쥐 종양 모델에서 Chl ori nee6매개 광역학 치료

2008년 8월 박사학위 논문

쥐 종양 모델에서 Chl ori nee6매개 광역학 치료

조선대학교 대학원

치의공학과

김 규 식

쥐 종양 모델에서 Chl ori nee6매개 광역학 치료

Chl ori nee6-i nducedPhotodynami cTherapyi nRat TumorModel

2008년 8월 일

조선대학교 대학원

치 의 공 학 과

김 규 식

쥐 종양 모델에서 Chl ori nee6매개 광역학 치료

지도교수 윤 정 훈

이 논문을 치의학 박사학위신청 논문으로 제출함

2008년 5월 일

조선대학교 대학원

치 의 공 학 과

김 규 식

김규식의 박사학위 논문을 인준함

위원장 조선대학교 교수 이 상 호 인 위 원 조선대학교 교수 김 시 욱 인 위 원 조선대학교 교수 안 상 건 인 위 원 조선대학교 교수 윤 정 훈 인 위 원 동국대학교 교수 김 수 아 인

2008년 5월 일

조선대학교 대학원

목 목 목 차 차 차

목 차 ··· ⅰ 도목차 ··· ⅱ ABSTRACT ··· ⅲ

Ⅰ.서 론 ··· 1

Ⅱ .연 구 재 료 및 방 법 ··· 3

1.실 험 동 물 의 선 택 ··· 3

2. photodynamic therapy (PDT) Treatment··· 3

3.몸 무 게 및 종 양 부 피 측 정 ··· 3

4.연조 직 방사 선 영 상 ··· 3

5.생체발광 영상 (BioluminescentImaging) ··· 3

6.병리조직학 및 면역조직화학 검색 ··· 4

7.TUNEL분 석 ··· 4

8. 통 계분 석 ··· 4

Ⅲ .결 과 및 고 찰 ··· 5

1.광 역 학 치 료 후 종 양 의 성 장 억 제 ··· 5

2.광역 학 치료 후 생 체발 광 영 상 신호 감소 ··· 7

3.광 역 학 치 료 후 종 양 의 증 식 능 감 소 및 세 포 사 유 도 ··· 7

4.광역학 치료후 clusterin 발현 증가 및 VEGF 발현 감소 ··· 9

Ⅳ . 결 론 ··· 12

Ⅴ .참 고 문 헌 ··· 13

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도 도 도목 목 목차 차 차

Fig. 1. Body weight change following PDT ··· 5

Fig.2. Tumor volume change following PDT ··· 6

Fig.3. BioluminescentimagingfollowingPDT ··· 7

Fig.4.RepresentativesampleofPDT treatedtumor2weekslater··· 8

Fig.5.Histopathology,PCNA,andTUNEL stainingfollowingPDT ··· 9

Fig.6.Clusterin expression following PDT ···10

Fig.7.VEGF expression following PDT ··· 11

ABSTRACT

Chl ori nee6-i nducedPhotodynami cTherapyi nRat TumorModel

Kim GyuSik

Advisor:Prof.Jung-HoonYoon,DDS,PhD DepartmentofDentalEngineering,

GraduateSchoolofChosunUniversity

Photodynamic therapy (PDT) is a clinically approved and rapidly developing cancer treatmentregimen.Itis a minimally invasive procedure thatrequires the administration ofa photosensitizerfollowed by the illumination ofthe tumorwith lightofan appropriatewavelength.In thepresenceofmolecularoxygen,cytotoxic intermediaries are produced, thus damaging cellular structures containing the photosensitizer.Inthepresentstudy,theauthorexaminedtheeffectivenessofnewly develped chlorin e6-induced PDT on malignant animal tumor model of Sprague-Dawley(SD)rat.Three-week-oldmaleSD ratswereinoculateds.c.onthe right flank with our previously established k-ras-transformed RK3E cell line (RK3E-ras,RK3E-ras-Fluc,total,2.5x10⁷cells).Theexperimentswerecarriedout1 week afterinoculation oftumorcells,by which timethetumorshadreachedabout 0.7mm to1.0cm indiameter.LS-chlorine6(LS Pharm Co.,Gwangju,Korea)was administrated intravenously by the tailvein ofSD ratata dosage of10 mg/kg after inhalation anesthesia of ether. Twenty-four hours after LS-chlorin e6 administration,PDT was performed using a laser diode (Geumgwang Co.,Ltd., Daejeon,Korea)atalightdoseof100J/cm2and wavelength of664nm.Animals

were monitered daily and tumor volume was measured by caliper.  

The tumortreated with PDT using Ce6 had significantreduction in tumorsize

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examined by grosstumorvolume,softex x-ray image,molecularimaging analysis, respectively.PCNA immunostaining and TUNEL assay revealed thatthe treated tumor caused significantinhibition oftumor formation with decreased tumor cell proliferationandincreasedapoptosis.ClusterinexpressionwasincreasedinthePDT treatedtumor,whereasVEGF expression wasdecreasedin thePDT treatedtumor.

These data showed Ce6-induced PDT effectively arrested the tumor growth by inhibiting cellproliferation,angiogenesis,and inducing apoptosis.These findings provide the potentialvalue ofCe6-induced PDT as an alternative candidate for anti-tumortherapy.Furtherbiochemicaland cellularstudieswillrevealtheprecise molecularmechanism ofcelldeathinducedbyPDT.

Ⅰ.서 론

암의 주된 치료법으로서는 외과적 절제,방사선 요법,항암제 치료 등이 널리 이용되고 있다.그러나 외과적 절제는 장기의 보존이 곤란하여 수술 후의 삶의 질이 저하할 가능 성이 있다.방사선 요법이나 항암제 치료에서는 부작용에 의한 문제가 크다.최근 암 치 료에 의한 완치율이 높아짐과 함께 치료 후에도 오래 사는 것이 기대되므로 삶의 질을 중시한 치료법이 한층 더 요구되고 있다.최근 레이저와 광민감제(photosensitizer)에 의 한 광화학반응을 이용한 새로운 치료법이 주목을 받고 있고,현대의학에서 암 치료 분 야에 있어 가장 촉망받는 기술 중 하나이다^1-3).

광역학 치료법은 광민감제를 체내에 주사하고 질병 부위에 특별한 파장을 갖는 레이저 빛을 조사하여 종양을 치료하는 방법이다.광민감제가 종양조직에 선택적으로 축적된 후 레이저에 의해 활성화되면서 산소와 결합하여 화학적으로 반응성이 매우 높은 단일 항산소(¹O2：singletoxygen)를 발생시켜 종양 조직세포를 괴사시키는 원리이다¹⁾.암세 포 사멸과정은 독성의 활성산소가 암세포를 직접적으로 손상시키는 메커니즘에 기인할 수도 있고 종양 주변의 미세 혈관에 손상을 주어 암조직에 영양분이 공급되지 않도록 하여 암세포를 사멸시키는 간접적인 효과에 기인할 수도 있다고 알려져 있다^1,4,5).뿐만 아니라 산화적 스트레스(oxidativestress)에 따른 2차 반응으로 apoptosis또는 면역학 적 반응을 유도하여 암조직을 공격하도록 면역시스템을 활성화시킬 수 있다^6,7).광역학 치료의 가장 큰 장점은 질병부위에만 선택적으로 치료가 가능하여 부작용이 작고 시술 과정이 간단하여 환자의 고통을 요하지 않을 뿐 더러 입원이 필요 없어 당일 집으로 돌 아갈 수 있다.또한 여러 차례 반복시술이 가능하여 그 효과를 증대시킬 수 있으며,외 과적 수술,방사선 요법,및 화학적 요법 등의 다른 치료법과 병행이 가능하다는 장점이 있다^4-7).

1976년 Kelly 연구팀이 haematoporphyrin derivative(HPD)란 광민감제를 이용하여 사 람을 대상으로 한 첫 임상실험이 시행된 이후로 다양한 광민감제가 계속해서 개발되고 있으며 다양한 종류의 암 치료에 적용이 되고 있다⁸⁾.현재 사용되고 있는 광민감제는 1 세대인 aminolaevulinicacid(ALA),porfimersodium (PhotofrinⓇ),헤마토포르피린 유 도체(Hpd,PhotohemⓇ)등이 있으며 이들은 대부분 630nm의 파장에서 에너지 흡수가 극대화되는 특징을 가지고 있다³⁾.그러나 이들은 체내에서 약 한 달 이상 피부에 남아 햇빛에 노출될 경우 피부화상의 위험이 있으며 광독성의 깊이가 3～15mm에 불과하여 커다란 종양에서는 치료효과가 적다는 단점이 있다^4,9).반면 2세대 광민감제는 chlorin

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e6, sulphonated aluminum phtlaocyanine (PhotosenseⓇ)를 비롯해서, m-THPC (5,10,15,20-Tetra(m-hydroxyphenyl)chlorin,FoscanⓇ),bacteriochlorinA 등이 있으며 이들은 모두 최소 650nm 이상의 파장을 가진 광에너지를 흡수하는 특징이 있어,광독 성이 1세대인 PhotohemⓇ보다 거의 두 배에 달하는 것으로 알려져 있다^4,9).현재 광역 학 암치료에 사용되고 있는 대부분의 광민감제들은 생체 내로 투여되었을 때 낮은 용해 도 및 생체분자들과의 부적절한 상호작용,광민감제 간의 상호엉김(aggregation)현상으 로 암조직으로의 선택적 전달에 한계가 있고 낮은 광반응성을 보이고 있어 치료의 효과 를 높이기 위해서는 적절한 전달시스템이 요구된다.따라서 최근에는 난용성 광민감제 들의 가용화와 더불어 암조직으로의 타겟팅 성질을 보다 향상시키기 위한 많은 다양한 연구들이 진행되고 있다^,4,7,9-11).

이 연구에서는 제2세대 광민감제인 chlorine6의 광역학 치료의 효능을 관찰하기 위해 빠르게 악성종양을 유도하는 RK3E-ras세포를 이용한 쥐 악성종양 모델에서 항암효과 를 검증하고자 하였다.이를 위해 쥐 종양모델에서 통법에 따라 악성종양을 유도하고 LS-chlorine6을 투여한 후 diodelaser를 조사하여 종양의 육안 및 방사선 그리고 분자 영상 소견과 병리조직학적 소견을 관찰하여 암 치료 효능을 관찰하였다.

Ⅱ.연구재료 및 방법

111)))실실실험험험동동동물물물의의의 선선선택택택

실험동물의 악성종양을 유발하기 위해 3주된 수컷 Sprague-Dawley rats (Samtaco, Korea)을 표준 주거환경에서 사육하였다. RK3E-ras나 RK3E-ras-Fluc 세포는 trypsinization을 하여 얻은 후 원심분리하고 세포 수가 5x10⁶cells/ml이 되도록 혈청 성분 없는 DMEM 배지로 희석하였다.각각의 쥐에 400 μl의 세포 (총 5x 10⁶cells)를 22gauge주사바늘을 이용하여 오른쪽 옆구리에 주사하였다.세포주사 후 약 5일이 지 나 종양이 직경 1.0cm이하로 형성이 되면 실험에 이용하였다.

222)))IIInnnVVViiivvvoooppphhhoootttooodddyyynnnaaammmiiicccttthhheeerrraaapppyyy(((PPPDDDTTT)))TTTrrreeeaaatttmmmeeennnttt

종양이 형성된 SD rat에 LS-Chlorin e6 10mg/kg를 SD rat꼬리정맥에 생리식염수 100ul에 녹여서 정맥주사를 시행하였다.정맥주사 24시간 후에 diode laser 100J/cm² (Laser직경 2cm,4분 42초)를 조사하였다.대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 쥐와 LS-Chlorine6또는 laser만 조사한 군으로 설정하였다.

333)))몸몸몸무무무게게게 및및및 종종종양양양 부부부피피피 측측측정정정

광역학 치료후 SD rat의 몸무게와 종양 부피의 변화를 관찰하기 위해 15일간 매일 측 정하였다.종양의 부피는 Carlsson의 공식인 V=(ab²)/2로 계산하였다.이때 ‘a’는 장경 이고 ‘b’는 단경으로 하였다.

444)))연연연조조조직직직 방방방사사사선선선 영영영상상상

종양의 방사선 영상은 soft X-ray apparatus (SOFTEX ModelCMBW-2,Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다.방사선 촬영 전에 SD rat을 7–8mgketamine/

xylazine을 복강내로 주사한 후 제모하고,마취된 SD rat을 30초간 25kV,20mA 조건 하에 노출시켜 촬영하였다.

555)))생생생체체체발발발광광광 영영영상상상 (((BBBiiiooollluuummmiiinnneeesssccceeennntttIIImmmaaagggiiinnnggg)))

생체발광 영상분석을 위해,RK3E-ras-Fluc 세포를 주사하여 악성종양을 유도한 쥐에 xylazine/ketamine으로 마취하고 복강내로 luciferin (MolecularProbes,Palo Alto,CA 을 80mg/kg을 주사하였다.SD rat을 Xenogen IVIS Imaging System (Xenogen Co.,

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Alameda,CA)을 이용하여 종양에서부터 발산하는 생체발광 신호를 IVIS-100에 부착된 CCD camerasystem으로 확인하였다.

666)))병병병리리리조조조직직직학학학 및및및 면면면역역역조조조직직직화화화학학학 검검검색색색

절제한 종양을 10% 중성 formalin에 24시간 고정하고 통법에 따라 paraffin에 포매한 후,현미경 소견을 관찰하기 위해 4um 두께로 박절하고 통법으로 H&E 염색을 시행하 였다.

종양의 증식능을 측정하기 위해 PCNA를,종양의 세포사와 관련이 있는 clusterin,그리 고 종양의 혈관신생에 관계하는 혈관내피세포 성장인자인 VEGF에 대한 면역조직화학 염색을 시행하였다.면역조직화학 염색은 anti-PCNA antibody (Dako),anti-clusterin, anti-VEGF 를 사용하여 avidin-biotin peroxidasecomplex (ABC)method로 수행하였 다.면역 반응은 diaminobenzidine (DAB)로 관찰하였으며,Mayer씨 hematoxylin으로 대조염색 하였다.증식능 지수는 PCNA에 양성인 세포의 수를 X400시야에서 가장 많 은 5부위의 평균을 구하였다.

777)))TTTUUUNNNEEELLL분분분석석석

종양의 세포사를 측정하기 위해 TUNEL 분석을 시행하였다. TUNEL 분석은 ApopTag® PlusPeroxidaseInSituApoptosisDetectionKit(Intergen,Purchase,NY) 을 이용하여 수행하였다.이를 요약하면,슬라이드에서 파라핀을 제거하고 37℃에서 15 분간 20 μg/ml의 proteinaseK로 처리하였다.내인성 과산화효소를 차단하기 위해 3%

과산화수소에 담근 후 terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)를 포함한 37℃ 반 응 완충액에서 1시간동안 incubation하였다. 과산화효소와 결합한 anti-dioxygenin antibody와 30분간 incubation한 후 반응 산물을 2 mM hydrogen peroxide을 함유한 0.03% 3'-3 diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) 용액으로 발색시키고 0.5%

methylgreen으로 대조염색을 하였다.세포사 지수는 TUNEL 양성인 세포의 수를 X400시야에서 가장 많은 5부위의 평균을 구하였다.

888)))통통통계계계 분분분석석석

각 그룹의 평균값을 구하고 평균±SD로 표현하였다.모든 통계적 계산은 Microsoft Excel을 사용하여 산출하였다.

Ⅲ.결과 및 고찰

111...광광광역역역학학학 치치치료료료후후후 종종종양양양의의의 성성성장장장 억억억제제제

쥐의 체중 변화는 chlorinee6와 laser만 처리한 군에서는 실험기간 동안 지속적으로 몸무게의 증가를 보였다.광역학 치료를 시행한 군에서도 대조군에 비해 몸무게가 다소 감소되었지만 지속적인 증가를 보였다 (Fig 1).이는 광민감제를 투여한 동물이나 광역 학 치료를 시행한 쥐에서 몸무게의 큰 변화가 없어 독성이 적을 것이라 여겨지나 추후 chlorinee6에 대한 독성 및 약리 실험으로 보완해야 할 것으로 생각된다.

Control Chlorin e6 Laser

Chlorin e6 + Laser

6Days 9Days 12Days 15Days 50

0 150

100 250

200

Body weight (g) _Control

Chlorin e6 Laser

Chlorin e6 + Laser Control

Chlorin e6 Laser

Chlorin e6 + Laser

6Days 9Days 12Days 15Days 50

0 150

100 250

200

Body weight (g)

FFFiiiggg111...BBBooodddyyywwweeeiiiggghhhtttccchhhaaannngggeeefffooollllllooowwwiiinnngggPPPDDDTTT

광역학 치료후 종양의 부피 변화를 관찰하기 위해 15일간 매일 측정하였다.광역학 치 료후 유도된 종양의 크기는 시간이 경과에 따라 점차 감소하였다.그러나 정상 대조군 과 chlorine6나 laser만 조사한 종양에서는 종양 성장이 지속적으로 증가함을 확인하였 다 (Fig2A).이는 연조직 방사선 영상에서도 확인할 수 있었다 (Fig2B).다만 chlorin e6만 투여한 군에서도 정상 대조군이나 laser만 조사한 군에 비해 상대적으로 종양의 성장이 완만하였다 (Fig 2C).이는 chlorine6자체의 세포독성에 의한 것일 수도 있고, 또는 chlorine6투여 후에 실험실 여건상 자외선을 완전히 차단 할 수 없어 자연광에서 chlorin e6의 활성화를 초래하여 종양의 성장이 다소 억제되었을 가능성이 높다.이는 앞으로 해결해야 할 과제이다.

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A B

Chlorin e6

Gross Softex

Chlorin e6

Control Control

4 8 12 (Day) 4 8 12 (Day)

Laser

Chlorin e6 + Laser

Laser

Chlorin e6 + Laser

000 0 10000 10000 10000 10000 20000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 30000 40000 40000 40000 40000 50000 50000 50000 50000

6Days 9Days 12Days 15Days

Control Chlorin e6 Laser

Chlorin e6 + Laser Control

Chlorin e6 Laser

Chlorin e6 + Laser

Total Volume (mm3)

C

FFFiiiggg222...TTTuuummmooorrrvvvooollluuummmeeeccchhhaaannngggeeefffooollllllooowwwiiinnngggPPPDDDTTT

222...광광광역역역학학학 치치치료료료후후후 생생생체체체발발발광광광 영영영상상상 신신신호호호 감감감소소소

광역학 치료후 실시간으로 생체발광 영상분석을 위해 Xenogen IVIS Imaging System 을 이용하여 종양에서부터 발산하는 생체발광 신호를 확인하였다.그 결과 대조군에 비 해 광역학 치료 2주후에 종양의 신호 강도가 현저히 감소됨을 관찰하였다.또한 육안소 견과 비슷하게 chlorin e6만 투여한 군에서도 정상 대조군이나 laser만 조사한 군에 비 해 상대적으로 종양의 신호가 다소 약하게 발현하였다 (Fig 3).광역학 치료 2주후에도 종양의 신호가 잔존하였기 때문에 이 종양이 추후에 소실할 것인지 또는 재발할 것인지 를 확인하기 위해 4주 이상 장기적인 계속 관찰이 필요하다고 생각한다.광역학 치료후 에 종양이 완전관해가 보이지 않거나 재발하는 경향이 있다는 논문이 많다.따라서 완 전관해를 보이지 않는 경우 추가적인 광역학 치료의 적용이 필요할 가능성이 있다.또 한 재발하는 일부 종양에서는 광역학 치료에 의해 Cox-2나 HO-1과 같은 단백질이 과 발현하여 종양세포의 apoptosis를 억제하여 종양이 재발한다는 보고가 있어 이들 단백 의 억제를 통해 광역학 치료의 효용성을 증대시키고자 하는 노력이 있어^12-14),이에 대 한 추후 세포 및 분자 기전에 대한 연구가 필요하다고 생각한다.

Ce6 + Laser

Control Ce6 Laser

FFFiiiggg333...BBBiiiooollluuummmiiinnneeesssccceeennntttiiimmmaaagggiiinnngggfffooollllllooowwwiiinnngggPPPDDDTTT

333...광광광역역역학학학 치치치료료료후후후 종종종양양양의의의 증증증식식식능능능 감감감소소소 및및및 세세세포포포사사사 유유유도도도

병리조직학적으로 종양의 괴사는 일부 대조군 및 chlorinee6또는 laser만 조사한 군 에서도 관찰되었지만 광역학 치료후 종양내에서 광범위한 괴사소견이 관찰되었다 (Fig 4).종양의 증식능을 측정하기 위해 PCNA 면역염색을 시행하였고,종양의 apoptosis를 측정하기 위해 TUNEL 분석을 시행하였다.그 결과 광역학 치료한 종양에서는 대조군 에 비해 현격하게 종양의 증식능이 감소하였고,반대로 apoptosis는 현저한 증가소견을 보였다 (Fig5A,B).

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FFFiiiggg...444...RRReeeppprrreeessseeennntttaaatttiiivvveeesssaaammmpppllleeeooofffPPPDDDTTT tttrrreeeaaattteeedddtttuuummmooorrr222wwweeeeeekkkssslllaaattteeerrr...

증식능 지수와 세포사 지수는 PCNA와 TUNEL에 양성인 세포의 수를 X400시야에서 가장 많은 5부위의 평균을 구하였고,이를 그래프한 소견은 Fig5C와 같다.이러한 결 과는 chlorinee6매개 광역학 치료가 종양의 증식을 강하게 억제하고 apoptosis를 유도 하여 종양의 성장을 억제한 것으로 생각된다.추후 이에 대한 분자 기전을 확인하기 위 해 세포수준에서의 실험이 필요하다고 생각한다.

F F

Fiiiggg555,,,HHHiiissstttooopppaaattthhhooolllooogggyyy,,,PPPCCCNNNAAA,,,aaannndddTTTUUUNNNEEELLL ssstttaaaiiinnniiinnngggfffooollllllooowwwiiinnngggPPPDDDTTT

444...광광광역역역학학학 치치치료료료후후후 cccllluuusssttteeerrriiinnn발발발현현현 증증증가가가 및및및 VVVEEEGGGFFF 발발발현현현 감감감소소소

종양의 세포사와 관련이 있는 clusterin,그리고 종양의 혈관신생에 관계하는 혈관내피 세포 성장인자인 VEGF에 대한 면역조직화학 염색을 시행하였다.그 결과 광역학 치료

Chlorin e6 Laser

TUNEL PCNA H & E

Control

A A A A

PCNA Index

Positive cell

0 50 100 150 200 250 300

Cont rol

Chlorine6

Chlorine6 + Laser Laser

B B B B

000 0 20 2020 20 404040 40 60 6060 60 808080 80 100 100 100 100 120120 120120 140 140 140 140 160 160 160 160 180 180 180 180

Positive cell

Control

Chlorine6

Chlorine6 + Laser Laser

Apoptotic Index (AI) C

C C C

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후 clusterin의 발현은 증가하였고,반면에 대조군에서의 발현은 거의 관찰되지 않았다 (Fig 6).특히 세포사가 진행되는 부위에 국한하여 clusterin이 현저하게 발현이 증가하 였다.Clusterin은 apoptosis상태의 심장,죄,간,신장,췌장 및 안구조직 및 세포에서 과발현되는 당단백으로,상반된 두 가지 pro-apoptotic및 anti-apoptotic기능을 수행한 다¹⁵⁾.최근 동물 모델에서 광민감제 phthalocyanine4를 이용한 광역학 치료 후 종양의 apoptosis와 소실에 clusterin이 과발현함을 처음 확인하고 광역학 치료의 효용성을 증 가시킬 수 있는 후보물질로 거론한 바 있다¹⁶⁾.또한 clusterin의 과발현은 대장암 세포에 서 항암치료에 의해 p21의존적으로 apoptosis를 유도하며 APC 유전자에 의해 조절된다 는 보고도 있다¹⁷⁾.반면에 clusterin의 과발현은 전립선암 세포의 방사선 유도 apoptosis 를 억제한다는 상반된 결과도 있다^18-20).Clusterin의 과발현에 의한 종양의 세포사가 광 민감제나 또는 항암치료의 유형에 따라 달리 나타날지에 대한 연구는 전무하다.따라서 앞으로 clusterin의 과발현이 광역학 치료에 대한 효과를 분자수준에서 확인할 예정이 다.

F F

Fiiiggg666...CCCllluuusssttteeerrriiinnneeexxxppprrreeessssssiiiooonnnfffooollllllooowwwiiinnngggPPPDDDTTT

암세포의 경우,정상세포에 비하여 빠른 성장속도를 지니므로 많은 영양소의 흡수가 필수적이다.따라서 병소 주위의 모세혈관에서 혈관 신생(angiogenesis)이 상당히 활발 해지고, 혈관신생은 암세포 자체에서 분비되는 다양한 성장인자들인 vascular endothelialgrowthfactor(VEGF)나 fobroblastgrowthfactor(FGF)에 의하여 촉진되

Chlorin e6

Laser Control

Chlorin e6 + Laser

며,이는 암의 성장 및 전이과정에 필수적이다.특히,VEGF는 혈관 신생을 유발하는 가 장 중요한 성장인자일 뿐만 아니라,세포내 유사분열 촉진 단백질 활성화 및 VEGF의 receptor의 자가인산화를 통한 직접적인 유사분열을 촉진하여 암세포의 성장 및 전이에 필수적인 역할을 한다고 밝혀진 바 있다²¹⁾.이 연구에서 면역조직화학적으로 광역학 치 료후 VEGF의 발현은 대조군에 비해 현저하게 감소하였다.광역학 치료후에 VEGF가 증가하고 이로 인해 치료후 재발이 예측된다는 논문도 있고,광역학 치료후에 종양의 침습과 이동 그리고 전이가 억제된다는 상반된 보고도 있다^21,22).그러나 이 연구에서는 광역학 치료후에 VEGF의 발현이 감소하였다 (Fig7).이러한 결과가 종양의 증식능 억 제에 의한 이차적인 현상인지 또는 광역학 치료에 의해 신생혈관 억제로 이어지고 암세 포의 이동과 침습 그리고 전이가 억제될 가능성이 있는지 앞으로 해결할 필요가 있다.

F F

Fiiiggg777...VVVEEEGGGFFF eeexxxppprrreeessssssiiiooonnnfffooollllllooowwwiiinnngggPPPDDDTTT Chlorin e6

Laser Control

Chlorin e6 + Laser

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Ⅳ.결 론

이 연구는 제2세대 광민감제인 chlorin e6의 광역학 치료의 효능을 관찰하기 위해 RK3E-ras세포를 이용한 쥐 악성종양 모델에서 항암효과를 검증하였다.쥐 악성종양모 델에서 chlorin e6을 투여한 후 diodelaser를 조사하여 종양의 육안 및 방사선 그리고 분자영상 소견과 병리조직 및 면역조직화학학 소견을 관찰하였다.그 결과 광역학 치료 한 종양은 육안,연조직 방사선 영상 및 생체발광 영상 소견에서 종양의 부피가 감소하 였다.PCNA 면역조직화학 염색과 TUNEL assay에 광역학 치료한 종양은 증식능의 감 소와 apoptosis의 증가를 보였다.아울러 광역학 치료한 종양에서 면역조직화학적으로 clusterin발현은 증가한 반면,VEGF 발현은 감소하였다.따라서 chlorine6매개 광역학 치료가 종양세포의 증식과 혈관신생을 저해하고 apoptosis를 유도하여 종양의 성장을 억제할 것으로 생각된다.이러한 소견을 종합해 볼 때 chlorine6매개 광역학 치료는 항 암치료의 대안요법으로 가능성이 매우 높음을 시사하는 소견이다.추후 광역학 치료에 의해 유도되는 세포사의 분자기전에 대한 세포 및 분자수준에서의 연구가 필요할 것으 로 생각한다.

Ⅴ. 참고문헌

1.Dolmans DEJGJ,Fukumura Dm Jain RK.Photodynamic therapy for cancer.

NatureReview Cancer3;3:380-7,2003.

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2008년 6월 일

저작자:김 규 식 (서명 또는 인)

조선대학교 총장 귀하