2004; 9(4): 280-286
Preventive Effects of Isoflavones on Colon Carcinogenesis in Azoxymethane Treated F344 Rats
Jung-Eun Shin
1, Jae-Young Shim
1, In-Hye Kim
1, Young-Mi Cho
1, Ji-Hea Moon
1, Hyeun-Ok Lee
1, Jae-Hyoun Kim
2, Hyang-Sook Chun
3and Ae-Son Om
11
Department of Food & Nutrition, School of Human Ecology, Hanyang University, Seoul 133-791,
2Department of Health Science, School of National Science,
Dongduk Women's University, Seoul 136-714,
3Korean Food Research Institute, Seongnam 463-746, Korea
This study was designed with sixty 21-day old male Fisher 344 rats to investigate the preventive effect of the isoflavones on colon cancer. The colon cancer was induced by injections with colon carcinogen azoxymethane (15 mg AOM/kg body weight/time) at 4 and 5 weeks of age. All the rats were divided into control and experimental groups (n=15/group, isoflavones 30 ppm and 300 ppm). The rats were freely fed normal diets and isoflavones by oral feeding for 5 weeks. On 5 weeks later all the rats were sacrificed.
Body weight, food consumption weight, cecum pH, aberrant crypt (AC), aberrant crypt foci (ACF) were detected. Inducible nitric oxide synthase (iNOS), matrix metallopro- teinase (MMP)-2/9, nitric oxide (NO) were analyzed. Body weight, food consumption did not differ among control and experimental groups. The cecum pH and number of AC/ACF in experimental groups was significantly lower than that of in control group (p＜0.05). The expression of iNOS and MMP-2/9 in experimental groups was markedly lower than that of in control group. The concentration of NO in experimental groups was lower than that in control group. These results show that isoflavones may inhibit colon carcinogenesis through diverse mechanism. Therefore, further study should be needed to identify the mechanisms by which isoflavones may inhibit colon cancer.
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Isoflavones이 Azoxymethane을 투여한 F344 Rats의 대장 암화과정에 미치는 영향
1한양대학교 생활과학대학 식품영양학과, 2동덕여자대학교 자연과학대학 보건관리학과, 3한국식품개발연구원
신정은
1․심재영
1․김인혜
1․조영미
1․문지혜
1․이헌옥
1․김재현
2․전향숙
3․엄애선
1책임저자：엄애선, ꂕ 133-791, 서울시 성동구 행당동 산21, 한양대학교 생활과학대학 식품영양학과 Tel: 02-2290-1203, Fax: 02-2281-8285, E-mail: [email protected]
접수일：2004년 10월 28일, 게재승인일：2004년 11월 19일
서 론
American Cancer Society (2000년)에서 발표한 바에 따르면 대장암으로 인한 연간 연령 보정 사 망률은 1983년도 인구 100,000명당 2.0명에서 1999 년도에는 7.0명으로 3.5배인 3,714명(전체 암의 6.8%)으로 급격하게 증가하고 있는 추세이다.1) 대 장암의 경우 발암에 영향을 미치는 환경요인 중 에서 식이가 가장 중요한 요인으로 알려져 있다.2) 국내 대장암 발생의 증가는 경제발전에 따른 생 활수준의 향상과 그에 따른 식생활 형태의 변화 로 열량의 섭취와 동물성 식품의 소비가 늘어났 으며 곡류와 채소 등의 섭취가 감소하였기 때문 으로 알려져 있다.3)
대두에 존재하는 이소플라본은 식물계에 널리 존재하는 천연 화합물로 genistein, daidzein과 glycitein 등이 주를 이룬다.4) 식품 내에서 대부분 의 이소플라본은 glycoside와 결합한 배당체(gly- cone) 형태인 genistin과 daidzin 등으로 존재하며 생리적 활성은 없으나 사람이나 동물의 장에서 미생물에 의해 활성형태의 비배당체(aglycone)인 genistein과 daidzein등으로 전환되어 이용된다.5) 이소플라본의 구조는 여성 호르몬인 estrogen과 유 사하여 phytoestrogen이라고도 하며 estrogen 활성 을 나타낸다.6) In vivo 및 in vitro 연구에 의하면 이소플라본은 항암성,7) 항산화 작용,6) 항염증성,8) 동맥경화 예방,9) 심장병 예방,10) 골다공증 예방11) 등의 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
발암기전(carcinogenesis)은 ‘multi-step’과정으로 서 여러 가지 종양 유전자(oncogene)의 돌연변이 와 종양억제 유전자(tumor suppressor gene)의 소실 (allelic loss)이나 돌연변이(mutation)의 결과로 일 어나며 대장암도 그 예외는 아니다.12) 대장암의 진행을 나타내는 지표로는 대장암 초기 진행시 aberrant crypt foci (ACF)가 있는데 ACF는 선종 (adenoma)와 선암종(adenocarcinoma)로 발달하는 잠재적인 부위로서이들은 정상세포보다 두꺼우므 로 aberrant crypt (AC)와 함께 0.25% methylene blue의 염색으로 현미경에서 구별 가능하다.13) NO 는 생체 내에서 nitric oxide synthase (NOS)의 효소 계에 의해 생성되며, Ca++비의존성 NOS (induci-
ble NOS)는 활성 유도에 의해 발현되어 NO의 생 성을 촉진한다.14) Ambs 등15)은 암화 과정의 진행 에 있어서 NO와 iNOS의 기전이 명확히 밝혀지지 않았으나 NO가 신생혈관형성과 종양의 혈류 증 가를 유도한다고 보고하였다. Matrix metalloprotei- nase (MMP)는 extracellular membrane (ECM)의 분 해요소로 zinc-dependant form으로 현재 17종류가 알려져 있으며 collagenases type, stromelysins type, gelainases type, membrane type의 MMPs와 기타 MMPs의 subgroup으로 나누어진다.16) Mc Donnell 등17)은 전이가 일어난 대장세포와 정상대장세포 에서 MMP-2/9의 활성을 측정한 결과 전이가 있 는 대장세포에서 활성이 나타나는 것을 확인한 바 있다.
따라서 대장암의 치료와 예방을 위하여 대장암 암화과정의 생리적, 생화학적 변화를 이해함으로 써 대장암을 유발시키는 위험인자를 줄이며, 가능 성 있는 치료방법 및 예방법을 모색하는 것이 도 움이 되리라 생각된다. 본 연구는 AOM를 처리한 흰쥐에게 isoflavones을 공급한 후 암화과정의 생 체지표를 측정함으로써 isoflvones에 의한 암의 억 제 기전을 규명하고자 하였다.
재료 및 방법
1) 실험 설계 및 재료
3주령된 Fisher344 (Charl's Rivers 사) 계열의 웅 성 흰쥐에 화학적 발암원인 azoxymethane (Sigma Chemical Co. St Louis, USA, AOM)을 15 mg/body weight kg씩 일주일에 1회씩 2주간 간격으로 피하 주사하여 총 투여량이 30 mg/body weight kg되도 록 하여 대장암을 유발하였다. AOM 주사 후 모 든 동물들은 대조군과 isoflavone (Shindongbang, Ansan, Korea) 투여군으로 나눈 후 각 군에 해당 하는 시료를 intragastric syringe로 투여하였다. 시 험 시료를 5주간 경구투여 후 12시간 절식시킨 후 해부하여 각 군별로 혈액과 대장 효소의 활성 도를 비교 분석하였다. 실험동물은 바이오제노믹 스사에서 생후 3주된 Fisher344 (Charl's Rivers 사) 계열의 웅성 흰쥐를 사용하였다. 실험에 사용하기 전까지 명암주기는 12시간 주기로, 온도는 25oC로 유지된 동물실에서 1주일간 적응시켰다. 사료 배
합시 사용한 모든 원료는 Sigma 제품을 이용하였 으며, modified AIN-93G diet (Table 1)를 매일 1∼
2 kg씩 혼합하여 매일 같은 시간에 제공하였으며 사육기간 동안 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 난괴법(randomized complete block design) 으로 모든 군을 분류하였으며 isoflavone 투여군은 30 ppm 투여군과 300 ppm 투여군으로 나누었으 며, 모든 각 군의 개체는 30마리였다. 시료는 물 에 녹여 1일 1회 5주간 매일 오전 8:00에서 10:00 시 사이에 경구투여하였다.
2) 체중 및 식이량 측정
전 실험기간 중 매일 09:00∼10:00시경에 임상 증상과 빈사 및 폐사동물의 유무를 관찰하였으며 체중은 모든 실험동물에 대하여 일주일에 3회, 2 일 간격으로 측정하였고, 음수 및 사료 섭취량은
체중측정과 동일한 시간에 측정하여 군별 평균치 를 산출하여 식이섭취량을 구하였다.
3) 시료 수집
(1) 대장: 대장 조직은 개복 후 즉시 적출하여 생리식염수로 내외부를 잘 세척하였다. 대장은 3 등분하여 proximal 부위는 즉시 액화질소에 냉각 시켜 실험전까지 -70oC에 보관하였고 나머지 부 위는 세로 방향으로 잘라 여과지에 붙여 10%
neutral phosphate-buffered formalin (PBS)에 보관하 였다.
(2) 혈액: 실험 동물을 실험 전 12시간 동안 절 식시켰고 드라이아이스로 마취 후 개복하지 않은 채 심장에서 전혈을 채취하였다. 여기에 1 unit/ml blood 농도의 heparin을 첨가하여 분석 시까지 혈 액의 응고를 방지하였다. 혈액의 분석은 채혈 후 24시간 내에 실시하였다. 전혈은 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 적혈구를 분리한 뒤, 상층액 을 분리하여 혈장 시료로 사용하였다.
(3) Cecum pH 측정: Cecum 조직은 cecum의 바 로 위아래를 잘라 내용물을 꺼내고 증류수로 5배 희석하였다. 증류수로 5배 희석시킨 cecum을 잘 흔들어 섞이게 한 후 3,000 rpm에서 20분간 원심 분리하고 그 상층액을 채취하여 pH meter기(NOVA- 100s, pH meter)로 pH를 측정하였다.
(4) Aberrant Crypt Foci (ACF)의 측정: 고정된 대장을 3등분하여 5분간 수세한 후 0.25% methy- lene blue에 5∼10초간 염색하고 다시 5분간 수세 한 다음 광학현미경에서 관찰하여 Aberrant crypt foci (ACF)의 수를 세었다. ACF 숫자는 실험에 익 숙한 실험자 2인이 확인한 결과를 사용하였다.
4) Inducible nitric oxide synthase (iNOS)의 발현 측정
적당량의 lysis buffer [320 mm sucrose, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, pH 7.2 1 mM DTT, luepep- tin (5 mg/ml) 100 ul, soybean trypsin inhibitor (5 mg/ml) 100 ul, aprotinin (5 mg/ml) 20 ul, 1 mM PMSF, 총 50 ml]에 조직을 넣고 균질화 한 후 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 그 상층액 을 시료로 사용하였다.50,51) 모든 과정은 sample의 보호를 위하여 4oC에서 행해졌다. Protein이 sam- Table 1. Composition of diet
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Ingredient g
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Casein 160
Cornstarch 490
Sucrose 200
Cellulose 50
Corn oil 48.4
Cysteine 1.5
Methionine 3
Cholin bitartrate 2
BHT1) 0.015
Mineral mixture2) 35
Vitamin mixture3) 10
Total (g) 1,000
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1)BHT: butylated hydroxytoluene
2)Mineral mixture (g/100 g): CaHPO4․2H2O, 0.43:
KH2PO4, 34.31: NaCl, 25.06; Fe(C6H5O7)․6H2O, 0.623; MgSO4 7H2O, 9.98; ZnCl2, 0.02; MnSO4․
4-5H2O, 0.121; CuSO4․5H2O, 0.156; KI,0.0005;
CaCO3, 29.29; (NH4) 6Mo7O2․4H2O, 0.0025.
3)Vitamin mixture (mg/100 g): Vitamin A acetate, 93.2:
Vitamin D3, 0.5825: α-tocopherol-acetate, 1200: Vita- min K3, 6.0: Vitamin B1 Hydrochloride, 59.0: Vitamin B2 59.0: Vitamin B6 hydrochloride, 29.0: Vitamin B12, 0.2: Vitamin C, 588; D-Biotin, 1.0: Folic acid, 2:
Pantothenic acid, 235: Nicotinic acid, 294; Inositol, 1176: Lactose, 96257
ple 당 총 50 ug가 되도록 lysis buffer에 희석하여 부피가 15 ul가 되도록 하였다. Protein loading buffer를 15 ul 넣고 100oC에서 10분간 반응시킨 후, 전기영동 kit에 running buffer를 넣고 8∼16%
Tris-Glycine gel 10 well에 각각의 sample을 심고 125 V에서 전기영동하였다. Membrane에 25 V 3 시간 동안 transfer하고 blocking buffer (5% non-fat milk in washing buffer)에 상온에서 2시간 방치하 거나 4oC에서 overnight 하였다. 4oC에 저장된 membrane은 상온에 30분간 두었다가 사용하였다.
Primary Mono antibody iNOS (Transduction Co.)는 blocking buffer에 1：2000 희석하여 2시간 동안 상온에서 반응하여 washing buffer로 30분 동안 3 번씩 처리하고 2nd poly antibody IgG (Transduc- tion Co., USA)는 blocking buffer에 1：10000희석 하여 1시간 반응하여 washing buffer로 30분 동안 3번씩 처리하여50) ECL kit (Zymed Co., USA)로 현 상하였다.
5) Matrix Metalloproteinase-2/9 활성도 측정 Lysis Buffer에서 균질화한 대장을 14,000 rpm에 서 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다.
Sample Protein이 총 25 ug이 되도록 lysis buffer 에 희석하여 부피가 15 ul가 되게 하였다. Sample buffer 15 ul를 넣어 30 ul가 되도록 하여 37oC에서 1시간 incubation 하고 Zymogram PAGE mini gel 10 well에 심는다. Running buffer를 넣고 125 V에 서 전기영동하고 gel을 잘 떼어 내어 Renaturing buffer에 상온에서 30분간 3회 shake하였다. Develop- ing buffer에서 상온에서 30분 shake한 후 37oC에 서 72시간 shake하였다. 0.5% comassie blue에 30 분 동안 염색하고 destaining buffer에 overnight한 후 사진을 찍고 gel을 건조시켜 영구보관할 수 있 도록 하였다.
6) 단백질 정량
본 실험의 단백질 정량은 Bradford법에 따라 측 정하였고 bovine serum albumin을 표준물질로 사 용하여 비교 정량하였다.
7) 혈장에서 Nitric Oxide (NO)의 측정 분리된 혈장에서 Nitric Oxide (NO)의 측정은 수
정된 Griess reaction으로 NOx (nitrate, nitrite)를 측 정하였다. 96 well에 sample 10 ul와 함께 10 mM Tris Buffer, 1mM FAD, 10 mM NADPH, nitrate reductase 10 unit/ml in Tris buffer를 총 100ul가 되 도록 처리하여 37oC에서 1시간 동안 incubation 하 였다. 200 mM sodium pyruvate:lactate dehydroge- nase (500：30)의 비율로 10 ul씩 첨가하여 37oC에 서 30분 동안 incubation 한 후 5% O-phosphric acid, 1% sulfonic acid, 0.1% N-naphtylene-diamine- H-choride를 첨가하여 이들을 10분 동안 상온에서 방치시키고 546 nm에서 흡광도를 측정하였다.
8) 통계처리
실험에서 나타난 결과에 대해서는 SPSS를 이용 하여 각 실험군마다 평균과 표준편차를 계산하고, 군간의 차이를 p＜0.05 수준에서 ANOVA test를 실시한 후 Duncan's multiple range test에 의하여 검증하였다.
결과 및 고찰
1) 체중 및 식이섭취량의 변화
실험 기간 8주 동안의 체중 변화를 측정한 결 과는 Fig. 1에 제시하였다.
실험을 마친 후 실험동물의 체중은 대조군군에
Fig. 1. Change of body weight in isoflavones treated groups during experimental weeks. Each values is the mean (n=30). Statistical significance was calculated by one-way ANOVA. Significant difference was not ob- served between control and treatment groups.
서는 250.2 g, isoflavone 30 ppm 투여군 258.0 g, isoflavone 30 ppm투여군 255.6 g으로 나타났다.
대조군에 비해 투여군의 체중 변화는 유의적인 차이는 없었으나 대조군에 비해 모두 증가하였다.
2) Cecum의 pH의 측정
Cecum의 평균 pH를 측정한 결과는 Fig. 2와 같 다. 대조군의 cecum pH는 7.42±0.21을 보여 가장 높았으며 isoflavones 30ppn 투여군은 7.11±0.25, isoflavones 300 ppm 투여군은 7.10±0.13이었다.
투여군은 대조군에 비해 유의적으로 낮았다(p＜
0.05). Reza 등13)의 실험에서는 대장암을 유발시킨 쥐에게 콩 단백질을 투여하였을 경우 cecum pH와 aberrant crypt foci수가 유의적으로 감소하여 대장 암이 억제되는 것을 증명하였는데, 본 연구결과와 일치하는 것으로 나타났다.
4) Aberrant Crypt Foci (ACF)의 측정 Fig. 3은 ACF의 평균 개수를 나타낸 결과이다.
ACF의 개수는 isoflvones 30 ppm 투여군은 46±
16.97, isoflvones 300 ppm 투여군은 39.00±20.89 으로 대조군인 102.66±23.11에 비해 유의적(p＜
0.05)으로 낮았다. ACF는 대장조직의 상피세포에 서 대장암 진행 시 전암 병변(preneoplastic lesion) 의 초기 단계에서 발생하는 것으로 대장암의 발
현을 상징하는 지표로,18) Hakkak 등19)의 연구에서 는 azoxymethane으로 대장암을 유발시킨 흰쥐에 콩 단백질을 급여하였을 때 ACF의 형성이 억제 되는 결과를 발표하였는데 이는 본 연구 결과와 일치하였다.
5) Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS)의 발현 비교
본 실험에서 iNOS의 발현을 Fig. 4에 나타내었 다. iNOS protein 발현은 대조군에서 강하게 발현 되었으며 isoflavone 30 ppm, 300 ppm 투여군은 대 조군에 비해 발현이 감소하였다. Chazotte-Aubert 등20)에 의하면 iNOS 발현 증가는 NO의 과도한 생성을 유도하여 직접 세포독성을 유발하고 p53 과 같은 종양억제유전자의 변이를 유발하며, 종양 의 신생혈관 형성을 촉진시키는 역할을 함으로서 종양의 발생과 진행에 관여하는 것으로 보고하였 으며, Duenas-Gonzales 등21)은 iNOS의 발현과 림 프절 전이와는 비례의 상관관계가 있고 항전이
Fig. 2. Effects of isoflavones on pH of cecum contents of rats. Each values is the mean±S.D. (n=30). Statisti- cal significance was calculated by one-way ANOVA.
Significant difference was not observed between control
and treatment groups. *p＜0.05 vs control. Fig. 4. Expression of inducible nitric oxide synthase on colon tissue of rats.
Control iso 30 ppm iso 300 ppm Fig. 3. Effects of isoflavones on aberrant crypt foci in AOM-induced colon cancer rats. Each values is the mean±S.D. (n=30). Statistical significance was calcul- ated by one-way ANOVA. *p＜0.05 vs control.
유전자(antimetastatic gene)의 하나인 nm23의 양성 도와 iNOS의 발현에는 반비례 관계가 있으므로 iNOS는 종양의 전이를 증진시키는 역할이 있다고 하였다. 본 실험에서는 isoflavones 투여군에서 iNOS 의 발현이 감소되어 isoflavones에 의해 종양의 진 행이 억제되는 것으로 생각된다.
6) Matrix Metalloproteinase (MMP)-2/9의 활 성도 비교
MMP-2/9의 활성을 각각 68,86 kd에서 확인하였 으며, 그 결과는 Fig. 5과 같다. 대조군에서 MMP- 2/9은 활성이 높았으나 isoflvaones 투여군에서는 농도가 높아질수록 활성이 감소하였다. MMP-2/9 은 type IV collagen으로 이들의 발현은 tumor의 증가와 비례하는데 prostate tumor의 경우 초기 단 계보다는 전이단계에서 증가한다고 보고되어 있 다.22) MMP-2는 metastasis에 관여하여 조직의 성 장과 세포 분화가 일어날 때 활성이 증가되는 것 으로 알려져 있으며, MMP-9은 NO에 의해서 활성 이 조절되어진다고 보고되었다.23) 본 실험에서는 isoflavones 투여군에서 MMP-2/9의 활성이 감소된 것으로 나타났다.
7) 혈장에서 Nitric Oxide (NO) 농도의 측정 혈장에서 측정한 NO의 생성량을 Fig. 6에 제시 하였다. NO의 농도는 대조군 175.25±120.25μM, isoflvones 30 ppm 투여군 57.75±18.48μM, iso- flavones 300 ppm 투여군 50.02±7.57μM이었다.
대조군과 투여군 사이 유의적인 차이는 없으나 대조군에 비해 isoflavones 투여군이 NO 형성이 낮은 농도를 나타내었다. Nitric oxide (NO)는 중 요한 생리 활성 물질로 혈관 확장, 신경 신호전 달, 면역 반응 및 철 대사 등의 여러 기본적인 생
리 현상을 매개하는 신호전달 물질이지만 과도한 NO의 생성은 암을 비롯한 여러 질환의 발병 기전 에 관여하는 것으로 알려져 있다.24) Ambs 등15)은 암화 과정의 진행에 있어서 NO의 기전이 명확히 밝혀지지 않았으나 NO가 신생혈관형성과 종양의 혈류 증가를 유도한다고 보고하였다.
이상에서 isoflavones이 여러 가지 기전을 통해 대장암 암화과정을 억제할 수 있는 것으로 보여 진다. 이는 isoflavones이 대장에서 이상세포로의 초기 전환단계인 AC 및 ACF의 형성을 억제하고, NO의 생성을 감소시키며, iNOS 및 MMP-2/9의 발현을 억제시켜 대장암의 진행을 억제하기 때문 으로 생각되나 앞으로 이들 생체지표들과의 상호 작용 및 그 기전에 대해서는 더 많이 연구되어야 할 것이다.
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Cont iso 30 iso 300
MMp-2 68 kd MMp-9 86 kd
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