In Vitro and Cell Imaging-Based Analysis of Protease Activity Using Nanoparticles

In Vitro and Cell Imaging-Based Analysis of Protease Activity Using Nanoparticles

Gae Baik Kim and Young-Pil Kim

^†

Department of Life Science, Hanyang University

나노입자를 활용한 In vitro 및 세포이미징 기반 단백질분해 효소활성 분석법

김계백, 김영필^† 한양대학교 생명과학과

(Received September 3, 2018; Accepted September 18, 2018)

바이오세라믹

특 집

CERAMIST

Ceramist

Vol. 21, No. 3, pp. 204~215, 2018.

https://doi.org/10.31613/ceramist.2018.21.3.05

Abstracts

Proteases are one of the most abundant classes of enzymes in living organisms and have been considered major targets for drug development. However, despite the ability to specifically cleave their substrates, many attempts to assay protease activity have generally relied upon the use of gel zymography or fluorophore-labeled peptide substrates, which is limited in rapid and multiplex analysis. Here we review the recent advances in nanoparticle (NP)-utilized assays of protease activity focused on in vitro and cell imaging-based approaches. Owing to large surface area and unprecedented physical properties of NPs, these approaches are anticipated to facilitate many applications related to protease activity-based disease diagnosis and drug discovery.

Keywords: nanoparticle, protease, enzyme activity, cell imaging

1. 서론

단백질 분해효소는 생물체에서 가장 풍부하게 존재하 는 단백질(효소)군의 하나로서 세포이동, 세포분화, 암전 이, 신호전달 등과 관련된 다양한 생물학적 기능을 수행 하고 있기 때문에 약물 개발과 질병 진단을 위한 주요 표

적으로 간주되어 왔다.

¹⁾

단백질 분해효소는 단백질 발현

후 세포 내외 환경에서 다양한 생체분자간의 상호작용에

의해 활성이 조절되고 있기 때문에 발현량의 분석과 더불

어 단백질 분해효소 활성을 직접적으로 측정하는 일이 중

요하다. 이를 위해 전통적으로 단백질 분해효소의 기질

특이적인 반응을 기반으로 기질 단백질을 겔(gel)화 하여

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나노입자를 활용한

In vitro

및 세포이미징 기반 단백질분해 효소활성 분석법 바이오세라믹

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분석하는 자이모그래피(zymography)가 널리 사용되고 있으나 단백질의 풀림(unfolding)과 재접힘(refolding) 과정에 따른 활성 감소 가능성과 과다한 분석시간 소요, 다양한 단백질 분해효소 분석을 위한 기질 사용의 제한, 실시료에 존재하는 단백질 분해효소의 다양한 복합체의 활성을 구분하기 어렵다는 문제점들이 부각되고 있다. 또 한 단백질 분해효소 활성측정을 보다 편리하게 수행하기 위해 도입되는 방법으로 형광체가 부착된 펩타이드나 기 질단백질을 사용한 형광분석, 비색분석, 화학발광 분석 등이 개발되어 왔으나,

²⁾

이러한 방법들은 낮은 검출 감 도, 낮은 신호 대 잡음 비, 실시료 사용시 비특이적 반응 으로 인한 문제점에 노출되어 왔다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 현재까지 우수한 물리화학적 특성을 가진 나노입자를 기반으로 생체분자 및 효소활성을 효과적으로 측정하기 위한 방법이 개발되 어 왔고 그 결과 측정감도, 표적특이성, 안정성, 동시분 석능력 등을 향상시킬 수 있는 센서로서 광범위하게 보고 되고 있다.

³⁾

이와 같은 나노입자들은 단위부피당 넓은 표 면적의 특성을 바탕으로 핵산, 펩타이드, 단백질 등을 포

함한 수용체(bioreceptor)들의 다량결합, 수용체의 안정 적인 지지, 표적에 대한 친화도 향상, 표적의 손쉬운 분 리기능, 광신호 및 전자기적 신호발생 다기능 트랜스듀 서, 신호세기 증폭기능 등 다양한 역할을 부여함으로써 전통적인 분석법에서 해결되지 못한 문제점들을 극복할 수 있다(Fig. 1). 따라서 본문에서는 나노입자를 효소활 성 분석에 활용한 최근 연구동향을 소개하고자 한다. 특 히, 나노입자 중에서 널리 사용되고 있는 금 나노입자 (gold nanoparticle, AuNP), 양자점(quantum dot, QD), 자성 나노입자(magnetic nanoparticle, MNP)를 중심으로 나노입자의 간략한 특성과 함께 단백질 분해효 소 활성 측정에 활용된 in vitro 분석 및 세포이미징 분석 사례를 통해 기존 분석법에 비해 향상된 점 및 향후 전망 에 대해 논의하고자 한다.

2. 금나노입자를 이용한 단백질 분해효소 활성 분석법

생명과학분야에서 금나노입자를 활용한 분석방법은 비색법에 기반한 항원항체 스트립 센서, 전자현미경 이미

Fig. 1. 나노입자 복합체를 사용하여 단백질 분해효소 활성을 측정하기 위한 다양한 분석방법의 모식도

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징시 신호증폭용 소재 등으로 활용된 것을 포함하여 최근 20여년간 금나노입자를 기반으로 하는 다양한 생체물질 분석방법은 폭발적으로 그 응용범위를 확장하여 왔다.

⁴⁾

이는 금나노입자의 높은 안정성, 생체친화성, 넓은 표면 적, 생체분자 결합의 수월성과 더불어 우수한 광학적 및 전기적 특성 효과 때문이다. 1990년대 중반부터 미국 Northwestern 대학의 Mirkin 교수 및 미국 UC Berkeley 대학의 Alivisatos 교수 연구실에서는 금나노 입자와 DNA간 결합 및 DNA서열과 금나노입자 크기에 따른 조절기작 등을 포함한 선도적인 기초연구를 수행한 바 있다. 금나노입자는 크기(지름)가 1-100 nm에서 자 유롭게 조절 가능하여 우수한 광산란효과 특성을 활용한 나노입자간 응집유도와 이에 따른 색깔 변화 기반의 비색 분석, 우수한 전기전도성에 기반한 전기화학적 분석, 표 면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)기반 분 석 및 표면증강 라만분석(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS), 형광소결 및 형광증폭에 기반한 형광분석 등 다양한 분석법에 활용될 수 있다. 이중에서 도 금나노입자에 기반한 효소 활성 분석법은 최근 리뷰논 문에 요약 정리되어 발표되었지만,

⁵⁾

여기서는 금나노입 자에 기반한 세포이미징 부분을 포함하여 효소 활성 분석 법에 대한 보다 최근 동향을 소개하고자 한다.

2.1 금나노입자 기반 비색법

분석의 간편성과 수월성으로 금나노입자에 기반한 비 색분석법은 효소활성 분석분야에서도 상당히 주목을 받

아 왔다.

⁶⁾

일반적으로 금나노입자의 표면에 다양한 생체 물질(효소의 기질을 직접사용하거나 효소-기질 반응 생 성물과 결합할 수 있는 물질)을 손쉽게 결합시킴으로써 표면수식화를 거쳐 기능성을 갖는 나노입자로 변환이 가 능하다. 이러한 기능성 금나노입자는 용액 내에서 다양한 효소 활성에 의해 응집과 분산이 손쉽게 조절될 수 있으 며, 응집으로 유도되는 나노입자 크기 변화로 인하여 빛 의 산란과 표면 플라즈몬 공명 효과가 바뀌게 되어 용액 에서의 색변화가 발생하게 된다.

^7),8)

이와 같은 원리에 기 반하여, 전달효소(transferases), 단백질분해효소 (pro- teinases), 지질분해효소(lipases)등을 포함하는 다양한 효소활성을 색깔 변화로 간편하게 분석할 수 있는 방법들 이 보고 되었다.

⁵⁾

2012년 본 연구그룹에서 발표한 금나노 입자 비색법에 기반한 단백질 분해효소활성 분석 사례를 살펴보면,

⁹⁾

Fig. 2에서와 같이 금이온과 citrate를 기반 으로 합성된 금나노입자를 한쪽은 티올기(thiol group), 다른 한쪽은 카르복실기(carboxyl group)가 연결된 poly (ethylene glycol) 리간드로 안정화시켜 표면에 음 이온을 갖는 금나노입자 용액을 제작하였다. 단백질 기질 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP) 활성을 측 정하기 위해서 금나노입자 용액에 펩타이드와 2가의 금 속이온을 첨가하여 금나노입자의 응집변화를 유도하게 되고 여기서 사용된 펩타이드는 MMP의 기질서열과 함 께 양쪽말단에 헥사히스티딘(hexahistidine) 서열을 갖 고 있어 MMP 활성이 없고 금속이온 (Ni

²⁺

, Co

²⁺

, Zn

²⁺

, Cu

²⁺

)이 존재 시 금나노입자 표면에 노출된 카르복실기

Fig. 2. 금나노입자의 비색법에 기초한 단백질 분해효소 활성의 분석법. 카르복실기로 개질화된 금 나노입자 (A)의 표면에 금속 양이온과 펩

타이드의 헥사히스티딘 잔기의 친화력으로 금나노입자의 응집을 유도함 (B). 단백질 분해효소의 활성에 의해 펩타이드의 기질 부분이

잘려 금 나노입자의 응집은 억제됨 (C).

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나노입자를 활용한

In vitro

및 세포이미징 기반 단백질분해 효소활성 분석법

와 펩타이드에 존재하는 히스티틴이 강하게 부착하는 성 질로 인하여 금나노입자가 빠르게 응집되어 색깔이 변하 게 된다. MMP를 첨가할 경우 펩타이드의 기질부분이 절 단되어 금나노입자의 응집이 억제됨으로써 용액의 색변 화는 다시 회복될 수 있다. 이러한 원리에 기반하여 단백 질 분해효소의 활성을 금 나노입자의 응집 및 분산을 통 해 용액의 흡광도를 통해 손쉽게 분석할 수 있으며, MMP 활성의 검출 한계는 10 nM로 확인되었다.

화학물질을 직접 효소 반응에 이용하여 분석하는 비색 법에 비해 이와 같은 금나노입자 비색법의 경우 높은 흡 광 계수와 상대적으로 큰 파장 변화 때문에 효소 반응의 신호 변화를 보다 신속 간편하고 정확하게 확인할 수 있 으며 다양한 전처리 과정 및 신호 증폭 과정과 결합하여 활용할 수 있기 때문에 실시료 분석에도 적용할 수 있다.

예를 들어, 실시료에 존재하는 단백질 분해효소와 반응 후 금나노입자만을 원심분리(centrifugal separation)하여 분석할 수 있고, 실시료에 존재하는 효소와 특이적으로 결 합하는 항체를 이용하여 면역침전법(immunoprecipita- tion)과 연계하여 분석할 수도 있다. 또한 비색법이나 흡 광분석 이외에도 금나노입자의 응집 변화 여부를 효과적 으로 검출하기 위한 다양한 분석방법이 도입될 수 있다.

2.2 금나노소재 기반 전기화학 분석법

과거 수 십년 동안, 효소의 활성을 전기적 신호로 변환 하여 측정하는 전기화학 바이오센서가 널리 사용되어 왔 다.

¹⁰⁾

금나노입자는 전극과 계면 사이에 전기화학 신호를 효과적으로 전달하고 증폭할 수 있는 소재로서 각광을 받 아왔다. 특히 생물적합성, 전도성, 촉매성이 뛰어날 뿐만 아니라, 효소 반응 시 발생하는 산화환원과정에서의 전자 전달 효율을 향상시킬 수 있다. 그러나 금나노입자에 기 반한 전기화학 센서를 효소측정에 활용한 사례는 과산화 효소(peroxidase)와 타이로신 산화효소(tyrosinase)에 초점을 두었고 이러한 효소와 반응하는 산화환원 물질로 서의 기질이 전극으로 전자전달 효과를 증폭시키는 원리 에 기초하여 효소 활성 측정보다는 효소를 이용한 산화환 원 반응 증폭시스템으로 사용하여 왔다. 특히 단백질 분 해효소 활성을 직접적으로 검출하기 위한 전기화학센서 의 개발은 제한되어 왔으나 캐나다 토론토 대학의 Kelly 교수 그룹에서는 단백질 분해 효소 중의 한 가지인 prostate-specific antigen (PSA)의 활성을 검출하기 위해 금나노와이어(nanowire)를 사용한 전기화학 분석 법을 보고하였다.

¹¹⁾

금나노와이어 전극에 티올기-금원자 간의 결합력을 이용하여 PSA에 의해 잘려지는 펩타이드

Fig. 3. 금나노와이어를 이용한 전기화학적 단백질 분해효소 활성측정법. 단백질 분해효소인 PSA 활성 검출에 펩타이드가 사용되었고, 전자

전달체로서 [Ru(NH

3

)

6

]

³⁺

를 사용하여 시간에 따른 전하량을 검출함으로써 PSA활성을 분석하였음.

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기질을 시스틴(Cys)을 경유하여 고정시킨 후 금나노와이 어 전극 표면에서의 전기적 신호 변화를 효과적으로 측정 할 수 있었다. Fig. 3에서 나타난 바와 같이, 금나노와이 어 방향의 펩타이드 서열의 양 말단은 음전하를 띤 글루탐 산(EEEE)과 양전하를 띤 라이신(KKKK)로 이루어졌고, 이 중 글루탐산 부분이 시스틴을 통해 금 나노와이어에 결 합된 이후 PSA의 활성으로 기질 펩타이드가 잘리면 금 나 노와이어에 음전하를 띤 부분만 남아있게 되어 음전하를 띤 분자에 정량적으로 결합하는 [Ru(NH

3

)

6

]

³⁺

를 전자전달 체로 사용하여 시간대전하분석법(chronocoulometry)을 통해 PSA의 활성을 고감도로 분석할 수 있다.

2.3 금나노입자 기반 형광분석법

금나노입자는 유기형광체를 유기소광체에 비해 높은 효율로 소광시키는 것으로 알려져있으며, 이러한 광학적 특성을 활용하여 다양한 물질 분석에 사용해 왔다.

^8),12)

금 나노입자 표면에서 형광소광 기작은 형광체와 금나노입 자간 에너지 전이효율이 공여체(donor)인 형광체와 수용 체(acceptor)인 금나노입자간의 거리의 네제곱에 반비례 하는 금속표면 에너지 전이 과정(surface energy transfer)에 기인한다.

¹³⁾

따라서 금나노입자는 전통적인 F öster resonance energy transfer (FRET) 과정에서 관찰되는 에너지 전이 효율보다(10 nm 이내에서 작용함) 높기 때문에 보다 확장된 거리에서(약 22 nm 이내)를 작 용할 수 있기 때문에 보다 높은 민감도로 생체분자

^4d),14)

및 저분자 물질

¹⁵⁾

의 고감도 검출법에 사용되었다. 본 연 구그룹에서는 카르복실기로 개질화된 금 나노입자와 형 광물질이 결합된 펩타이드를 사용하여 단백질 분해효소 인 MMP-7에 대한 활성 분석법을 보고하였다.

¹⁶⁾

Fig. 4 에서 나타난 바와 같이, 단백질 분해효소에 대한 펩타이 드 기질 한쪽 말단에 형광체를 결합시키고 다른 말단에는 헥사히스티딘을 부착시켜 금나노입자 표면에 반응시킬 경우, 앞서 금나노입자의 비색법에서 언급한 원리와 동일 하게 니켈 양이온(Ni

²⁺

)에 의해서 카르복실기로 코팅된 금나노입자표면에 펩타이드가 빠르게 결합하여 형광물 질이 소광되고 MMP-7의 활성에 의해 다시 형광이 발생 됨을 확인할 수 있다.

형광체 이외에도, 금나노입자는 생물발광(biolumi- nescence)의 소광을 유도할 수 있다.

¹⁷⁾

단백질 분해효소 의 기질 펩타이드와 루시퍼라아제(luciferase) 결합 단백 질을 금나노입자 표면에 결합시킬 경우 생물발광은 급격 히 감소되며, 단백질 분해효소에 의해 루시퍼라아제 효소 가 금나노입자 표면에서 떨어질 경우 생물발광이 증가하 는 것으로 보고되었다. 따라서 금나노입자표면에 다양한 형광 및 발광 물질을 사용하여 단백질 분해효소 활성을 정량적으로 분석할 수 있으며 이러한 금나노입자의 소광 능력은 높은 선택성과 민감도로 다양한 분해효소의 활성 분석을 위한 소재로서 활용할 수 있다.

Fig. 4. 금나노입자와 형광체(tetramethylrhodamine, TAMRA)가 부착된 펩타이드 간의 소광 원리를 이용한 단백질 분해효소의 활성분석법. 니

켈 양이온의 존재 시 금나노입자 표면에 노출된 카르복실기와 펩타이드의 헥사히스티딘 결합으로 TAMRA가 금나노입자 표면에 가

까워짐으로써 형광이 감소되고, 이후 단백질 분해효소의 활성으로 기질 펩타이드가 분해됨으로써 금나노입자 표면에서 TAMRA가 이

격됨으로써 형광이 발생함.

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나노입자를 활용한

In vitro

및 세포이미징 기반 단백질분해 효소활성 분석법

2.4 금나노입자 기반 표면증강 라만분석법 및 Dark- Field 이미징 분석법

표면 증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering, SERS) 현상은 금속나노입자 표면에서 입사 된 빛에너지의 파장이 표면 진동수와 공명을 일으켜 발생 하는 국소 플라스몬 공명(localized surface plasmon resonance, LSPR)에 의해 발생하는 전자기적 증폭 혹은

금속나노입자 표면에 흡착된 물질에서 에너지 차이로 발 생되는 전하이동 증폭으로 비탄력적인 산란에 해당되는 라만 신호가 증강되는 원리이다. 기술적으로 단분자를 측 정할 수 있는 수준까지 초고감도 소량 검출이 가능하기 때문에 상대적으로 안정하고 표면처리가 용이한 금나노 입자를 사용하여 널리 사용되어 왔다.

¹⁸⁾

이러한 금나노입 자 기반의 SERS는 다양한 효소 활성 분석과 더불어 진단

Fig. 5. 금나노입자와 라만 리포터를 이용한 SERS 기반 트립신 활성 분석

Fig. 6. 금나노입자의 응집변화에 의해 유도되는 산란신호를 이용한 caspase-3 활성 이미징. A) 펩타이드에 의해 결합된 왕관형태의 금나노

입자 응집체 구성과 caspase-3에 처리 이후 응집체의 분산 모식도. B-D) Caspase-3 처리 이후 시간에 따라 산란강도가 변함에 따

라 나타나는 표면 산란이미징 결과를 암시야 현미경 (dark-field microscopy)으로 측정함.

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측정법으로 다양하게 활용되고 있다.

¹⁹⁾

금나노SERS 기 반의 효소 활성 분석법에 대한 최근 연구로서 트립신 활 성의 초고감도 분석이 보고되었다.

²⁰⁾

Fig. 5에서 나타난 바와 같이, 효소 분석을 위해 라만 리포터(4-mercapto- benzoic acid, 4-MBA)로 개질화된 금나노입자를 사용 할 때 시스틴이 포함된 펩타이드 기질(RCFRGGDD)이 트립신의 작용으로 잘려지게 되고, 떨어져 나온 양전하성 RCFR이 4-MBA로 개질화된 금나노입자 표면에 강하게 흡착되어 정전기적 상호작용을 통해 나노입자를 응집시 키고 응집된 나노입자 사이에서 강한 “핫스팟”을 만들어 내어 4-MBA의 강한 SERS신호를 유도하게 된다.

금나노입자 표면에서는 점멸없이 지속적이고 강하게 빛을 산란시킬 수 있어,

^21),22)

산란광을 이용할 경우 장시 간 효소 활성을 분석할 수 있다. Alivisatos 연구진은 금 나노입자 기반의 산란광을 이용하여 암시야 이미징 (dark-field imaging)을 구현하여 caspase-3의 활성 분석결과를 보고한 바 있다.

²³⁾

Fig. 6에 나타난 바와 같 이, caspase-3에 의해 절단될 수 있는 펩타이드를 이용 하여 금나노입자 주변에 다른 금나노입자 4개를 비오틴- 아비틴 결합을 통해 부착시켜 왕관형태의 금나노입자 구 조체를 만든 후 산란 효과를 극대화 시키고, caspase-3 에 의해 왕관 형태의 나노구조체가 붕괴할 경우 빛의 산 란신호가 크게 바뀌게 되는 원리를 기반으로 암시야 현미 경 (dark-field microscopy)으로 효과적으로 모니터링 이 가능하게 된다. 이러한 방법은 기존 형광 분석법과는 달리, 살아있는 세포에서 caspase-3의 활성을 2시간 이 상 지속적으로 모니터링할 수 있는 효과적인 이미징 프로 브로서 활용할 수 있게 된다.

3. 양자점 (quantum dot)을 이용한 단백질 분해효소 활성 분석법

반도체 나노결정체인 양자점(quantum dot, QD)은 높 은 양자 수율, 우수한 광안정성, 크기에 따라 다양한 형 광 방출능력 등의 광학적 특성으로 전통적으로 사용되고 있는 형광시료들을 빠르게 대체하고 있다.

²⁴⁾

특히, 양자 점은 위의 특성이외에도 높은 흡광계수(0.5-5×10

⁶

M

^-1

cm

^-1

)와 UV를 포함하는 넓은 흡광 스펙트럼 및 크기에 따라 구별되는 좁은 발광 스펙트럼(최대치의 절반값에서 의 폭이 25-40 nm)을 가지고 있어 하나의 여기 파장으 로 동시에 다양한 형광을 분석할 수 있는 동시 이미징에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 양자점을 형광에너지 수용체로서 이용 시 다양한 FRET 기반 바이오센서로 광 범위하게 사용될 수 있다.

²⁵⁾

3.1 FRET을 이용한 단백질 분해효소의 활성 분석

양자점 기반 FRET 방법을 이용하여 단백질 분해효소

를 포함하는 다양한 효소들에 대한 활성 분석 연구가 수

행되어 왔다.

^26),27)

2006년 미국 Naval Research

Laboratory의 연구진들은 양자점과 형광부착 펩타이드

를 사용하여 서로 다른 종류의 단백질 분해효소

(caspase-1, 트롬빈, 키모트립신, 콜라겐분해효소)으 활

성을 실시간으로 분석하고, 효소-기질 반응속도를 계산

할 수 있는 모델로서 사용하여 기존 FRET 방법에 비해

양자점을 사용할 경우 상대적으로 낮은 기질 농도범위에

서도 효과적으로 분석 가능함을 밝혔다.

²⁸⁾

2008년 영국

Manchester 대학 Douglas 연구진은 단백질 분해효소

(트립신)을 포함한 DNA분해효소, pH등을 센싱할 수 있

는 QD-FRET 나노 센서를 서로 다른 양자점을 사용하여

설계하였고,

²⁹⁾

캐나다 British Columbia대학의 Algar

연구진들은 2014년 스마트폰으로 서로 다른 세종류의 양

자점과 펩타이드형광체 조합으로 구성된 바이오칩을 구

성하여 각각 트립신, 키모프립신, 카이네이즈(kinase)를

손쉽게 RGB 색으로 분석할 수 있는 시스템을 개발하였

다.

³⁰⁾

이에 앞서 국내 KAIST 연구진은 2008년 3종의 단

백질 분해효소를 하나의 바이오칩에서 동시분석할 수 있

는 방법을 구현한 바 있다.

³¹⁾

특히 앞서 언급한 금나노입

자의 형광소결 효과를 이용하여 3종의 양자점에 펩타이

드 결합된 금나노입자가 결합시 양자점의 형광이 동시에

소결되는 원리를 활용하여 서로 다른 기질 펩타이드를 서

로 다른 양자점에 결합하여 하나의 기판에 구성할 수 있

게 된다. 서로 다른 단백질 분해효소를 기판의 다른 부위

에 처리하여 형광 스캐너로 기판을 빠르게 분석하였을 때

효소에 특이적인 기질이 부착된 양자점에서만 효과적으

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나노입자를 활용한

In vitro

및 세포이미징 기반 단백질분해 효소활성 분석법

로 형광이 발생하는 것을 확인할 수 있으며 이러한 동시 분석용 바이오칩은 다양한 종류의 단백질 분해효소 활성 을 초고속으로 분석할 수 있고 다양한 저해제의 분석 시 스템으로 활용할 수 있음을 보여주였다(Fig. 7).

3.2 양자점 기반 세포 이미징을 통한 효소활성 분석법

양자점이 in vivo 형광이미징을 효과적으로 구현할 수 있는 물질로서 과거 많은 연구그룹에서 보고된 바 있으나 최근 생체 및 동물실험 시 체내 축적문제, 독성문제 등을

Fig. 7. 양자점 FRET에 기반한 다중 단백질 분해효소 활성 측정용 바이오칩. A) 3종류의 다른 색을 갖는 양자점을 바이오칩에 고정 후 형과소 결능력을 갖는 금나노입자와 기질 펩타이드를 결합하여 MMP-7, caspase-3, 트롬빈에 대한 활성을 측정 (a: 스트렙트 아비딘으로 코 팅된 3종류의 양자점을 각각 4개의 spot형태로 슬라이드 표면 위에 마이크로어레이어를 이용하여 고정. B: 고정된 양자점에 각각 서로 다른 펩타이드 (말단은 비오틴으로 치환)와-금나노입자의 결합체를 처리. c: MMP-7 처리 후. d: caspase-3 처리 후. e: 트롬빈 처리 후. f: 단백질 분해효소와 각각의 inhibitor 처리. B) 양자점-펩타이드-금나노입자의 결합체에 MMP-7처리 전(왼쪽)과 처리 후(오른쪽)의 고해상도 TEM 사진. C) 용액 속에 서로 다른 양자점에 펩타이드-금나노입자를 반응 한 이후 양자점의 형광 억제효과를 나타낸 그래프.

Fig. 8. 살아있는 세포에서 양자점을 이용한 서로 다른 단백질 분해효소 (MMPs)활성의 동시 분석 이미징. (위) 스트렙트아비딘이 코팅된 양자 점에 바이오틴화 펩타이드를 결합시키는 모식도 (아래) 서로 다른 펩타이드와 양자점 결합체를 이용한 다중 이미징. 3 종류의 펩타이 드를 3 종류의 양자점에 각각 반응시켜 만든 결합물을 MMP-2 분비 암세포인 HT-1080 세포에 처리한 후의 공초점 형광 이미징 결과.

MMP2/9에 반응하는 펩타이드 (첫번째 사진, 초록색)와 MMP-2에만 특이적으로 반응하는 펩타이드 (두번째 사진, 노란색)에서만 형광

이 관찰되었고 MMP-7에서 특이적으로 반응하는 펩타이드 (세번째, 빨간색)에서는 형광이 관찰되지 않음 (MMP2/9-Qdot525: EEEE-

GG-IPVSLRSG-GG-RRRRK-QD525, MMP2-QD605: EEEE-GG-SGRSLSRLTA-GG-RRRRK-Qdot605, MMP7-655: EEEE-GG-

VPLSLTMG-GG-RRRRK-Qdot655).

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야기할 수 있어 제한적으로 사용되고 있는 반면, 장시간 이미징 분석시간 동안의 세포수준의 독성은 미미하여 살 아있는 세포에서 양자점을 활용한 형광이미징 분석방법 은 매우 효과적이다. 따라서 양자점을 세포수준에서 분비 하는 단백질 분해효소 활성 분석에 직접적으로 적용할 수 있는 이미징 기술로서 활용할 경우 세포에서 시간에 따라 분비되는 다양한 종류의 단백질 분해효소의 활성을 동시 에 분석할 수 있는 모니터링 시스템으로 활용할 수 있다.

이와 같은 방법을 구현하기 위해 최근 본 연구팀에서는 MMP-2가 주로 분비되는 세포주를 모델로 서로 다른 세 종류의 양자점을 MMP에 의해 잘려질 경우 세포 내로 유 입될 수 있는 펩타이드 서열과 결합하여 세포이미징 분석 에 적용하였다(Fig. 8). 즉, 스트렙트아비딘이 코팅된 양 자점에 단백질 분해효소의 기질로 사용되는 비이오틴 펩 타이드를 결합시켜 펩타이드-양자점 결합물을 만든 후 세포 배양액에 일정 농도로 처리한 후 공초점 형광 현미 경으로 세포 내 유입된 형광세기를 통해 단백질 분해효소 의 활성을 분석하였다. 단백질 효소활성에 의존적으로 세 포 투과능력을 가진 기질 펩타이드는 MMP-2, MMP- 2/9, MMP-7등에 특이적인 기질 펩타이드 서열을 중간 에 두고 N-말단에 음전하를 띤 4개의 글루탐산(E4)을 위치시키고, C-말단 부분에 비오틴(biotin)과 함께 양전 하를 띤 4개의 아르기닌(R4)을 위치시켜 제작하였다.

MMP가 분비되지 않는 세포에서는 E4가 R4와 배양액에 존재하는 염이온 조건에서 정전기적으로 강하게 결합하 여 세포막 유입을 억제하는 반면, MMP가 분비되는 세포 의 경우 펩타이드 기질이 잘리게 되어 염이온 조건에서 E4부위가 보다 효과적으로 해리가 된 이후 양자점 표면

에는 R4부분이 노출된다. 그 결과, 양자점은 세포투과능 력을 가진 양전하의 R4 부위를 통해 효과적으로 세포 내 형광 이미징을 검출할 수 있게 된다. 이와 같은 원리로 3 종류의 양자점과 펩타이드 조합을 통해 하나의 세포에서 서로 다른 3종류의 MMP활성을 동시분석 한 결과 HT- 1080세포에서는 MMP-2의 활성을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였고 세포에서 12시간까지 장시간 모니 터링이 가능함을 확인하였다.

4. 자성 나노입자 기반 단백질 분해효소 활성 분석법

금나노입자와 양자점 외에, 생체적합성과 장시간의 안 정성 및 넓은 표면적, 손쉬운 나노입자 크기 조절 등의 특 성과 더불어 외부 자기장에 의해 기능 조절이 가능한 자 성 나노입자(MNPs)도 생물학 분야에서 널리 사용되는 나노입자 중 하나이다.

^32),33)

특히 산화철 기반의 초상자성 나노입자(superparamagnetic iron oxide NPs)를 사용 할 경우 외부 자기장이 없을 때에는 나노입자간의 자기적 상호작용이 거의 없기 때문에, 안정된 콜로이드 상태를 유지할 수 있는 반면 외부자기장이 가해질 경우 나노입자 의 자기적 모멘트가 일정한 방향으로 배열되기 때문에 강 한 자기적 특성이 나타내게 되고 외부자기장에 의해 가역 적으로 조절될 수 있다.

³⁴⁾

자성 나노입자의 표면은 다양 한 리간드와 작용기를 효과적으로 결합시킬 수 있는 금, 은, 산화알루미늄(Al

2

O

3

) 등을 사용하여 개질화 할 수 있 어 다양한 생체분자들을 결합할 수 있고, T2 조영 효과를 획득할 수가 있게 된다(T2는 자기공명영상에서 trans- verse relaxation을 촉진시키는 원리로 어둡게 나타나고

Fig. 9. 자성 나노입자의 응집기반 단백질 분해효소 활성의 T2변화 분석. 초상자성 산화철 나노입자는 MMP-2에 분해되는 펩타이드 기질

(GPLGVRGC)-PEG 사슬에 의해 결합이 억제되지만 MMP-2 활성에 의해 나노 응집 구조체를 이루어 T2 자기 공명 효과가 감소됨

CERAMIST

나노입자를 활용한

In vitro

및 세포이미징 기반 단백질분해 효소활성 분석법

T1 이미지에 비해 감도가 높다). 나노입자의 크기가 20 nm 이상을 사용시 확산속도의 감소가 T2조영효과를 조 절 할 수 있게 되므로 이러한 원리에 기반하여, 미국 MIT 대학의 Bhatia 교수 연구진은 50 nm의 산화철 기반 초 자성 나노입자를 구성하여 단백질 분해효소에 의해 자가 응집을 유도함으로써 단백질 분해효소 활성을 T2 이미지 로 분석할 수 있음을 보고하였다.

³⁵⁾

Fig. 9에서와 같이, 덱스트란으로 코팅된 50 nm 크기의 Fe

3

O

4

자성나노입자 를 비오틴 또는 아비딘으로 개질화 되어 구성하고 자성 나노입자의 표면을 MMP-2의 펩타이드 기질 (GPLGVRGC)과 선형 PEG 사슬로 결합할 경우 PEG 사 슬이 자성 나노입자의 자가응집을 억제하는 반면, MMP-2가 펩타이드를 절단할 경우에는 초상자성 나노 입자의 자가응집을 촉발시켜 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)에서 확산효과의 감소로 인하 여 T2 이완 시간(relaxation time)이 현저하게 줄어들게 된다. 이와 같은 방법은 150 pM 수준의 낮은 자성나노입 자 농도에서도 세포 배양액에 존재하는 MMP-2의 활성 을 자기공명영상을 통해 장시간 모니터링 할 수 있음을 확인하였다.

5. 결론

결론적으로 나노입자를 기반으로 하는 다양한 단백질 분해효소 활성 분석의 사례를 최근 연구동향을 중심으로 나노입자별로 설명하였다. 다양한 나노입자가 갖는 우수 한 광학적, 전기적, 자기적 특성으로 보다 빠르고 정확하 고 높은 감도로써 단백질 분해효소를 다양한 방식으로 분 석할 수 있고, 세포에서 발현되거나 분비되는 단백질 분 해효소 활성을 이미징 기법으로 모니터링 할 수 있음을 확인하였다. 언급된 나노입자 이외에도 폴리머 나노입 자, 탄소나노구조체, 업컨버젼 나노입자, 단백질 나노입 자에 기반한 방법들을 표적물질의 환경 및 용도에 따라 선택적으로 사용하고, 펩타이드와 함께 다양한 타겟 인식 수용체와 접목한다면 단백질 분해효소와 연계된 다양한 생체분자들의 기능을 세포 및 조직수준에서 효과적으로 규명할 수 있을 것이다. 특히 나노입자와 생체분자간의

결합기술을 포함한 표준화 및 재현성 연구와 동시에 랩온 어칩 기술, 세포 내 단분자 이미징 기술, 실시간 분석 기 술 등과 접목할 경우 보다 폭넓은 기초 및 응용연구로 확 장할 수 있을 것으로 예상한다. 더불어 실제 생체시료에 서 효소활성을 조절할 수 있는 신약 후보물질 분석에도 새로운 방법을 제시할 수 있을 것으로 기대한다.

6. Acknowledgement

이 성과는 2016년도 정부(과학기술정보통신부)의 재원 으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No.

2016R1A2B2011744).

참고문헌

1. a) A. Radzicka, R. Wolfenden, Science 1995, 267, 90 –93; b) D. Dunaway- Mariano, Structure 2008, 16, 1599– 1600; c) O. Khersonsky, D. S. Tawfik, Annu.

Rev. Biochem. 2010, 79, 471 – 505.

2. a) T. K. Harris, M. M. Keshwani, Methods Enzymol.

2009, 463, 57 – 71; b) K.Yu, S. Hu, J. Huang, L. H.

Mei, Enzyme Microb. Technol. 2011, 49, 272 –276; c) M. A. Sentandreu, F. Toldra, Nat. Protoc. 2006, 1, 2423 – 2427; d) M. Maeda, H. Arakawa, A. Tsuji, J.

Biolumin. Chemilumin. 1989, 4, 140– 148.

3. a) E. C. Wang, A. Z. Wang, Integr. Biol. 2014, 6, 9 – 26; b) S. S. Agasti, S. Rana, M. H. Park, C. K.

Kim, C. C. You, V. M. Rotello, Adv. Drug Delivery Rev. 2010, 62, 316 – 328; c) M. De, P. S. Ghosh, V.

M. Rotello, Adv. Mater. 2008, 20, 4225– 4241; d) N.

C. Tansil, Z. Q. Gao, Nano Today 2006, 1, 28 –37.

4. a) R. A. Sperling, P. Rivera Gil, F. Zhang, M. Zanella, W. J. Parak, Chem. Soc. Rev. 2008, 37, 1896 – 1908;

b) M. Shah, V. D. Badwaik, R. Dakshinamurthy, J.

Nanosci. Nanotechnol. 2014, 14, 344– 362; c) M. C.

Daniel, D. Astruc, Chem. Rev. 2004, 104, 293 – 346;

d) K. Saha, S. S. Agasti, C. Kim, X. Li, V. M. Rotello, Chem. Rev. 2012, 112, 2739 – 2779.

5. E. Hutter, D. Maysinger, Trends Pharmacol. Sci.

2013, 34, 497– 507.

6. a) D. Vilela, M. C. Gonzalez, A. Escarpa, Anal. Chim.

Acta 2012, 751, 24 – 43; b) W. Zhao, M. A. Brook, Y.

Li, ChemBioChem 2008, 9, 2363– 2371.

7. a) G. Doria, J. Conde, B. Veigas, L. Giestas, C.

김계백, 김영필

특 집

CERAMIST

Almeida, M. Assuncao, J. Rosa, P. V. Baptista, Sensors 2012, 12, 1657 – 1687; b) J. N. Anker, W. P.

Hall, O. Lyandres, N. C. Shah, J. Zhao, R. P. Van Duyne, Nat. Mater. 2008, 7, 442 – 453; c) P. D.

Howes, R. Chandrawati, M. M. Stevens, Science 2014, 346, 53 –63.

8. a) R. Elghanian, J. J. Storhoff, R. C. Mucic, R. L.

Letsinger, C. A. Mirkin, Science 1997, 277, 1078 – 1081; b) N. L. Rosi, C. A. Mirkin, Chem. Rev. 2005, 105, 1547 – 1562; c) J. E. Lee, J. H. Kim, S. H. Lee, J. Y. Kim, S. J. Mah, M. B. Gu, Biochip J. 2013, 7, 180 – 187.

9. G. B. Kim, K. H. Kim, Y. H. Park, S. Ko, Y. P. Kim, Biosens. Bioelectron. 2013, 41, 833– 839.

10. a) N. J. Ronkainen, H. B. Halsall, W. R. Heineman, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 1747 – 1763; b) D. Wei, M.

J. Bailey, P. Andrew, T. Ryhanen, Lab Chip 2009, 9, 2123 – 2131.

11. M. A. Roberts, S. O. Kelly, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 11356–11357.

12. a) B. Dubertret, M. Calame, A. J. Libchaber, Nat.

Biotechnol. 2001, 19, 680– 681; b) E. Dulkeith, A. C.

Morteani, T. Niedereichholz, T. A. Klar, J. Feldmann, S. A. Levi, F. C. J. M. van Veggel, D. N. Reinhoudt, M. Moller, D. I. Gittins, Phys. Rev. Lett. 2002, 89, 203002; c) D. J. Maxwell, J. R. Taylor, S. M. Nie, J.

Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9606 – 9612; d) U. H. F.

Bunz, V. M. Rotello, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 3268 – 3279; Angew. Chem. 2010, 122, 3338 – 3350;

e) G. P. Acuna, M. Bucher, I. H. Stein, C. Steinhauer, A. Kuzyk, P. Holzmeister, R. Schreiber, A. Moroz, F.

D. Stefani, T. Liedl, F. C. Simmel, P. Tinnefeld, ACS Nano 2012, 6, 3189 – 3195.

13. a) T. Sen, S. Sadhu, A. Patra, Appl. Phys. Lett. 2007, 91, 043104 ; b) C. S. Yun, A. Javier, T. Jennings, M.

Fisher, S. Hira, S. Peterson, B. Hopkins, N. O. Reich, G. F. Strouse, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 3115 – 3119; c) E. Oh, M. Y. Hong, D. Lee, S. H. Nam, H. C.

Yoon, H. S. Kim, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 3270 – 3271; d) T. L. Jennings, M. P. Singh, G. F. Strouse, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 5462 – 5467.

14. a) J. H. Kim, R. A. Estabrook, G. Braun, B. R. Lee, N. O. Reich, Chem. Commun. 2007, 4342 – 4344; b) J. M. Obliosca, P. C. Wang, F. G. Tseng, J. Colloid Interface Sci. 2012, 371, 34 – 41; c) W. J. Wang, C. L.

Chen, M. X. Qian, X. S. Zhao, Anal. Biochem. 2008, 373, 213– 219; d) Y. P. Kim, Y. H. Oh, H. S. Kim, Biosens. Bioelectron. 2008, 23, 980 – 986; e) S.

Mayilo, M. A. Kloster, M. Wunderlich, A. Lutich, T.

A. Klar, A. Nichtl, K. Kurzinger, F. D. Stefani, J.

Feldmann, Nano Lett. 2009, 9, 4558 – 4563; f) B. S.

S. Guirgis, C. S. E. Cunha, I. Gomes, M. Cavadas, I.

Silva, G. Doria, G. L. Blatch, P. V. Baptista, E.

Pereira, H. M. E. Azzazy, M. M. Mota, M. Prudencio, R. Franco, Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 1019 – 1027; g) P. P. Hu, L. Q. Chen, C. Liu, S. J. Zhen, S.

J. Xiao, L. Peng, Y. F. Li, C. Z. Huang, Chem.

Commun. 2010, 46, 8285 – 8287.

15. a) H. Lee, K. Lee, I. K. Kim, T. G. Park, Biomaterials 2008, 29, 4709– 4718; b) W. Y. Chen, G. Y. Lan, H.

T. Chang, Anal. Chem. 2011, 83, 9450 – 9455; c) L.

H. Jin, L. Shang, S. J. Guo, Y. X. Fang, D. Wen, L.

Wang, J. Y. Yin, S. J. Dong, Biosens. Bioelectron.

2011, 26, 1965– 1969.

16. S. Y. Park, S. M. Lee, G. B. Kim, Y. P. Kim, Gold Bull. 2012, 45, 213 – 219.

17. Y. P. Kim, W. L. Daniel, Z. Y. Xia, H. X. Xie, C. A.

Mirkin, J. H. Rao, Chem. Commun. 2010, 46, 76 –78.

18. a) P. L. Stiles, J. A. Dieringer, N. C. Shah, R. P. Van Duyne, Annu. Rev. Anal. Chem. 2008, 1, 601 – 626;

b) S. E. Bell, N. M. Sirimuthu, Chem. Soc. Rev. 2008, 37, 1012 – 1024; c) S. Schl ìcker, Angew. Chem. Int.

Ed. 2014, 53, 4756 – 4795; Angew. Chem. 2014, 126, 4852 – 4894.

19. a) B. D. Moore, L. Stevenson, A. Watt, S. Flitsch, N.

J. Turner, C. Cassidy, D. Graham, Nat. Biotechnol.

2004, 22, 1133– 1138; b) R. Stevenson, S. McAughtrie, L. Senior, R. J. Stokes, H. McGachy, L. Tetley, P.

Nativo, J. M. Brewer, J. Alexander, K. Faulds, D.

Graham, Analyst 2013, 138, 6331 – 6336; c) N. N.

Yazgan, I. H. Boyaci, E. Temur, U. Tamer, A. Topcu, Talanta 2010, 82, 631– 639.

20. Z. T. Wu, Y. F. Liu, Y. Z. Liu, H. M. Xiao, A. G.

Shen, X. D. Zhou, J. M. Hu, Biosens. Bioelectron.

2015, 65, 375– 381.

21. X. Y. Wan, L. L. Zheng, P. F. Gao, X. X. Yang, C. M.

Li, Y. F. Li, C. Z. Huang, Sci. Rep. 2014, 4, 4529.

22. P. L. Truong, X. Ma, S. J. Sim, Nanoscale 2014, 6, 2307– 2315.

23. Y. W. Jun, S. Sheikholeslami, D. R. Hostetter, C.

Tajon, C. S. Craik, A. P. Alivisatos, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 2009, 106, 17735 –17740.

24. a) W. C. W. Chan, D. J. Maxwell, X. H. Gao, R. E.

Bailey, M. Y. Han, S. M. Nie, Curr. Opin. Biotechnol.

2002, 13, 40 – 46; b) X. Y. Wu, H. J. Liu, J. Q. Liu,

CERAMIST

나노입자를 활용한

In vitro

및 세포이미징 기반 단백질분해 효소활성 분석법

K. N. Haley, J. A. Treadway, J. P. Larson, N. F. Ge, F. Peale, M. P. Bruchez, Nat. Biotechnol. 2003, 21, 452– 452; c) J. K. Jaiswal, H. Mattoussi, J. M.

Mauro, S. M. Simon, Nat. Biotechnol. 2002, 21, 47 – 51; d) P. Hawrylak, G. A. Narvaez, M. Bayer, A.

Forchel, Phys. Rev. Lett. 2000, 85, 389 – 392; e) I.

Moreels, Z. Hens, Small 2008, 4, 1866 – 1868; f) X.

Gao, Y. Cui, R. M. Levenson, L. W. Chung, S. Nie, Nat. Biotechnol. 2004, 22, 969 – 976.

25. a) A. R. Clapp, I. L. Medintz, J. M. Mauro, B. R.

Fisher, M. G. Bawendi, H. Mattoussi, J. Am. Chem.

Soc. 2004, 126, 301– 310; b) C. Y. Zhang, H. C. Yeh, M. T. Kuroki, T. H. Wang, Nat. Mater. 2005, 4, 826– 831; c) I. L. Medintz, A. R. Clapp, H. Mattoussi, E. R. Goldman, B. Fisher, J. M. Mauro, Nat. Mater.

2003, 2, 630– 638; d) J. M. Mauro, I. L. Medintz, A.

R. Clapp, H. Mattoussi, E. R. Goldman, B. Fisher, Nat. Mater. 2003, 2, 630– 638; e) S. P. Wang, N.

Mamedova, N. A. Kotov, W. Chen, J. Studer, Nano Lett. 2002, 2, 817– 822.

26. I. L. Medintz, A. R. Clapp, F. M. Brunel, T.

Tiefenbrunn, H. T. Uyeda, E. L. Chang, J. R.

Deschamps, P. E. Dawson, H. Mattoussi, Nat. Mater.

2006, 5, 581– 589.

27. J. E. Ghadiali, S. B. Lowe, M. M. Stevens, Angew.

Chem. Int. Ed. 2011, 50, 3417 – 3420; Angew. Chem.

Int. Ed. 2011, 123, 3479 – 3482.

28. I. L. Medintz, A.R. Clapp, F. M. Brunel, T.

Tiefenbrunn, T. Uyeda, E. L. Chang, J. R. Deschamps, P. E. Dawson, H. Mattoussi Nat. Mater. 2006, 5, 581-589.

29. M. Suzuki, Y. Husimi, H. Komatsu, K. Suzuki, K. T.

Douglas, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 5720 – 5725.

30. M. Wu, W. R. Algar, Anal. Chem. 2015, 87, 8078 – 8083.

31. Y. P. Kim, Y. H. Oh, E. Oh, S. Ko, M. K. Han, H. S.

Kim Anal. Chem. 2008, 80, 4634-4641

32. D. Sivakumar, K. C. B. Naidu, K. P. Nazeer, M. M.

Rafi, G. Ramesh kumar, B. Sathyaseelan, G.

Killivalavan, A. A. Begam, J. Korean Ceram. Soc.

2018, 55, 230-238

33. R. A. Frimpong, J. Z. Hilt, Nanomedicine 2010, 5, 1401 – 1414.

34. J. E. Ghadiali, S. B. Lowe, M. M. Stevens, Angew.

Chem. Int. Ed. 2011, 50, 3417 – 3420; Angew. Chem.

Int. Ed. 2011, 123, 3479 – 3482.

35. T. J. Harris, G. von Maltzahn, A. M. Derfus, E.

Ruoslahti, S. N. Bhatia, Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 3161 – 3165; Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 118, 3233 – 3237.

 김 계 백

 2009.03-2011.02 한국외국어대학교 화학과 학사

 2011.03-2018.08 한양대학교 생명과학과 박사 (석박통합과정)

 2018.09-현재 한양대학교 생명과학과 박사 후 연구원

 김 영 필

 1992.03-1996.02 한양대학교 생물학과 학사

 1998.08-2000.08 한양대학교 생명과학과 석사

 2004.03-2008.01 한국과학기술원 생명과학과 박사

 2008.02-2008.11 한국과학기술원 생명과학과 박사 후 연구원

 2008.12-2011.02 스탠포드 대학교 의과대학 박사 후 연구원

 2011.03-2015.02 한양대학교 생명과학과 조교수

 2015.03-현재 한양대학교 생명과학과 부교수