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Chapter 15
RNA Polymerase II:
Basal Transcription
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Eukaryotic and bacterial RNA polymerases differ in some aspects 1. eukaryotes have three RNA polymerases, with one each specifically
dedicated to rRNA, mRNA, and tRNA synthesis – bacteria have a single RNA polymerase
2. eukaryotic RNA polymerases require numerous transcription factors – bacterial RNA polymerases require one or two at most
3. eukaryotic RNA polymerase requires factors to modify chromatin structure to allow RNA polymerase access
– bacterial genes are fully accessible and tend to be active or require only one or two factors to become active
4. eukaryotes process mRNAs by capping, polyadenylation, and splicing – bacterial RNAs do not have introns and the only modification of
transcripts is polyadenylation to mark the mRNA for degradation
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15.1 Introduction to RNA polymerase II
진핵세포의 핵에서 3가지의 RNA polymerase가 발견됨. RNA polymerase I, II, III는 아래 표에서 보듯이 각각 다른 성격을 갖음
α-amanitin에 대한 민감도가 달라 농도를 조절하여 반응을 조절함. (교과서그림 15.3 참조)
actinomycin D에 대하여도 다른 민감도를 갖음. 이 항생제는 DNA의 C-G, G-C 염기 쌍에 결합하여 가닥의 분리를 막음. rRNA 유전자에 GC가 많아 민감하게 작용. (교과서 그림 15.4 참조)
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Eukaryotic RNA polymerases are more complex than prokaryotic ones
• RNA polymerase I has 14 subunits
• RNA polymerase II has 12 subunits
• RNA polymerase III has 17 subunits
• Bacterial RNA polymerase has 5 subunits
• Archaeal RNA polymerase 11 subunits
Deletion mutants for RPB4 and RPB9 are conditional mutants;
deletion of all other RNA polymerase II subunit genes are nonviable.
The genes encoding the RNA polymerase II subunits are
essential;
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Eukaryotic RNA polymerases share some subunits but not others
Figure 15.05
• Rpb5, Rpb6, Rpb8, Rpb10, and Rpb12 are present in RNA polymerases I, II, and III (진핵세포의 RNA polymerase 간에 일부 subunit를 share 함. 그림 15.5에는 생략됨)
• Many RNA polymerase II subunits have homologs in RNA polymerase I and/or III
The prokaryotic and eukaryotic RNA polymerases exhibit homologies
• archaea and bacteria have a single RNA polymerase to synthesize mRNA, rRNA, and tRNA
• the bacterial core RNA polymerase
subunits each has at least one homolog in each eukaryotic nuclear RNA
polymerase
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Figure 15.6
Structure of the Δ4/7 RNA
polymerase II
15.2 RNA polymerase IIstructure
Kornberg는 yeast RNA polymerase에서 Rpb4와 Rpb7 subunit가 빠진 구조의 결정을 만듬
Eukaryotic and prokaryotic RNA polymerases have similar core structures
효모와 Thermus aquaticus RNA polymeras의 유사성 비교 (좌) 서열의 유사성 (유사부위가 붉은색으로 표시됨)
(우) 구조의 유사성 (유사 부위가 녹색으로 표시됨)
active site가 있는 cleft부위가 유사성이 많음.
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The structure of the 12 subunit RNA polymerase II was finally solved
RNA polymerase의 최종구조
RNA polymerase II transcription elongation complex
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The roles of fork loop 1, rudder, and lid in transcription elongation
• fork loop 1 prevents premature unwinding of the DNA-RNA hybrid
• lid acts as a wedge to separate the DNA and RNA strands and guide the RNA to the exit path
• the rudder prevents the DNA from re- annealing with the RNA strand
7-8 base pair로 된 DNA-RNA hybrid는 active site로부터 나오면서 방향이 바뀌면서 분리가 되어 나온다. clamp로부터 돌출된 세개의 loop인 lid, rudder, fork loop 1이 hybrid dissociation, RNA exit, maintenance of the upstream end of the transcription bubble에 중요한 역할을 한다.
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The bridge helix acts as a ratchet to advance RNA polymerase on DNA
RNA polymerase가 새로운 염기를 가하면서 DNA 주형을 따라 움직이는가를 설명함.
Rpb1과 Rpb2 사이에 만들어진 cleft에 걸쳐있는 Rpb1 subunit가 bridge helix로 작용하며 straight 구조와 bent 구조 사이에서 변화하면서 진행을 시킴.
(좌) synthesis; nucleotide triphosphate (NTP)가 비워있는 부위를 채워 RNA 가닥의 3’을 연결한다. (A는 active site. 핑크 점은 magnesium ion). Translocation; nucleic acid가 이동을 하며 helix가 straight (회색)에서 bent (보라색) conformation으로 변한다.
Relaxation; bridge helix가 다시 straight (회색)로 변하면서 NTP가 첨부될 수 있는 부위가 생김
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15.3 Transcription initiation site identification
Figure 15.12
RNA polymerase는 전사를 시작하기 위하여서 transcription factor의 도움이 필요하다.
그 과정을 15장에서 배우고 RNA polymerase I과 III에 대하여서는 18장에서 배운다.
RNA polymerase II transcription begins at specific initiation sites
RNA polymerase는 특정한 부위에서 전사를 시작한다. 전사 시작 부위를 찾는 방법에는 3가지가 있는데 S1 mapping (S1 nuclease analysis), primer extension, run-off analysis가 있으며 앞의 두 가지는 living cell과 cell free-system에서 사용 가능하고 마지막 방법은 cell-free system에서 사용 가능하다.
S1 Mapping
방사성 동위원소로 표시된 DNA probe를 세포에서 추출한 RNA와 결합을 시킨다. 결합 후 S1 nuclease로 단일 가닥을 절제하고 남은 DNA-RNA hybrid를
denature 시킨다. 이곳에 남은 DNA를 전기 영동을 하여 크기를 파악한다. 그림에서는 275 base이고 그로 인하여 시작 부위를 찾을 수 있다.
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Primer extension
Figure 15.13
Run-off transcription (좌) 전사 시작 부위로 부터
50-150 nucleotide downstream 부위의 염기서열을 갖은
18 nucleotide의 크기의 DNA primer를 합성한다.
이를 RNA와 교잡 한 후 reverse transcriptase로 5’ 말단을 합성한다.
변성 시킨 후 전기 영동을 이용하여 시작 부위를 파악
(우) 관심이 있는 유전자 (light blue)를 plasmid에 넣은 후 전사 시작부위에서 약 200 nucleotide downstream 부위를 제한 효소를 이용하여 자른다. 이곳에 radioactive nucleoside triphosphate, RNA polymerase 등을 첨가하여 전사를 야기 시킨 후 RNA 전사체가 만들어지면 전기 영동을 하여 크기를 밝혀낸다.
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Many genes can be monitored simultaneously by DNA microarrays
(좌) DNA의 발현을 보기 위하여 micro array를 이용한다.
6주된 hypothyroid mice와 thyroxine을 주입한 동일한 연령의 쥐로부터 간을 추출 한 후 RNA를 분리하여 cDNA를 만든다. hypothyroid liver에 분리한 cDNA는 green으로 label 하고 hyperthyroid liver에서 분리 한 cDNA는 red로 label 한다. cDNA probe를 mix 한 후 동시에 microarray에 hybridization 시킨다,
green은 hypothyroid liver에서 많이 만들어지는 RNA 이고 red는 반대임. yellow는 관계 없이 양쪽에서 만들어지는 RNA를 나타냄.
(우) reporter gene를 만들어서 regulatory region의 effect를 살펴보는 실험.
관심 있는 유전자의 regulatory 지역을 coding sequence가 알려진 유전자의 앞부분에 삽입을 한다. 만들어진 recombinant DNA를 진핵 세포내에 삽입 한 후 reporter 단백질의 합성에 regulatory region이 어떠한 effect를 미치는가를 조사함.
외부 DNA를 진핵세포내로 넣는 것을 transfection이라고 한다.
