGTCAGA (EXT) 5’-ATCAATGATGATCCAGGCAGT- CTACAACAGCC

중합효소연쇄반응은 각 시발체 1.25 pmol, 50 ng 의 genomic DNA, 250μM의 dNTPs 0.15 U의 Taq DNA 중합효소 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 섞은 후, touchdown condition하에서 Gene- Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster

City, CA)을 이용하였다. 중합효소 연쇄반응의 정화 에는 SAP (Amersham Life Sciences, Cleveland, OH) 와 ExoI (Amersham Life Sciences, Cleveland, OH)을 첨가하며 37

C에서 1시간 처리 후, 72

C에서 15분 간 처리하여 효소를 비활성화시켰다.

시발체를 extension 시키기 위해 SnaPshot ddNTP Primer Extension Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여, SAP를 첨가 한 후 37

C에서 1시간 처리 후, 반응시키고, 72

C에서 15분간 반응 시켜, 효소의 활성을 억제하였다.

중합효소 연쇄반응의 산물은 Genescan 120 Liz size standard solution을 Hi-Di formamide (Applied Biosystems, Foster City, CA)에 첨가하였다. 95

C에 서 5분 처리 후, 5

C에서 5분 냉각시킨 후 ABI Prism 3700 DNA Analyzer로 전기영동하였다. 전기 영동 결과는 ABI Prism GeneScan과 Genotyper (App- lied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 분석되었 다.

3. 통계분석

연구결과의 통계학적 분석은 ANOVA와 student t test를 SPSS version 10.0을 이용하였고, P＜0.05인 경우 통계학적 유의성이 있다고 하였다.

결 과

1. 각 유전자형에 따른 임상적 특징

연구대상은 477명으로 평균 나이는 37.89±6.84 세, 평균 신장은 158.70±4.81 cm, 평균 체중은 56.94±7.3 4 kg이었으며 IL-6 -572의 SNP type에 따 른 차이는 없었다 (Table 1).

2. IL-6 유전자형의 분포

IL-6 -572 G→C SNP는 GG genotype이 263명

(55.1%), GC genotype이 186명 (40.1%), CC geno-

type이 28명 (5.9%)으로 나타났다 (Table 2).

Table 1. Distribution of genotypes and allele frequency of IL-6 -572 polymorphism in Korean premenopausal women

Genotype Allele

GG GC CC G C

Number (%)

263 (55.1%)

186 (40.0%)

28 (5.9%)

712 (76.9%)

214 (23.1%)

Table 2. Chracteristics of Korean premenopausal women with GG, GC and CC genotype of IL-6 -572

P value

GG GC CC

Age (years) 37.63±6.85 37.97±6.93 38.04±6.41 NS

Height (cm) 159.09±5.04 158.83±4.09 158.23±4.04 NS

Weight (kg) 57.02±7.05 56.52±6.84 57.00±7.60 NS

Fig. 1. The Forearm bone mineral density of the IL-6

No significant differences among the groups were found by the ANOVA and t test.

Fig. 2. The Calcaneus bone mineral density of the IL-6

No significant differences among the groups were found by the ANOVA and t test.

3. IL-6 genotype에 따른 골밀도

IL-6 genotype에 따른 요골 말단부위의 골밀도는 GG군; 0.56±0.17, GC군; 0.59±0.19, CC군; 0.58±

0.19 g/cm

(Fig. 1), 종골의 골밀도는 GG군; 0.47±

0.09, GC군; 0.47±0.10, CC군; 0.46±0.11으로 geno- type간의 골밀도의 차이는 없었다 (Fig. 2).

고 찰

골다공증은 유전적 소인, 환경적 요인, 내분비적 요인 및 생활 습관 등이 복합적으로 작용하여 발생 하는 질환으로 그 중에서도 유전적 소인이 약 60～

80%에 이르는 것으로 알려진 질환이다. 골다공증

으로 인한 골절은 성장기에 이루게 되는 최대 골량

과 노화에 따른 골량의 감소에 의해 이환되는 정도

가 달라지게 된다. 최대 골량은 골다공증의 유의한

예측인자 중의 하나이며, 이 또한 개개인의 유전적 소인에 의하여 영향을 받으며, 이외에, 식이, 운동, 호르몬 등에 의해 결정되어 진다. 최대 골밀도 (peak bone density)는 나이가 적을수록, 체중이 많이 나갈수록, 신장이 클수록, 운동량이 많을수록 높다.

또한 vitamin D 수용체의 유전형, 골다공증의 가족 력 등이 예측인자가 될 수 있으며, 이들 모두 독립 적인 예측인자이다

.

골다공증의 발생에 유전적인 요인의 작용이 중요 한 질환이란 것이 밝혀지면서 골대사에 관련된 유 전자를 찾으려는 연구가 전 세계적으로 진행되고 있다. Morrison 등이 vitamin D의 수용체 (VDR) 유전 자내 BsmI 제한효소에 의하여 인식되는 유전자 다 형성, 생화학적 지침자인 osteocalcin과 골밀도가 연 관성이 있다고 보고한 이후로 vitamin D 수용체의 유전자 다형성에 대한 연구가 외국의 여러 집단에 서 진행되었으나 그 결과는 연구자에 따라 차이가 있었다

. 그 외에도 골대사에 관여한다고 알려진 각종 인자 예를 들면 에스트로겐 수용체와 골기질 단백인 type I collagen의 유전자 (COLIA1)내 다형성 과 골밀도와의 연관성에 대한 수많은 연구가

여러 인종을 대상으로 진행되고 있으나 연구자마다 그 결과에 차이가 있다.

IL-6는 20.3kDa의 184 아미노산 단백질로 숙주의 면역반응에 중심적인 역할을 하는 다기능 사이토카 인이다. IL-6은 혈장 내에서 제거되는 속도가 빠르 기 때문에 그 농도는 IL-6 발현 단계에 의해 조절되 는 것으로 보고되었다. IL-6 발현은 전사조절부위 내의 여러 부분에 전사인자들이 결합함으로써 조절 된다

. 최근 전사조절부위의 여러 부분에 붙는 전 사요소의 상호 작용 외에도 IL-6 유전자의 전사조 절부위의 다형성에 의하여 전사와 발현정도가 개인 간에 서로 다양하게 나타난다고 보고되었다

. IL-6 전사조절부위의 SNP는 현재 4가지 정도가 알려져 있는데 그 중 -174의 G가 C로 바뀐 것이 IL-6 전사 에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있으며 이 부위 의 SNP가 류머티스 관절염, 인슐린저항성, 알츠하 이머 질병, 골다공증, 다발성 골수종 (multiple mye- loma) 등의 질환과 상관관계가 있다고 보고되고 있 다

.

골격 재형성을 조절하는 인자로서 최근 사이토카 인의 역할이 중요시되고 있으며, IL-1, IL-6의 관여에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. IL-6는 뼈의 항상 성 유지에 중요하며 파골세포의 발달도 자극하고 증 진시키는 역할을 가지고 있다. 더욱이 bone-active systemic hormone이라고 알려진 성호르몬, 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬 관련 펩타이드, 1,25- dihy- droxyvitamin D3, thyroxine 등도 IL-6와 IL-11의 생산 과 활동을 조절함으로써, 골의 재형성과 항상성을 조절한다고 알려져 있다. Poli 등은 IL-6 knockout mice에서는 성호르몬이 손실되면 야생형에서 볼 수 있는 골수의 변화나 골소주 (trabeculae of bone)의 감 소 등이 일어나지 않는다

.

IL-6는 골 흡수와 관련이 있으며 IL-6의 dysre- gulation이 골다공증을 유발한다는 것은 여러 연구 에서 보고되어 있으며, IL-6의 genotype과 폐경 후 에 골질량이나 골소실과의 연관성에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. Ferrari 등은 골밀도와 IL-6 의 유전자 다형성에 관한 보고에서 IL-6 전사조절 부위인 -174 G→C genotype 중 C allele의 동형접합 인 경우 다른 유전인자를 가진 경우보다 폐경 후 골 흡수율이 낮았고 골량의 감소가 적었다고 보고하여 IL-6 전사조절부위 유전자 다형성이 폐경 후 여성의 골밀도와 유의한 관계가 있음을 보고하였다

. Murray 등은 폐경여성에서 3’ franking 부위의 AT rich minisatellite와 골밀도를 비교하여 IL-6 유전자 의 다형성이 골량의 유전적 조절에 관여한다고 보 고하였으나

Takacs 등은 폐경 전 여성들을 자매모 델로 하여, 골밀도와 IL-6 유전자와의 연관성을 연 구하여 유의한 연관성이 있다는 연구결과를 얻지는 못하였다

.

최근 IL-6 전사조절부위의 새로운 SNP를 발굴하

려는 연구가 많아 -174 외에도 -572, -597 부위에

새로운 SNP가 보고 된 바 있다

. 이렇게 새로 발굴

되는 SNP와 여러 질병과의 연관성에 관한 연구가

진행되고 있다. 국내에서는 IL-6 전사조절부위 다형

성 중 -572가 폐경 후 골다공증 및 골밀도와 연관성

이 있어 IL-6의 전사조절부위 중 -572의 CC 유전자

형에서 대퇴골 골밀도가 유의하게 낮은 것으로 보

고되었으나

, 요골과 종골의 골밀도에는 영향을 미

치지 않는 것으로 보고된바 있다

. 본 연구에서는 폐경 전 여성의 요골과 종골의 골밀도에 IL-6 유전 자 다형성이 관련성이 없는 것으로 나타나 폐경 후 여성의 요골과 종골의 골밀도에 IL-6 유전자 다형 성이 관련성이 없는 것과 같은 결과가 나와 IL-6의 골대사에 관련된 기능은 연령이나 호르몬 상태보다 골부위에 따라 다르게 나타나는 것으로 나타나 이 에 대한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

IL-6의 골에 대한 작용이 파골세포의 분화와 기 능에 중요하기 때문에 IL-6의 전사와 발현에 있어 서의 유전자적 조절이 골대사 및 골밀도와 연관이 있을 것이라는 가정 하에 본 연구를 하였다. 한국인 폐경 전 여성의 요골과 종골의 골밀도는 genotype 간에 유의한 차이가 없었다. 앞으로 다른 SNP와 골 밀도, IL-6와의 연관성에 대해서, 그리고 다른 인종 과의 차이, 환경적인 역할 등이 연구되어야 할 것이 다.

요 약

목적: 폐경전 한국여성에서 IL-6의 전사조절부위 중 -572의 단일염기서열다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP)과 골밀도를 조사하여 그 상관 관계를 규명하고자 하였다.

방법: 폐경전 한국여성 477명을 대상으로 하여 골밀도를 DXA로 측정하였으며 말초혈액으로부터 DNA를 추출하여 IL-6 유전자 다형성 양상을 중합 효소반응을 이용하여 분석하였다.

결과: 연구대상의 평균 나이는 37.89±6.84세, 평 균 신장은 158.70±4.81 cm, 평균 체중은 56.94±7.34 kg이었으며 IL-6 -572의 SNP type에 따른 차이는 없 었다 (P＞0.05). IL-6의 전사조절부위의 -572의 SNP 는 GG genotype이 263명 (55.1%), GC genotype이 186명 (40.0%), CC genotype이 28명 (5.9%)으로 나타 났다.

IL-6 genotype에 따른 요골 말단의 골밀도는 GG 군; 0.56±0.17, GC군; 0.59±0.19 CC군; 0.58±0.19 g/cm

으로 genotype간의 골밀도의 차이는 없었다 (P＞0.05). 종골 말단의 골밀도는 GG군; 0.47±0.09, GC군; 0.47±0.10, CC군; 0.47±0.11 g/cm

으로 geno-

type간의 골밀도의 차이는 없었다 (P＞0.05).

결론: 폐경전 한국여성의 IL-6의 전사조절부위의 -572의 genotype이 폐경 여성의 요골 말단과 종골 말단에서 골밀도와 genotype 간에 유의한 차이를 보 이지 않아 IL-6 유전자내 -572G→C 다형성은 단독 으로 골밀도에 영향을 미치지 않는다고 사료된다.

중심단어: 인터루킨-6, 골밀도, SNP, 폐경

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