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(2)

년 월 2011 2 석사학위논문

더 덕 이 유 방 암 세 포 주 에 미치는 영향 (MDA-MB-231)

조선대학교 보건대학원

대 체 의 학 과

조 삼 숙

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더 덕 이 유 방 암 세 포 주 에 미치는 영향 (MDA-MB-231)

Effects of Codonopsis lanceolata on

the Human Breast Cancer MDA-MB-231 Cell Lines

년 월 2011 2

조선대학교 보건대학원

대 체 의 학 과

조 삼 숙

(4)

더 덕 이 유 방 암 세 포 주 에 미치는 영향 (MDA-MB-231)

Effects of Codonopsis lanceolata on

the Human Breast Cancer MDA-MB-231 Cell Lines

지 도 교 수 문 경 래

이 논문을 대체의학 석사학위 신청 논문을 제출함

년 월

2010 10

조선대학교 보건대학원

대 체 의 학 과

조 삼 숙

(5)

조삼숙의 대체의학 석사학위 논문을 인준함

위원장 조선대학교 교수 서 재 홍 인 ( )

위 원 조선대학교 교수 박 상 학 인 ( )

위 원 조선대학교 교수 문 경 래 인 ( )

년 월

2011 11

조선대학교 보건대학원

(6)

목 차

서 론

재료 및 방법 실험재료

시약 세포배양

더덕이추출 방법

통계처리 실험결과

세포생존율 결과

암표적 지표 발현양 결과 고 찰

결 론 .

Ⅵ 참고문헌

(7)

· 11

……… ………

12

………

· · 13

……… ……… ………

···· 13

……… ………

(8)

Abstract

Effects of Codonopsis lanceolata Extracts on the Human Breast Cancer MDA-MB-231 Cell Lines

Cho, Sam-Sook

Advisor: Prof. Moon, Kyung-Rye, M.D., Ph.D Department of Alternative Medicine

Graduate School of Health Science Chosun University

Objective : This study is on the effects of the anti-proliferative activity of Codonopsis lanceolata extract in MDA-MB-231 human breast cancer cell lines.

Methods : MTS assay was used to detect the effects of Codonopsis lanceolata extracts on the MDA-MB-231 human breast cancer cell lines viability. And Western Blotting was used to see the effects of

Codonopsis lanceolata extracts on cyclooxygenase-2 (COX-2) and iNOS expression.

Results :

1. Methanol extracts of Codonopsis lanceolata significantly reduced cell survial rate the MDA-MB-231 human breast cancer cell lines but hot-water extracts is no effect.

2. Methanol extracts of Codonopsis lanceolata reduced the MD-AMB-231 human breast cancer cell lines depending

(9)

concentration and time. especially it reduced significantly at 900 / that 24hrs to 80% and 48 hours to 95%.

3. Methanol extracts of Codonopsis lanceolata 99% suppression of iNOS expression at 600 / concentration.

4. Hot-water extracts of Codonopsis lanceolata 70%

suppression of iNOS expression at 900 / concentration.

Conclusion : Methanol extracts of Codonopsis lanceolata has strongly implied that it's anti-proliferative effect. They demends additional research about in-vivo and human study.

Key words: Codonopsis lanceolata , human breast cancer MDA-MB-231 cell lines, MTS, COX-2, iNOS

(10)

유방암은 년 월 보건복지부의 중앙암등록 본부 발표에 의하면 년부터 우리나라 여성 암 중에 위이며 미국에서는 년 유방암 환자

명이 발병했으며 이 중 명이 사망한 것으로 보고 되었다

유방암의 원인은 고지방 고칼로리 식이섭취 낮은 출산율 짧은 모유수유기 간 에스트로젠의 노출시간 연장 환경적 스트레스 등으로 보고 되었다   유 방암 치료에 있어서 호르몬 요법이 유방암세포의 성장을 억제하며 호르몬 요 법은 체내의 에스트로젠의 생성을 감소시키는 작용을 한다

유방암에서 호르몬 수용체가 발견된 후 많은 유방암 환자가 에스트로젠 호 르몬 요법에 반응 한다고 알려졌다 에스트로젠 수용체와 프로게스테론 수용체 모두양성인 경우 까지 반응이 나타나 에스트로젠 길항제인 타목시펜이 유 방암에 탁월한 효과가 있는 것으로 연구 되었다

그러나 자궁내막증식을 유발하여 자궁내막암을 유발하는 부작용이 있어 국내외적 으로 생약에서 식물성 호르몬 개발이 더 절실하게 필요하게 되었다 유방암과 생약성분에 대한 선행연구로 인삼의 사포닌성분 중 진센노사이드의 에서 유방암 세포사를 강력하게 유도하는 연구가 보고 되었고 인삼의 사포닌 성분 중 는 강한 항증식 작용이 연구되었다

은 인간 유방암세포의 이동 침범 유착을 억제하는 효 과가 있어 유방암전이 치료에 기대되는 생약으로 보고 된 바 있으며 마

늘의 지용성 성분 이 유방암의 와

에서 암세포억제 작용이 있는 것으로 연구 되었다

(11)

더덕은 예로부터 약용으로 인삼대신 사용한다고 하여 사삼이라고 하였다

더덕은 초롱꽃과 에 속하며 학명은

이다 숲 속에서 나는 다년생 덩굴 식물 뿌리는 굵고 덩굴을 자르면 흰 유액이 나오고 잎은 가지 끝에 장의 잎이 있으며 가장자리에는 밋밋하고 표면은 녹색 뒷면은 분백색 꽃은 연한 녹색이며 안쪽은

자갈색점 원추형의 삭과 꽃받침이 남아 있다

더덕에 효능에 대한 기록은 성질이 차고 맛이 아리며 풍열을 물리치며 소종 배농하고 간과 폐를 보하며 산증과 오래된 해수를 다스린다 더덕에 관한

연구로는 더덕의 성분중 가 고온증으로 테스토스테론

의 수치가 감소된 것을 회복했다는 연구가 보고 되었다

더덕의 성분에 대한 연구는 과 성분이 연구 되었고 화학성 분에 관한 연구에서는 가용성 물질 조단백

가 유리당 조성은 였으며 유리아미

노산은 종 유리지방산의 조성은 가 검출되었고

의 함량은 검출 연구 되었다 더덕의 중성지질과 혈청지 질을 감소하는연구 면역증강 면역세포증식 생약학적 연구 사염화탄소 에 의한 간손상의 보호 생리활성등 이 보고 되었으나 항암효과에 대한 연 구는 부족하여 연구하고자 한다

대부분의 합성항암제제는 암을 치료할 때 암세포를 파괴하거나 암세포의 성장을 억제하는 기전으로 항암효과를 나타낸다 하지만 이 과정에서 정상 세 포가 손상이 되기 때문에 자연의 식물에서 추출한 약제 개발이 필요하다

(12)

재료 및 방법

실험 재료

전남 화순군일대에서 재배한 더덕을 화순읍 전남 생약농업협동 조합에서 구 입했다

시약

본 실험에 시용한 메탄올 시약은 급 시약을 사용하였다

과 등은 사 로부터 구입하였다

더불어 항생제

과 등은 사 의 시약을 구입하

여 본 실험에 사용하였다

세포배양

유방암 세포주 는

에서 구하여 본 실험에 사용하였다 유방

암 세포는 및

등을 첨가한 으로 의 상태에서 배양하였 다

더덕의 추출

(13)

열수 추출

더덕의 건조 시료 과 증류수 를 이용하여 약탕기 대웅 제

에서 시간 동안 가열하여 열수 추출을 하였다 추출이 끝나고 나면 부직포 여 과지를 이용하여 압착 여과 하였다 여과된 추출물을 튜브로 나누어 담고

에서 분간 원심 분리하여 여분의 분말찌꺼기를 침전시켰다 원심분 리 후 상층액만을 두 겹의 여과지 를 이용하여 감압 여과하였 다 감압 여과된 추출물을 회전증발농축기를 이용하여 농축한 후 동결건조기를 이용하여 동결 건조하였다 동결건조가 끝난 후 곱게 본쇄하여 실험에 사용하 도록 하였다

메탄올 추출

메탄올 에 더덕의 건조 시료 을 시간 침지시켰다 이 때 시간 단위로 교반하여 시료가 골고루 섞이도록 하면서 추출을 유도하였다 추출 후 두 겹의 여과지를 이용하여 감압 여과한 후 차적인 메탄올 추출액을 만들었다 여과된 추출액을 회전증발농축을 이용하여 감압 농축하였다 이 때 의 온도는 를 유지하여 메탄올을 제거하여 농축하도록 하였 다

추출 농액을 과 의 비율로 혼합하여 강하게 한 후

에서 분간 원심 분리하여 엽록소 및 여분의 잔여 미세 시료를 층 분리하 였으며 하층의 이 무색이 될 때까지 회 이상 반복적으로 과정을 수 행하였다 원심분리를 통하여 엽록소를 완전히 제거한 후 상층액 만을 수거하여

(14)

또한 처리를 위하여 상기 방법으로 동일하게 처리한 후 층이 무색이 되면 상층액 만을 새로운 튜브로 옮긴 후 와 의 비율로 혼합한 후 에서 분간 원심 분리하였다 상층액 만을 새로운 용기로 옮겨 담고 원심분리 후 남겨진 하층부에 다시

를 처리하여 상기 방법으로 반복하여 상충부만을 기존에 옮겨 담 은 용액이 있는 용기로 수합하였다

상기 과정을 총 회 반복하여 를 이용한 폴리페놀화합물을 완전히 얻어내도록 하였다 옮겨져서 수합된 상층부액을 회전 감압 농축기를 이용하여 감압 농축하여 를 완전히 날려버리면서 로 치환시키면 서 감압 농축하였다 용매가 완전히 제거되고 얻어진 고체 화합물의 질량을 측 정하고 를 이용하여 이 되도록 희석하여 사용하도록 하였다

추출

믹서기를 이용하여 건조 시료 을 고속으로 분쇄하였으며 상온상태에서 에 하룻밤 동안 정치해 두어 추출하였다

깔대기 에 여과지를 설치하고 현탁액을 걸렀으

며 남은 찌꺼기는 에 넣고 상온상태에서 하룻밤 동안 재추출하였다 메탄올 추출물은 회전증발농축기를 이용하여 감압 농축하였으며 남은 잔존물은 증류수로 용해하였다 조제한 추출물은 을 이용하여 플라보노이드와 엽록소를 분리하였다 남은 액상 잔존물들을 로 통과시켰다 상기 기술한 분리 과정과 더불어 시료를 증발시키고 에서 저장하였다

방 법

(15)

더덕 추출물을 이용한 측정은

로 제작사의 실험 매뉴 얼에 따라 측정하였다 유방암 세포들은 에 분주하고 더덕 추출물 의 농도별 처리 후에 시간 후에 시간 경과에 따른 세포생존율 반응을 조사하였다

을 첨가하여 로

와 에서 흡광도와 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분 율로 표시하였다 각 농도별 약재가 갖는 흡광도를 보정하기 위하여 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군와 실험군의 흡광도를 비교 보정하여 세포 생존율 을 백분율로 표시하였다

더덕 추출물은 처리한 후 유방암 세포들을 수확하고 분쇄하였다 단백질상등

액 은 으로 전기영동 한 후 으로 옮기고

로 하였으며 로 하였

(16)

각각의 실험들은 회 이상으로 반복 실험하였으며 실험결과는 평균값 표준편 차로 계산하여 측정하였다 실험결과의 통계분석은 를 이용했 으며 값이 이하인 경우에 실험결과가 통계적으로 유의한 것으로 판정하 였다

(17)

실험 결과

세포 생존율 결과

더덕을 메탄올 저분자 물질 로 추출한 후 유방암 세포주인 에 처리하여 시간 시간 후에 암세포의 생존율을 조사한 결과 농도 에서 시간 후 의 암세포생존억제 효과가 나타났다 또한 시간 후 로 암세포을 억제 시켰다 이 실험결과 시간과 농도 의존적으로 항증식효 과가 있는 것으로 조사 되었다

(18)

암표적 지표 발현양 결과

더덕의 메탄올 추출물을 의 농도별로 유방암 세포주

에 처리하였을 경우 암표적지표인 와 의 단백발현 의 결과는 경우 에서 놀랍게도 가 안보여 의 억제률을 보여 고무적인 결과를 확인할 수 있었다

더덕의 에탄올 추출물의 처리후에도 의 단백발현은 감소되지않아 더덕 의 항증식기작은 가 아니라 가 항증식기작으로 보여진다

(19)

더덕의 열수 추출물과 항암표적지표와 비교한 결과 에서 항증식 효과가 있는 것으로 조사되었지만 정제화 과정이 필요하리라고 본다

(20)

고 찰 .

합성항암제의 부작용으로 생약에서 천연항암제를 찾고자 하는 연구가 많이 진 행되고 있다 유방암의 항증식작용을 한 식물들의 성분연구에 의하면 등 에 의해 연구된 이소플라보노이드 성분이 보고 되었고 이 논문에서 가지 식물 대두 보리 클로렐라 밀크시슬 가가이모과잎 당살초 승마 시계꽃 가시오갈피 루틴을 이용해서 가지 이소플라보노이드 성분을 확

인 등 에 의해 보고된 인삼의 과

의 사포닌 성분이 보고되었다

본 연구의 소재로 항암효과에 대한 연구는 더덕의 뿌리에서 추출한 β 가 β

유전인자중 핵심적인 역할을 하는 의 의존적 세포사를 유도하는 기전 을 통하여 급성 전골수성 백혈병세포주인 에서의 세포사 효과를 밝히는 연구였으며 이 연구에서는 의존적 세포사를 유도하는데 있어 서 더덕의 특정성분을 분리하였는데 그 성분이 성분의 일종이었다

이번 실험연구에서는 더덕의 특정성분을 분리하지 않았지만 더덕의 생리활성 성분으로 밝혀진 사포닌 성분과 페놀성분에 의한 항 증식 작용과 발암억제 작 용으로 생각되어 진다 더덕과 함께 초롱꽃과에 속한 도라지에 관한 등 의 연구에서는 도라지 뿌리에서 추출한 성분을 추출하여 유방암 세 포주인 의 세포사를 유도하여 항증식 작용을 보고한 바 있다

이번 실험과 동일한 암이었지만 세포주가 다른 점과 특정성분을 추출하여 유전 인자인 와 활동에 의해 항증식 작용을 연구한 점이 상이 하다고 하겠다

(21)

더덕과 가장 유사한 잔대 추출물의 항돌연변이 및 항종양효과에 대한 연구 에 서 유방암에 대한 결과 유방암 세포인 에서 잔대의 에탄올 추출물이 전후의 암세포억제효과가 나타났다고 보고한 바 있다 세포주가 다르긴 하지만 잔대 추출물 보다 더덕의 메탄올 추출물이 더 항 증식 작용이 있는 것으로 보 여 진다

본 연구에서 더덕 추출물을 에 농도 의존적으로

첨가 하여 배양했고 대조군 비처리군 유방암세포주를 처리하지 않는군 은 배

양액을 첨가하였고 실험군은 을 첨가하여

로 흡광도와 변화를 측정하여 세포생존율을 살펴보았다 본 연구는 더덕이 메탄올추출물에서 시간과 농도 의존적으로 유방암 세포주

에서 유의적인 세포증식 억제효과를 보였고 유방 암 세포의 성장억제율의 농도가 일 때 로 높게 나타나 항 증식 효과가 높은 것으로 조사 되었다

더덕의 에탄올 추출물이 유방암 세포주에 항증식 효과가 나타나 유방암의 치 료목적으로 이용될 가치가 높은 것으로 확인되었다 그러나 더덕의 어떤 성 분이 항 증식 효과가 있는지 연구가 계속 필요하며 추출용매에 따라 활성성 분의 효과가 다르게 나타남으로 다양한 용매을 이용하여 추가적인 연구가 필요 할 것으로 사료된다

또한 이 실험은 실험임으로 추가적으로 와 실험이 지속 적으로 연구되어야 할 필요성이 제기된다

(22)

결 론 .

더덕의 열수와 메탄올 추출물이 유방암 세포주인 세포

주의 항증식작용에 미치는 연구 결과 다음과 같은 결론을 얻었다

추출 용매에 따른 유방암 세포주 세포에 대한 세포생

존율은 열수 추출물은 효과가 없었으며 메탄올 추출물이 세포생존율

억제 효과가 높았다

더덕의 메탄올 추출물의 유방암세포주에 대한 효과는 농도에서

시간 후에 효과가 시간에 세포생존율 억제 효과가 있는

것으로 조사되었다

유방암세포주의 단백질 발현에 의한 더덕의 메탄올 추출물은 항

증식 효과가 농도에서 나타났다

유방암세포주의 단백질 발현에 의한 열수 추출물의 항증식 효

과가 에서 나타났다

이상의 결과로부터 더덕의 메탄올 추출물은 유방암 세포주인

에 대한 항증식효과가 있어 유방암에 대한 화학예방 으로서의 이용될 가치가 있는 것으로 사료 된다

(23)

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저 작 물 이 용 허 락 서

본인이 저작한 학위논문에 대하여 다음과 같은 방법 및 조건하에 대학교 에 저작권을 위임할 것을 서약합니다

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소속대학의 협약기관 및 한국교육학술정보원에 논문 제공을 허락함

동의여부 동의 ˅ 조건부 동의 반대

조건부 동의 및 반대인 경우 사유 및 조건을 기재하여 주시기 바랍니다

사유 조건

저작자 성명 조 삼 숙

주소 광주광역시 남구 봉선 동 라인아파트 동 호 연락처

(29)

저자명 국문( ) 조삼숙

저자명 영문( ) Sam-sook, Cho

주민등록번호

학번 20098640

전화번호 (062)-(433)-(9440)

핸드폰 (017)-(602)-(4272)

주소

E-mail samsug2000@naver.com

주소 공개 여부

E-mail 공개 ( ) 미공개 ( ˅ )

논문명 국문( ) 더 덕 이 유 방 암 세 포 주(MDA-MB-231)에 미치는 영향 논문주제분야 총류( ), 철학( ), 종교( ), 사회과학( ), 순수과학( ),

기술과학( ),˅ 예술( ), 어학( ), 문학( ), 역사학( )

학위구분 석사 ( )˅ 박사 ( )

초록기술언어 영어 논문 쪽수 21 쪽

한글초록

더덕 추출 용매에 따른 유방암 세포주 세포에 대한 세포생존율은 열수 추출물은 효과가 없었으며 메탄올

추출물이 세포생존율 억제 효과가 높았다 더덕의 메탄올 추출물의 유방암세포주에 대한 효과는 농도에서 시간후에

효과가 시간에 세포생존율 억제 효과가 있는 것으로 조사되었다

유방암세포주의 단백질 발현에 의한 더덕의 메탄올 추출물은 항증식 효과가 농도에서 나타났다 유방암세포주의

단백질 발현에 의한 열수 추출물의 항증식 효과가 에서 나타났다

이상의 결과로부터 더덕의 메탄올 추물물은 유방암 세포주인 에 대한 항증식효과가 있어 유방암에 대한

화학예방 으로서의 이용될 가치가 있는 것으로 사료 된다

주제어 국문( ) 더덕 유방암 세포생존율,

논문명 원문( ) Effects of Codonopsis lanceolata on

the Human Breast Cancer MDA-MB-231 Cell Lines

본문기술언어 한글

초록 원문( )

참조

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